一、胚胎干细胞凋亡的研究进展（论文文献综述）
曾睿,海冰[1]（2022）在《尼古丁对干细胞的影响》文中研究说明背景:干细胞治疗具有巨大的临床应用潜力。在干细胞植入患者前,需要对干细胞来源进行传染病和遗传疾病的筛查,但是一些与生活方式相关的重要因素往往容易被忽略,尤其是吸烟。吸烟是许多疾病发生的危险因素,且随着电子烟使用的增加,尼古丁暴露越来越严重和普遍。目的:着重描述和分析体外尼古丁暴露对各类干细胞的影响。方法:检索PubMed和中国知网数据库1806-2021年间收录的相关文章,英文检索词为"nicotine,tobacco smoking,stem cells therapy,embryonic stem cells,mesenchymal stem cells,induced pluripotent stem cells,periodontal ligament-derived stem cells",中文检索词为"尼古丁,吸烟,干细胞治疗,胚胎干细胞,间充质干细胞,诱导性多能干细胞,牙周膜干细胞",按纳入和排除标准共选择文献59篇进行归纳总结。结果与结论:尼古丁激活胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导多能性干细胞和牙周膜干细胞上的神经元烟碱型乙酰胆碱受体,通过多种机制对它们的增殖、分化、迁移和凋亡过程产生影响。目前尼古丁对干细胞影响的研究虽然面临严峻的挑战,但由于"健康干细胞"是干细胞治疗的必备前提,所以有必要研究尼古丁对干细胞的影响。
李紫洪[2]（2021）在《外源化学物质对人胚胎干细胞脂肪酸代谢的影响》文中提出人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,h ESCs）具有与体细胞不同的代谢表型。葡萄糖和氨基酸代谢在h ESCs多能性中的作用已经被广泛研究,而脂肪酸（fatty acid,FA）作为一种直接或间接参与能量代谢的重要物质,在代谢中的研究甚少。因此我们选用几种和FA代谢相关的物质,对h ESCs进行长时间的干扰刺激,通过细胞的生长状态、多能性基因的表达、FA的含量变化和相关基因表达等方面进行分析,从而确定外源添加物对h ESCs脂肪酸代谢的影响。本研究选用L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和维生素B6等外源刺激物,将这些化合物分别配成1 mg/m L的浓储液,然后按照0.1%、0.5%、1%、5%、10%和30%的体积比稀释制备培养液对h ESCs进行培养,在不影响h ESCs生长的情况下,确定5%氯化钠、5%L-抗坏血酸、5%L-谷氨酰胺、10%氯化钙、10%D-葡萄糖、0.5%乙醇和1%与5%维生素B6作为细胞培养的最大浓度,收集培养15代的细胞进行多能性基因检测。实验结果显示,多能性基因OCT4在所有处理组均上调,NANOG除在乙醇、氯化钠和1%维生素B6组上调外,在其他条件下无明显变化。REX1均下调,KLF4除在氯化钠组外其余条件均下调,SOX2无明显变化。DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L也都随之发生变化。同时,应用气相色谱质谱联用仪采用外标法检测37种脂肪酸,并用RT-PCR检测相关基因的表达。结果显示,除氯化钠处理组外,其他组的总脂肪酸、饱和脂肪酸和长链脂肪酸的变化趋势基本保持不变,但所有处理组的多不饱和脂肪酸都普遍低于对照组;与此同时,乙醇处理后的h ESCs饱和脂肪酸增加,其它脂肪酸种类都降低;氯化钠处理组的总脂肪酸含量显着提高,葡萄糖处理组显着降低,而谷氨酰胺对总脂肪酸没有显着影响,但是谷氨酰胺处理组显着提高了单不饱和脂肪酸的含量,从而也证实葡萄糖抑制了h ESCs游离脂肪酸的合成。FA代谢相关的酶基因也同时发生改变,在乙醇和氯化钠处理组下,FA合成的相关基因ACLY、ACC1和FASN均上调,葡萄糖处理组显着下调,而谷氨酰胺处理组无明显变化。甘油三酯合成酶基因DGAT1和降解基因HSL只有乙醇组显着上调;FA氧化相关酶基因HADH和ACSS1均上调;FA合成转录因子基因C/EBPα、ADD1和PPARγ只有乙醇处理组上调。这些结果与FA含量的结果完全符合,再次证明葡萄糖抑制FA合成,氯化钠促进总脂肪酸的合成,谷氨酰胺对FA总体影响不大。综上所述,在外源化学物质刺激下,h ESCs的多能性与FA含量及其代谢相关的基因密不可分,具体机制还有待于深入的研究。
罗文琪[3]（2021）在《基于含硒纳米材料的构建及其治疗脊髓损伤的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景:脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）是暴力因素（坠落,车祸等）直接或间接损伤脊髓组织,导致患者感觉、运动、大小便、性功能障碍等一种严重疾病。SCI不仅严重影响患者的生活质量,也给家庭、社会和医疗保健系统带来沉重的负担。目前临床上常用的治疗方法是手术减压解除脊髓压迫,稳定脊柱生物力学力线。但是,手术减压的治疗效果与损伤程度、患者就诊时间、身体耐受程度等多种因素密切相关。另外,在脊髓损伤的急性期,脊柱外科医师常给予大剂量甲基强的松龙的冲击治疗,但是,众多研究表明大剂量甲基强的松龙冲击疗法的治疗效果并不确切,并且常伴随感染、消化道大出血、肺栓塞等并发症。因此,大剂量甲基强的松龙冲击疗法治疗SCI仍有很大局限性。所以,临床上迫切需要新的治疗SCI方法。SCI治疗效果不理想可能与其复杂的级联动态病理过程有关。这种复杂的病理过程主要包括以下四个方面,第一,外伤导致的脊髓内出血、缺血、缺氧、血栓形成;第二,血-脊髓屏障破坏后,循环系统中的中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等炎症细胞浸润至脊髓,并分泌大量促炎因子如IL-1β,TNF-α等;第三,炎症细胞（中性粒细胞、小胶质细胞、巨噬细胞等）产生大量活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）,过量ROS打破了脊髓自身的氧化还原平衡,损伤核酸、蛋白质、脂质等诱导神经元、少突胶质细胞凋亡;第四,凋亡细胞产生的大量细胞碎片募集炎症细胞浸润并分泌促炎因子,加重炎症反应使微环境进一步恶化。目前,脊髓损伤的治疗包含神经再生和神经保护两个方向。神经再生包括移植骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞等或刺激自体有潜能的干细胞再生,但SCI后恶劣的微环境不利于移植的干细胞存活或难以向神经元分化限制了以上疗法的治疗效果及临床应用。神经保护则通过抑制或中止SCI后复杂的级联动态病理过程,改善损伤微环境提高神经元、胶质细胞对损伤因素的耐受程度,促进细胞在恶劣的微环境存活、重塑,进而恢复神经功能。研究目的:随着纳米材料与临床医学的深度融合及相关领域的快速发展,纳米材料在神经保护方面的应用也得到了重视。纳米材料既有良好的生物相容性又能够有效清除ROS、抑制炎症反应,因此,利用纳米材料治疗SCI是当前的研究热点。为此,本文拟合成制备了具有清除ROS功能的硒杂化碳量子点（Selenium-Doped Carbon Quantum Dots,Se-CQDs）,旨在探讨Se-CQDs的生物相容性、抗氧化性、抑制炎症性和神经保护性。并在此基础上进一步优化,设计并制备了既能清除ROS同时具有靶向性的透明质酸-硒（Hyaluronic acid-Selenium,HA-Se）纳米粒子。旨在探讨HA-Se纳米粒子在体内外的靶向性及其对SCI的治疗效果。研究方法:（1）通过水浴加热L-硒代胱氨酸的方法制备了Se-CQDs。采用动态光散射（DLS）,透射电镜（TEM）,马尔文粒度仪对Se-CQDs大小、形态、电位进行表征。采用核磁共振氢谱（1H NMR）和碳谱(13C NMR),傅里叶变换红外线（FTIR）,x射线表面光电子能（XPS）,紫外吸收光谱,荧光光谱对Se-CQDs结构进行表征,明确合成物质结构及组成成分。同时,通过DPPH检测Se-CQDs清除自由基的效率。体外实验,首先通过MTT法验证了不同浓度Se-CQDs（6.25,12.5,25,50,100,200μg/m L）对细胞（N2a细胞、PC12细胞、星形胶质细胞）生物相容性的影响。同时,用MTT法检验了上述浓度Se-CQDs在250μM H2O2模拟的氧化应激环境对N2a细胞、星形胶质细胞的保护作用。另外,通过Elisa法探究了Se-CQDs对LPS刺激后BV2细胞炎症因子（IL-1β,IL-6,TNF-α）表达的影响。体内实验,采用标准的脊髓打击器制造大鼠脊髓挫伤模型。造模成功后脊髓损伤局部通过微量注射器原位给予盐水或不同浓度的Se-CQDs（250μg/m L,1000μg/m L）各10μL,分组情况如下:saline组,Se-CQDs（250μg/m L）组及Se-CQDs（1000μg/m L）组。于术后24h取材提取脊髓损伤处的全蛋白,进行Western Blot实验,评估Se-CQDs在体内水平对Caspase-9,Cleaved caspase-3,Bcl-2,Bax凋亡相关蛋白表达量的影响。术后5d,心脏灌注取材通过免疫荧光染色（CD68,活化的小胶质细胞）评估Se-CQDs在体内水平抑制炎症的作用。剩余SD大鼠于造模后1d,1w,2w,3w,4w,5w,6w,7w和8w通过BBB评分连续评估下肢运动功能,同时记录大鼠恢复自主排尿的时间。于造模后8周心脏灌注取材,通过膀胱H&E和Masson染色,脊髓外像、脊髓H&E和LFB染色及脊髓免疫荧光染色（CS56&GFAP,Neu N&NF200）等系统评价Se-CQDs对急性SCI及相关膀胱改变的治疗效果。（2）透明质酸（Hyaluronic Acid,HA）在水溶液中作为稳定剂通过氧化还原体系制备HA-Se纳米粒子。采用动态光散射（DLS）,马尔文粒度仪,透射电镜（TEM）,扫描电镜（SEM）对HA-Se纳米粒子的大小、电位、形貌进行表征,采用傅里叶变换红外线（FTIR）,x射线表面光电子能（XPS）对HA-Se纳米粒子的结构进行表征。同时,通过DPPH检测HA-Se纳米粒子清除自由基的效率。体外实验,首先通过MTT法验证了不同浓度HA-Se纳米粒子（3.125,6.25,12.5,25,50,100μg/m L）对PC12细胞和星形胶质细胞生物相容性的影响。同时,用MTT法检验了50和100μg/m L HA-Se纳米粒子在100μM H2O2模拟的氧化应激环境下对星形胶质细胞保护作用。另外,通过Elisa法检测了HA-Se纳米粒子对LPS刺激BV2细胞后炎症因子（IL-1β,IL-6,TNF-α）表达量的影响。体内实验,采用标准的脊髓打击器制造大鼠脊髓挫伤模型。为了探究SCI后CD44表达情况,通过Western Blot法检测脊髓损伤各组间CD44表达量,同时,术后5d取材通过免疫荧光染色共定位法探究了CD44具体为何种细胞表达。进一步,为了评估HA-Se纳米粒子在脊髓的靶向性,采用尾静脉注射NH2-CY5荧光标记的HA-Se纳米粒子进行示踪,并于动物成像系统拍照记录组织分布。为了探究HA-Se纳米粒子对凋亡的影响,术后24h取材,检测假手术组,saline组和HA-Se纳米粒子组促凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表达差异。另外,为了评估HA-Se纳米粒子抑制炎症的作用,术后5天心脏灌注后取材通过免疫荧光染色（CD68&Iba-1）评估不同浓度HA-Se纳米粒子（1mg/kg,5mg/kg,10mg/kg）在体内抑制炎症的作用。为了评估HA-Se纳米粒子治疗效果,于损伤后1d,1w,2w,3w,4w,5w,6w,7w,8w,9w,10w,11w和12w通过BBB评分连续评估下肢运动功能,通过脊髓外像、脊髓H&E和LFB染色及脊髓免疫荧光染色（Neu N&NF200）等评价HA-Se纳米粒子对急性SCI的治疗效果。研究结果:（1）制备了溶解性良好,大小均匀,半径为34.5±3.3 nm的Se-CQDs。体外实验结果表明Se-CQDs在200μg/m L浓度下对N2a细胞、PC12细胞、星形胶质细胞无明显毒性作用,并且62.5μg/m L、125μg/m L、250μg/m L、500μg/m L Se-CQDs清除DPPH效率分别为56.4%、72.1%、91%、98%。在250μM H2O2模拟氧化应激环境下,Se-CQDs有效提高了N2a细胞、星形胶质细胞、PC12细胞的存活率,并且能够抑制LPS刺激BV2产生炎症因子IL-1β和IL-6。此外,体内实验表明,相比saline组,Se-CQDs治疗组脊髓挫伤模型中脊髓空洞明显减小、神经脱髓鞘受到抑制、神经元得到保护、膀胱内膜增厚及膀胱纤维化均明显减轻。同时,促凋亡蛋白（Bax、Cleaved Caspase-3、Caspase-9）表达减少,抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加且均具有统计学意义,BBB评分及自主排尿恢复时间表明,相比saline组,Se-CQDs治疗组下肢运动功能及膀胱排尿功能得到明显改善。（2）制备了溶解性好,核壳结构,大小均匀,直径为95±2.3 nm的HA-Se纳米粒子。体外实验结果表明HA-Se纳米粒子在100μg/m L浓度下对PC12细胞、星形胶质细胞无明显毒性作用,并且250μg/m L HA-Se纳米粒子在30min、60min、90min、150 min清除DPPH效率分别为0.8%、5.9%、9.7%、14.5%,1000μg/m L HA-Se纳米粒子在30 min、60 min、90 min、150 min清除DPPH效率分别为14.6%、19.5%、25.7%、31.8%。HA-Se纳米粒子有效促进了星形胶质细胞在H2O2模拟氧化应激环境下的存活,并且能够抑制LPS刺激BV2产生炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α。此外,本研究发现SCI后大鼠脊髓损伤局部星形胶质细胞及部分小胶质细胞CD44表达增加,且体外实验证实LPS刺激星形胶质细胞24 h后能够诱导其表达CD44。体内实验证实,HA-Se纳米粒子能够特异性的与CD44结合,相比saline组,HA-Se治疗组的脊髓空洞减小、神经脱髓鞘减轻、炎症细胞浸润受到抑制,促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3表达减少,HA-Se治疗组下肢运动功能明显改善。研究结论:（1）Se-CQDs具有良好的生物相容性及高效的ROS清除能力,显着减轻了SCI氧化应激反应和炎症细胞募集浸润,明显改善了SCI后的神经功能,为治疗SCI提供了新的选择。（2）SCI后星形胶质细胞表达CD44增加,HA-Se纳米粒子通过结合星形胶质细胞表面高表达的CD44而具有良好的靶向性作用。同时,HA-Se纳米粒子本身还具备抑制炎症细胞浸润、减小脊髓空洞、保护神经元促进其存活的作用,明显改善了神经功能。这为制备靶向性纳米药物治疗SCI提供了新思路。
陈庆春[4]（2021）在《类胰酶TPSD1和糖苷酶UNG系统调控肝癌网络计算比较》文中进行了进一步梳理类胰蛋白酶δ1（tryptase delta 1,TPSD1）和尿嘧啶DNA糖苷酶（uracil DNAglycosylase,UNG）是本文从 GSE10140-10141 中相对于肝炎（HBV或HCV感染）计算筛选出的肝癌高表达分子,而且TPSD1和UNG的知识与分子网络都非常丰富,是肝癌中非常活跃的分子。本文通过整合SAM、Pearson、GRNInfer和DAVID,分别构建了肝癌（HBV或HCV感染）高表达TPSD1和UNG反馈/上/下游激活和抑制知识与分子网络。横向提出并验证TPSD1有丝分裂和神经内分泌抑制、炎症反应激活机制,UNG有丝分裂激活、先天性免疫和炎症反应抑制机制,分别通过计算含其任一分子的共同知识和亚网。纵向提出并验证TPSD1有丝分裂抑制但UNG激活、TPSD1神经内分泌和UNG先天性免疫反应抑制、TPSD1炎症反应激活但UNG抑制机制,通过计算与其相互激活不同分子的知识和共同亚网。负向验证TPSD1和UNG有丝分裂、神经内分泌和先天性免疫、炎症反应,通过提出其不同游的相同知识的机制和共同亚网。1.肝癌TPSD1有丝分裂抑制但UNG激活机制TPSD1反馈抑制BUB1B和CDC2的核有丝分裂,横向通过基因表达正调控|有丝分裂细胞周期G2/M转变| DNA复制,和纵向通过转录因子活性序列特异性DNA结合|细胞周期G1到S控制反应物,共同存在于 BUB1B、CDC2、E2F1、LAPTM4B、MCM4、MYBL2、NCAPH亚网。为了负向验证TPSD1反馈抑制核有丝分裂,提出TPSD1反馈激活转录因子活性序列特异性DNA结合诱导DNA损伤|正趋化性|核小体组装存在于共同DDX10、GML、HMGB2、PRSS1、SORT1、TNFRSF9、TP53I11亚网,比较 TPSD1反馈抑制转录因子活性序列特异性DNA结合诱导细胞周期通路存在于共同 BUB1B、CDC2、CDKN3、E2F1、LAPTM4B、MCM4、MYBL2、NCAPH 亚网。TPSD1上游抑制BIRC5和CCNA2的核有丝分裂,横向通过泛素蛋白转移酶活性|锌离子结合,和纵向通过细胞骨架结构组成|细胞增殖,共同存在于 ACTG2、CCNA2、ESM1、TUBG1、UBE2C亚网。为了负向验证TPSD1上游抑制核有丝分裂,提出TPSD1上游激活细胞增殖通过FcεRI信号通路|碳水化合物结合存在于共同CHRNA4、GDPD5、KCTD2、KLRC3、MAP2K6、MS4A2、NFKBIB、REG3A亚网,比较TPSD1上游抑制细胞增殖通过胚胎干细胞存在于共同 ACTG2、CCNA2、ESM1、GPSM2、TUBG1、UBE2C 亚网。UNG反馈激活CCNB1和TUBG1的M期,横向通过细胞缺氧反应| G2/M检查点|蛋白复合物装配| p53信号通路|细胞骨架结构组成,和纵向通过前列腺和小细胞肺癌|转录因子活性序列特异性DNA结合| DNA复制起始|病毒癌变|核染色质,共同存在于 ACTG2、BIRC5、CCNB1、E2F1、MCM4 亚网。为了负向验证UNG反馈激活M期,提出UNG上游激活DNA转录正调控诱导核有丝分裂|肝脏发育存在于共同UBE2C亚网,比较UNG反馈激活转录因子活性序列特异性DNA结合诱导成纤维细胞增殖正调节| DNA损伤应答内在凋亡信号转导通路存在于共同ACTG2、BIRC5、CCNB1、E2F1、LOX、MCM4 亚网。UNG上游激活NCAPH和NUSAP1的有丝分裂相关染色体凝聚,横向通过微管结合|聚（A）RNA结合,和纵向通过蛋白异源二聚化活性,细胞蛋白质代谢过程|细胞对DNA损伤刺激的反应|跨损伤合成,共同存在于GPSM2、HIST1H3H、NCAPH、RFC4亚网。为了负向验证UNG上游激活有丝分裂相关染色体凝聚,提出UNG反馈激活蛋白异源二聚化活性诱导蛋白质泛素化和sumo化|细胞凋亡负调控存在于共同BIRC5、E2F1亚网,比较UNG上游激活蛋白异源二聚化活性诱导凋亡过程正调控|细胞对DNA损伤刺激的反应|酶结合存在于共同GPSM2、RFC4亚网。2.肝癌TPSD1神经内分泌和UNG先天性免疫反应抑制机制TPSD1反馈抑制CDKN3和SPINK1的内分泌和中枢神经系统,横向通过没有直接相关知识,和纵向通过基因表达正调控|转录因子活性序列特异性DNA结合|细胞周期G1到S控制反应物,共同存在于 CDC2、CDKN3、E2F1、LAPTM4B、MCM4 亚网。为了负向验证TPSD1反馈抑制内分泌和中枢神经系统,提出TPSD1 下游激活内分泌和中枢神经系统通过细胞-细胞信号转导存在于共同FGF9、FOLR1、NINJ2、STX1A、TBL3、TSHB亚网。UNG反馈抑制LGALS3和NFKBIB的先天性免疫反应,横向通过细胞外基质组织|甲型流感,和纵向通过认知|突触传递|神经发生|小分子代谢过程,共同存在于CHL1、CHRNA4、FOLR1、PRSS1、TPST2亚网。为了负向验证UNG反馈抑制先天性免疫反应,提出UNG上游抑制突触传递通过钾离子运输|信号转导存在于共同ARHGDIG、EIF1AX、SSTR5亚网,比较UNG反馈抑制突触传递通过膜电位调节|分泌通路存在于共同CHL1、CHRNA4、FOLR1、KIAA0513、PRSS1、RIMS3、TPST2 亚网。UNG下游抑制HMGB2和MS4A2的先天性免疫反应,横向通过内源性刺激响应|蛋白结构域特异性结合|脂多糖反应|炎症反应,和纵向通过突触传递,共同存在于HMGB2、RNF185、TNFRSF9亚网。为了负向验证UNG下游抑制先天性免疫反应,提出UNG反馈抑制突触传递通过神经活性配体受体相互作用|分泌通路存在于共同CHL1、CHRNA4、FOLR1、KIAA0513、PRSS1、RIMS3、TPST2亚网,比较UNG下游抑制突触传递通过蛋白结构域特异性结合存在于共同HMGB2、MS4A2、RNF185、TNFRSF9亚网。3.肝癌TPSD1炎症反应激活但UNG抑制机制TPSD1反馈激活CHST1和TNFRSF9的炎症反应,横向通过多细胞体发育|脂多糖反应,和纵向通过丝氨酸内肽酶活性|轴突导向|同源蛋白质结合|蛋白质自磷酸化|胰腺分泌|血液凝固,共同存在于 CHST1、EPHA4、ISG20、LGALS3、PRSS1 亚网。为了负向验证TPSD1反馈激活炎症反应,提出TPSD1下游抑制蛋白质自磷酸化诱导锌离子结合|肝脏发育|细胞周期的M期存在于共同FOXM1、HIST1H2BJ、STMN1亚网,比较TPSD1反馈激活蛋白质自磷酸化诱导轴突导向|血液凝固|钙信号转导通路存在于共同 CHL1、CHST1、EPHA4、PRSS1 亚网。TPSD1上游激活MS4A2和REG3A的炎症反应,横向通过FcεRI信号通路|碳水化合物结合,和纵向通过toll样受体信号通路|胆碱能突触,共同存在于CHRNA4、KLRC3、MAP2K6、NFKBIB、REG3A亚网。为了负向验证TPSD1上游激活炎症反应,提出TPSD1反馈激活谷氨酸能突触通过神经冲动传递|蛋白激酶活性存在于共同CHST1、PRSS1、SSTR5亚网,比较TPSD1上游激活胆碱能突触通过钾和电压门控离子通道活性存在于共同AMELY、KCNQ3、KLRC3、MAP2K6、REG3A、RNF185、SYN2、TPST2亚网。UNG下游抑制MS4A2和TNFRSF9的炎症反应,横向通过先天性免疫反应|细胞增殖负调节,和纵向通过神经递质分泌|蛋白结构域特异性结合,共同存在于HMGB2、RNF185、TNFRSF9亚网。为了负向验证UNG下游抑制炎症反应,提出UNG下游激活轴突导向通过锌离子结合存在于共同CCNB2、DLG7、ESM1、IGF2BP3、MMP9亚网,比较UNG下游抑制神经递质分泌通过蛋白结构域特异性结合存在于共同HMGB2、MS4A2、RNF185、TNFRSF9亚网。本文首次全面系统地通过大数据计算阐述了类胰酶TPSD1调控肝癌的有丝分裂和神经内分泌抑制、炎症反应激活机制,填补了当前研究领域的空白,为早期肝癌的诊断和治疗奠定基础。糖苷酶UNG调控肝癌的有丝分裂激活、先天性免疫和炎症反应抑制机制,为肝癌理论和应用研究增加了新的内容,对晚期肝癌的诊断和治疗具有重大意义。TPSD1有丝分裂抑制但UNG激活、TPSD1神经内分泌和UNG先天性免疫反应抑制、TPSD1炎症反应激活但UNG抑制的新系统比较研究为肝癌的诊断和治疗提供了重要的理论基础和应用价值。
李学亮[5]（2021）在《组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究》文中认为精子发生过程包括三个阶段,即精原干细胞的自我更新与分化、精母细胞的减数分裂和单倍体圆形精细胞的变形。这一过程受到基因表达的精密调控。条件性敲除胚胎期生殖细胞内的H3K9me2去甲基化酶基因Jmjd1a和Jmjd1b导致基因表达紊乱和精子发生受损。因此,探究组蛋白甲基化修饰对精原干细胞增殖与分化的调控作用机制,对于雄性不育的诊治具有一定的指导意义。组蛋白甲基转移酶SETDB1能够催化组蛋白H3K9甲基化,在干细胞多能性维持,神经细胞分化等过程中发挥重要作用。然而,SETDB1调控精原干细胞增殖与分化的确切机制仍不清楚。因此,本研究利用细胞免疫荧光,染色质免疫共沉淀,RNA-seq,ATAC-seq和Ch IP-seq等方法探究SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用机制。主要结果如下:（1）Ed U和细胞流式检测结果显示Setdb1-KD导致小鼠精原干细胞增殖速率降低,细胞周期阻滞在S期。细胞免疫荧光与TUNEL检测结果表明,Setdb1敲低诱导细胞DNA断裂和凋亡水平升高。这表明Setdb1-KD阻碍了精原干细胞增殖,导致细胞凋亡。（2）Setdb1-KD导致精原干细胞NADPH氧化酶4（NOX4）及其配体P22PHOX表达量上升,活性氧水平升高。挽救试验发现,相对于Setdb1敲低组,Setdb1和Nox4同时敲低组的细胞内活性氧含量较低,细胞凋亡增加和增殖速率减慢的表型得到部分挽救。此外,使用活性氧清除剂褪黑色素直接清除细胞内的活性氧,也可以在一定程度上抑制Setdb1-KD诱导的细胞凋亡。这表明NOX4上调介导的活性氧水平升高参与到Setdb1敲低诱导的细胞凋亡和增殖速率减慢。（3）Setdb1-KD导致细胞内p-P38和p-JNK水平升高、FOXO4活化,这表明Setdb1-KD激活了细胞内活性氧下游p38/JNK-FOXO4信号通路。（4）SETDB1-Ch IP-qPCR和H3K9me3-Ch IP-qPCR结果显示,Nox4基因启动子区域几乎没有SETDB1和H3K9me3的富集,说明SETDB1对Nox4的调控不是直接的,有可能是由于Setdb1-KD导致Nox4基因临近处的转座子激活,从而使得NOX4表达量升高。（5）在小鼠精原细胞内,Ythdf2-KO导致SETDB1与H3K9me3修饰水平降低。蛋白质免疫共沉淀结果表明,SETDB1与γH2AX之间相互作用。当发生DNA损伤时,Setdb1-sh RNA介导的Setdb1-KD导致精原细胞的克隆形成能力降低,细胞凋亡增加,γH2AX阳性细胞数增加。同时,当发生DNA损伤时,Ythdf2-KO的精原细胞出现了与Setdb1-KD类似的表型。而且体内试验结果发现,当用DNA损伤药物etoposide诱导发生DNA损伤时,Ythdf2 c KO小鼠(Stra8-Cre,Ythdf2loxp/loxp)睾丸组织平均每个曲细精管内的γH2AX阳性细胞数和c PARP阳性细胞数均高于对照组。这表明在小鼠精原细胞,YTHDF2能够调控Setdb1的表达,且它们均参与DNA损伤应答反应。（6）挽救试验发现,当发生DNA损伤时,在Ythdf2-KO的精原细胞过表达Setdb1,部分挽救了Ythdf2-KO介导的细胞克隆形成能力降低的表型。此外,RNA-seq分析表明,在DNA损伤条件下,SETDB1过表达使得Ythdf2-KO组中部分促凋亡基因转录水平降低。这表明Ythdf2-KO诱导的精原细胞DNA损伤敏感性增加部分是由于SETDB1下调导致的。（7）借助流式细胞术和STA-PUT分选猪精原干细胞和分化精原细胞,结合ATAC-seq,Ch IP-seq和RNA-seq解析猪精原干细胞分化过程中SETDB1,H3K9me3修饰以及染色质可及性变化。RNA-seq分析结果表明,精原干细胞分化过程中有684个基因表达上调,702个基因表达下调。而且,在分化过程中,促分化相关基因c-Kit启动子处的SETDB1和H3K9me3修饰富集水平降低,染色质可及性升高。因此,推测SETDB1可能通过H3K9me3修饰调控促分化相关基因表达,从而调控精原干细胞分化。综上所述,本研究发现SETDB1通过调控NADPH氧化酶NOX4的表达和细胞内的活性氧水平,调控小鼠精原干细胞的存活;Ythdf2-KO导致SETDB1下调,从而诱导DNA损伤敏感性增加;SETDB1通过H3K9me3修饰调控猪精原干细胞分化过程中染色质可及性,引起分化相关基因表达变化,从而调控精原干细胞的分化。本研究为组蛋白甲基化修饰对雄性精子发生的调控机制提供理论参考。
张云峰[6]（2021）在《促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究》文中研究说明绵羊是一种非常重要的家养动物,利用基因修饰手段来改良或育种是一个方向。目前利用转基因技术进行分子育种,存在较难控制外源基因与效率较低等问题。基于小鼠胚胎干细胞（ESC）的基因打靶技术能进行精确有效的敲入或敲出。由于绵羊ESC很难分离获得,利用同样具有多能性的诱导多能干细胞（iPSC）代替ESC进行精确遗传工程操作成为目前急需解决的问题。目前绵羊的iPSC存在诱导效率低,难以获得完全重编程的iPSC的问题。microRNA是基因表达转录后的调节器,研究证明ESC特异性的miRNAs能促进体细胞重编程。因此,筛选能促绵羊体细胞重编程的miRNAs,并探讨其重编程机制,有望建立一种高效获得绵羊iPSC的体系,对优质绵羊培育具有应用价值,也为获得绵羊ESC奠定基础。生殖细胞是唯一将基因组和表观遗传信息传递给下一代的细胞谱系,但在体外重建生殖细胞发育一直是生物学研究的挑战。随着小鼠多能干细胞在体外可以分化为原始生殖细胞样细胞（PGCLC）,进而发育为卵母细胞并能进行生殖系传代,为绵羊多能干细胞在体外生产PGC提供了理论依据和方法。研究绵羊iPSC定向分化为雌性PGCLC,为绵羊PGC的发育研究可以提供一种细胞模型,为后期分化为功能卵子奠定了基础,对提高绵羊优质配子利用,加快畜群的改良速度具有重要的应用价值。目的:（1）筛选出能促进绵羊体细胞重编程的microRNA;（2）初步探索microRNA在绵羊体细胞重编程过程中的机制;（3）建立一种利用绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞的方法。方法:（1）组织块法分离培养妊娠45d左右的绵羊胎儿肾细胞（SKC）,作为重编程的起始细胞;胰酶消化法分离CF-1小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）,丝裂霉素C处理后,作为诱导绵羊iPSC的饲养层细胞。（2）结合文献报道和数据库综合分析在小鼠和人干细胞中高表达或可促进重编程的miRNAs,筛选出可能促绵羊体细胞重编程的miR302/367簇、miR200b-200a-429簇、miR200c-141簇,并包装慢病毒;同时将Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28、SV40T、h TERT等八种人源转录因子包装慢病毒;利用不同慢病毒感染SKC进行诱导重编程,通过碱性磷酸酶（AP）染色统计诱导效率,筛选出可促进绵羊体细胞重编程的最优miRNA;并对获得的绵羊iPSC从AP染色、实时定量PCR、细胞免疫荧光、核型分析、甲基化测序分析、拟胚体分化这几个方面进行鉴定。（3）利用miRbase和Target Scan等生物信息平台预测miR-200c靶基因,并送公司合成oar-miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照;设计引物,克隆靶基因结合位点的3’UTR区及突变3’UTR,构建ZEB1和TWISTNB靶基因的双荧光素酶报告分析载体。（4）通过oar-miR-200c mimics转染细胞,利用荧光素酶报告载体分析与靶基因的作用;利用qRT-PCR检测靶基因的转录水平;利用Western blot检测靶基因的蛋白水平;探讨oar-miR-200c在绵羊体细胞重编程过程的作用机制。（5）设计引物,扩增克隆绵羊生殖相关基因DAZL和BOULE,并构建慢病毒载体PLVX-Dazl和PLVX-Boule,并进行包装慢病毒。（6）组织块法分离培养原代绵羊卵巢细胞;DAZL和BOULE慢病毒感染绵羊iPSC,建立转基因绵羊iPSC;通过摸索培养体系和条件,利用绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞;利用qRT-PCR检测绵羊生殖细胞特异因子的转录水平,利用Western blotting检测生殖细胞特异因子的蛋白水平。结果:（1）成功分离绵羊体细胞SKC,其表达角蛋白CK18;成功分离小鼠CF-1MEF细胞,并制备饲养层细胞,能很好的支持siPSC生长。（2）筛选的三个miRNA簇,成功包装miRNA慢病毒;成功包装8种转录因子的慢病毒;慢病毒感染绵羊SKC后,通过诱导效率比较分析,筛选出miR-200c-141簇可将重编程效率提高到0.95%;获得的绵羊iPSC经鉴定呈阳性;（3）成功构建miR-200c靶基因ZEB1和TWISTNB的双荧光素酶报告载体;（4）双荧光素酶报告分析,oar-miR-200c靶向ZEB1和TWISTNB的3’UTR;qRT-PCR和Western blotting检测oar-miR-200c可显着降低ZEB1和TWISTNB基因的表达,但可增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率;（5）成功构建绵羊生殖相关基因慢病毒载体LVX-Dazl-F2A-mcherry-IRES-NEO和PLVX-Boule-F2A-mcherry-IRES-NEO,并成功包装慢病毒;（6）成功建立稳转Dazl和Boule基因的绵羊iPSC,在培养液中添加Activin A、bFGF、BMP4、LIF、EGF等因子及卵巢细胞培养上清,可使绵羊iPSC分化为PGC样细胞,分化第八天可表达生殖相关标记蛋白PRDM1、PRDM14和VASA,其基因Dazl、Boule、Prdm14和Vasa的mRNA转录呈高水平状态。结论:（1）成功筛选出miR-200c-141可以促进绵羊体细胞重编程为iPSC;（2）oar-miR-200c靶向Zeb1和Twist NB基因的3’UTR,显着降低Zeb1和Twist NB表达水平,增加E-cadherin的表达;oar-miR-200c通过对TGF-β信号通路的影响,提高MET转化,从而提高绵羊体细胞重编程效率。（3）利用生殖系相关基因DAZL和BOULE的慢病毒感染绵羊iPSC,在添加activin A、b FGF、BMP4、LIF、EGF等因子的条件下,可以将绵羊iPSC诱导分化为原始生殖样细胞。
蔡泽坡[7]（2021）在《c-Jun在人胚胎干细胞多能性维持与退出中的研究》文中认为多能干细胞具有自我更新和向三胚层细胞分化的潜能,是细胞命运调控机理研究的理想细胞模型,在再生治疗方面具有广阔应用前景。然而,在实际应用到临床上时仍存在很多问题,主要原因包括对多能干细胞在命运决定过程中的机理研究还不够透彻,多能性维持与退出调控机制仍未清楚。本实验室前期研究结果表明c-Jun通过调控Ss18形成相变等途径显着影响小鼠胚胎干细胞多能性维持与退出,同时作为核心多能性基因Oct4的“平行镜面因子”拮抗多能性获得,并提出了体细胞与多能干细胞的界面假说。然而,c-Jun在人胚胎干细胞命运决定过程中所起的作用还知之甚少,与小鼠体系存在哪些异同点仍不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建c-Jun敲除的人胚胎干细胞系,结合形态特征、检测多能性基因表达与畸胎瘤形成等实验判断,发现c-Jun敲除对人胚胎干细胞多能性维持和三胚层分化早期阶段没有显着影响。为了进一步确定c-Jun在人胚胎干细胞多能性退出及其向三胚层后期终末谱系功能细胞分化过程中的功能调控作用,本研究分别通过人胚胎干细胞定向分化至心肌细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、神经细胞、体节前体细胞、定型内胚层细胞,发现c-Jun敲除显着抑制人胚胎干细胞向心肌细胞分化,但促进向肝脏细胞分化,这与已报道的c-Jun敲除小鼠抑制肝细胞分化、对心肌细胞分化无影响的表型不同。另外,c-Jun敲除对人胚胎干细胞向定型内胚层细胞、体节前体细胞、肾脏细胞以及神经细胞分化没有显着影响,这与已报道的c-Jun敲除小鼠对这些细胞发育分化没有影响的表型一致。本研究对c-Jun在人胚胎干细胞多能性维持与退出中所起的作用进行了初步研究,为进一步探索多能干细胞命运决定以及比较研究c-Jun在不同物种的谱系功能细胞命运调控中的作用机制奠定理论基础,对未来多能干细胞更加安全有效应用于临床研究与疾病治疗具有重要的理论指导意义。
袁方[8]（2021）在《骨化三醇促进肝样细胞成熟及缓解酒精性肝细胞损伤的机制研究》文中认为骨化三醇（Calcitriol,1,25-dihydroxyvitamin D3）是维生素 D（VD）经过体内代谢后产生的生物活性最强的分子,该活化过程包括在肝脏和肾脏进行的两次羟基化修饰。骨化三醇的主要生理功能是促进肠道钙磷吸收、调节钙磷稳态及维持骨骼的健康生长。近些年来越来越多的研究发现,骨化三醇还广泛参与细胞增殖和分化、炎性免疫反应以及纤维化等生理和病理过程的调控。维生素D缺乏在世界范围内是一种非常普遍的现象,也逐渐引起人们的关注和重视。VD缺乏与各种骨骼和非骨骼等慢性疾病密切相关。已有报道VD缺乏在非酒精性和酒精性脂肪肝、肝炎和肝纤维化等肝脏疾病中广泛存在。越来越多的临床及基础研究也显示,低水平的VD与肝病患者的肝损伤程度呈正相关,补充VD可以改善慢性丙型肝炎的持续病毒学应答、抑制肝星状细胞激活以及缓解肝毒素诱导的大鼠肝硬化进展。鉴于骨化三醇和肝脏的密切关系和具有调控多种细胞分化的功能,本课题主要探讨骨化三醇对人多能干细胞来源的肝样细胞分化的调控和对酒精诱导的肝细胞损伤的保护作用及机制。人多能干细胞（hPSCs）分化来源的人肝细胞样细胞（HLCs）是药物毒性检测和再生医学很有前途的细胞来源。然而,目前HLCs的功能明显低于原代人肝细胞。在本课题的第一部分,我们在肝分化的过程中添加骨化三醇,探讨其对HLCs成熟基因的表达及功能成熟的影响。结果显示骨化三醇促进了人胚胎干细胞和人诱导性多能干细胞来源的HLCs的成熟相关基因的表达和P450系统解毒酶的活性、尿素生成及白蛋白分泌方面的功能。此外,骨化三醇还增加了线粒体呼吸酶复合物亚基的蛋白表达水平,增强了 HLCs的线粒体呼吸功能。进一步分析表明,骨化三醇诱导了线粒体生物发生调节因子的表达及线粒体自噬,进而调控线粒体功能。在VD受体（VDR）敲除的细胞株中,骨化三醇的这些作用消失,说明骨化三醇对HLCs功能成熟和线粒体功能的促进作用依赖于 VDR。过量酒精摄入会造成肝细胞损伤导致酒精性肝病的发生。近些年来,酒精导致的肝细胞损伤的机制研究已经取得了很多进展,然而,减少或挽救酒精所致肝细胞损伤的预防性干预手段仍然有限。我们发现在HLCs中骨化三醇对乙醇导致的肝细胞损伤有显着的保护作用,但并不影响乙醇代谢酶ADH1和CYP2E1的蛋白表达水平。因此,骨化三醇缓解酒精所致肝损伤的机制值得进一步探讨。在本课题的第二部分,我们先用骨化三醇预处理肝细胞再进行乙醇刺激。结果表明,骨化三醇预处理能显着提高肝细胞活力,降低细胞凋亡和氧化应激,并且减轻乙醇诱导的线粒体形态和膜电位异常。值得注意的是,骨化三醇显着增强了乙醇诱导的肝细胞自噬,表现为自噬小体和自噬溶酶体数量的增加,自噬标志蛋白LC3B-II和ATG5水平的上调以及促进自噬受体p62的降解。进一步研究发现,骨化三醇预处理增加了 GFP-LC3标记的自噬体与线粒体的共定位,提示骨化三醇有效地促进了乙醇诱导的线粒体自噬。此外,抑制自噬则减弱了骨化三醇的保护作用。对自噬相关调控通路的研究发现,骨化三醇通过AMPK/mTOR信号通路促进自噬作用,并且AMPK/mTOR信号通路的激活作用依赖于VDR。总之,骨化三醇通过激活AMPK/mTOR信号通路增强肝细胞自噬缓解了乙醇诱导的肝细胞损伤。综上所述,我们发现骨化三醇促进肝样细胞的功能成熟,为体外获得干细胞来源的成熟肝细胞提供了一种经济有效的方法。骨化三醇缓解乙醇诱导的肝细胞损伤的保护作用及其分子机制的阐述,为预防酒精性肝细胞损伤提供了新的策略和干预手段。
于海滨[9]（2020）在《线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响》文中研究说明随着畜牧业的快速发展和人类生活水平的提高,消费者对牛乳品质的需求也逐渐增加,对乳品质的要求也越来越高。牛乳品质性状是复杂经济性状,多基因共同调控其表型变化。随着后基因组学时代的到来,筛查与挖掘奶牛乳脂性状相关且具有重大遗传效应的候选功能基因,成为当前奶牛遗传育种科研工作者的主要挑战。甘油-3-磷酸酰基转移酶线粒体（GPAM）基因,属于GPAT基因家族,该基因定位在牛第26q22号染色体上。有研究表明,GPAM基因催化磷脂和甘油三酯（TG）生物合成的第一步反应。基于课题组前期组学分析结果,GPAM基因可能对牛乳脂代谢具有重要影响。本研究以GPAM为候选基因,在敲除细胞水平验证目的基因与牛脂质代谢的功能,同时在模式动物的基础上,解析GPAM基因对乳脂代谢的调控作用机制。利用CRISPR-Cas9技术,以牛乳腺上皮细胞为研究对象,构建GPAM基因敲除细胞系,同时利用本课题组前期构建的GPAM基因过表达和干扰载体,分别检测目的基因过表达、干扰和敲除后,基因m RNA和蛋白水平的表达情况,检测细胞内甘油三酯、胆固醇和脂肪酸含量,并利用RT-q PCR和Western-blot技术,在m RNA和蛋白水平上验证GPAM基因对牛乳脂代谢相关基因的调控作用。研究结果表明:目的基因敲除后,细胞内GPAM在m RNA和蛋白水平的表达均降低;GPAM基因敲除细胞系内的甘油三酯和胆固醇的含量相对于野生型细胞均显着降低;细胞内脂肪酸含量检测结果显示:GPAM基因过表达能够降低细胞内丁酸的含量,沉默GPAM基因能够促进细胞内丁酸和辛酸含量显着升高;GPAM基因敲除能够促进辛酸的含量增加;乳脂代谢相关基因表达量的检测结果显示:敲除GPAM基因能够降低细胞内脂代谢相关基因ACSL5、FABP3、HSL、PRSS2、AGPAT4的表达,进而调控乳脂代谢通路。GPAM基因转录组测序共获得360个上调基因和570个下调基因;差异基因中的352个基因共富集在3196个GO terms,其中613个GO terms显着富集,包括402个生物过程的GO terms,72个细胞成分GO terms和139个分子功能GO terms;差异表达基因中共富集237个Pathway,其中139个Pathway显着富集（P<0.05）,下调基因富集在78个通路中,上调基因富集在61个通路中。GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析结果表明,GPAM敲除后在对糖代谢信号通路的作用,主要是通过影响丙酸（PATH:00640）和丙酮酸（PATH:00620）代谢通路,使其表达水平上调,提示GPAM基因可能对丙酸和丙酮酸起调控作用,从而对细胞内糖酵解产生一定的影响。同时在转录组测序结果中也发现GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。根据转录组的数据分析结果表明;GPAM基因与细胞ATP应答和质子转运ATP酶活性的调节有关,提示该基因可能参与细胞线粒体能量代谢和ATP供能。转录组数据分析发现,GPAM基因参与丙酸、丙酮酸代谢进程,该基因敲除后细胞内丙酸、丙酮酸代谢发生了变化,预测可能对线粒体能量代谢和糖酵解产生影响。同时,GPAM基因作为一种线粒体基因,研究其表达对细胞线粒体功能的影响具有重要意义,根据以上推断我们展开了敲除细胞内线粒体能量代谢的研究。以牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系为研究对象,研究GPAM基因敲除后细胞中线粒体数量、线粒体呼吸能力、线粒体糖酵解速率、细胞对ATP需求的变化。线粒体能量代谢实验结果表明:在GPAM基因敲除细胞系中,细胞内线粒体呼吸能力降低。同时,GPAM敲除后导致线粒体糖酵解所需的重要调节酶活性降低,从而最终导致细胞线粒体糖酵解过程受到显着抑制。同时影响了细胞内Na+/K+的转运;敲除GPAM基因后细胞内线粒体含量减少。实验表明,敲除细胞中GPAM含量的降低导致了细胞线粒体氧化磷酸化和三羧酸循环过程受到显着抑制。以上这些结果都说明,GPAM的敲除能够影响乳腺上皮细胞的线粒体能量代谢。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,建立GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上验证基因表达调控作用。结果表明:GPAM基因敲除小鼠的生长、发育和繁殖无明显的变化。血清学检测结果发现:GPAM基因敲除小鼠的血清中甘油三酯含量显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）,而血清中胆固醇的含量变化并不显着;组织中甘油三酯和胆固醇的检测结果发现:敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织中甘油三酯、胆固醇的含量均显着低于对照组野生型小鼠（p<0.05）;小鼠乳汁甘油三酯酶联免疫吸附实验结果显示:与野生鼠相比,GPAM基因敲除小鼠乳汁中的甘油三酯含量明显降低（p<0.05）;组织形态学观察表明,敲除小鼠脂肪组织中脂肪细胞的胞体直径略小于野生型小鼠,肌间脂肪含量明显少于与野生型小鼠,乳腺组织中野生型小鼠的脂肪细胞的直径略大于敲除型小鼠,其他组织无明显形态学变化;乳腺组织的脂肪酸含量检测结果显示:敲除小鼠乳腺组织中肉豆蔻酸、棕榈硬脂酸、花生四烯酸盐和亚麻酸盐上显着高于野生型小鼠。本研究在前期转录组学分析的基础上,以GPAM为候选基因,在敲除细胞系水平上验证GPAM基因对细胞内脂肪酸、甘油三酯、胆固醇含量的影响,并对GPAM基因敲除细胞系进行转录组分析,解析该基因敲除后对乳脂代谢相关基因的分子机制;同时检测了敲除GPAM基因乳腺上皮细胞内线粒体活性及能量代谢改变情况,阐明GPAM基因是参与线粒体能量代谢的重要基因,并对糖酵解产生影响;构建了GPAM基因敲除小鼠模型,在模式动物水平上进一步验证GPAM基因对乳脂代谢的调控作用。为奶牛乳脂性状的改良和新品种的培育提供优质的基因资源和理论基础。
祝振硕[10]（2020）在《OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制》文中研究表明猪既是一种在我国畜牧业生产中占有极大比重的重要经济动物,同时还是生物医学中常用的理想医学模型。然而猪多能干细胞（pluripotent stem cells,PSCs）的建系仍未完全成功,并且对其多能调控机制的了解尚不清楚。因此,深入研究猪多能干细胞的多能调控机制,将为猪多能干细胞的建系提供理论基础。H3K9甲基化修饰是重要的表观抑制标记,在小鼠上的研究表明其是重编程过程中重要的表观障碍。而组蛋白去甲基化酶KDM3A和KDM3B可通过羟基化作用去除H3K9me1/2来维持干细胞的自我更新能力。因此,研究两者在猪多能干细胞中的功能机制,将更深入了解H3K9甲基化对多能干细胞的调控方式,并有利于解决当前猪内源多能调控网络激活不完全的问题。在本研究中,我们以实验室已建立的以药物介导的外源基因表达的猪诱导性多能干细胞为实验材料,分析了H3K9甲基化修饰状态转换对其自我更新能力的影响,并揭示了以KDM3A/KDM3B/OCT4/SOX2为核心的H3K9去甲基化调控机制。实验结果如下:1.全基因组水平的H3K9的低甲基化状态对于猪i PSCs多能性的维持至关重要。本研究以DOX-i PSCs为研究对象,通过撤去DOX及LIF、b FGF、CHIR99021、SB431542,使i PSCs逐渐丧失多能态。研究发现猪i PSCs在该培养条件下,逐步丧失克隆形态且AP染色呈现阴性。外源多能基因已完全沉默,且内源多能基因OCT4、SOX2、LIN28A、NANOG表达量显着下调。此外,在这一分化进程中细胞整体的H3K9me1/2/3水平显着升高,而H3K4 me1/2/3的整体水平显着下降。这些结果表明H3K9甲基化修饰与猪多能干细胞多能性维持紧密相关。2.饲养层细胞与外源多能基因协同维持i PSCs整体H3K9低甲基化状态。我们进行了一系列的体系筛选,结果表明当撤去饲养层细胞（Feeder free,F-）时,i PSCs整体H3K9甲基化水平升高。进一步分析显示在无饲养层体系下,不添加DOX（Feeder and DOX free,FD-）会使i PSCs的H3K9甲基化水平进一步升高。此外,核心多能基因（OCT4/SOX2）整体蛋白水平也显着下降,同时细胞表达外胚层与中胚层的分化标记。EDU染色试验与Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测表明,细胞增殖能力快速下降且出现凋亡现象。转录组测序分析表明Feeder通过促进SOX家族的基因转录来维持猪i PSCs多能性。以上结果表明Feeder可能通过降低猪i PSCs中多能性相关基因区域的H3K9甲基化修饰,进而激活多能基因的表达,维持多能性。并且由DOX所控制的核心转录因子也可能参与了这一调控过程。3.猪i PSCs多能性丧失过程中,H3K9甲基化阻碍关键多能转录因子与其下游靶基因的互作。对正常培养的与FD-处理下的DOX-i PSCs进行H3K9me2/3的Ch IP-seq分析,结果表明整体H3K9甲基化丰度在FD-处理中显着升高。进一步Motif分析显示在FD-特异的H3K9me2区域富集出OCT4、SOX2、ESRRB等多能转录因子的结合模序,而正常培养条件下特异的甲基化区域富集出c-Jun、ATY13等体细胞特异基因结合模序。进一步将Ch IP数据与转录组测序数据联合分析显示,H3K9甲基化不但参与了分化进程中多能基因的沉默进程,同时在多能态下,也参与了体细胞相关基因的沉默。这些试验结果表明核心多能转录因子激活下游基因进程中,多能性相关基因区域的H3K9去甲基化是必要的。4.组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/KDM3B与核心转录因子OCT4/SOX2形成转录驱动复合物维持干细胞多能态。我们在DOX-i PSCs中进行了KDM3A与KDM3B的干扰试验,结果表明两者在H3K9去甲基化作用上存在功能互补现象,只有同时下调两者表达,猪i PSCs的H3K9me2/me3水平才会显着上升,细胞增殖也受到严重抑制并发生凋亡现象,AP染色呈现阴性。此外,过表达试验显示两者均可以显着降低细胞整体的H3K9甲基化水平,但两者之间存在一些表型差异。过表达KDM3A有效的提升了细胞的增殖与抗凋亡能力并促进了多能相关基因的表达,但过表达KDM3B却轻微抑制了细胞的增殖能力且对多能性无显着影响。为进一步解析多能转录因子与H3K9去甲基化作用的关系,我们首先通过单因子回补试验证明了DOX-i PSCs的维持主要依赖于OCT4与SOX2的足量表达。Ch IP-seq分析显示两者共同作用于基因间区与内含子区域的增强子激活多能性相关基因与通路维持多能态,但OCT4/SOX2并未直接调控KDM3A与KDM3B的表达。将H3K9me2/3与OCT4/SOX2的Ch IP-seq进行联合分析,发现在FD-处理后大约20%的OCT4/SOX2的结合区域发生了H3K9me2。对KDM3A与KDM3B使用免疫共沉淀联用质谱分析技术（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry,IP-MS）来鉴定并分析两者的关联蛋白。结果表明两者之间存在直接的相互作用,进一步分析发现KDM3A与KDM3B的互作蛋白分别包含有SOX2与OCT4,且富集出大量染色质重塑蛋白,如HMG家族的HMGB2、HMGA1等。这些证据表明OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合物形成一个转录驱动复合物定向激活多能相关基因的表达。综上所述,本研究揭示了以KDM3A和KDM3B为核心的H3K9去甲基化作用在多能性维持中的重要作用,发现了组蛋白去甲基化酶通过形成蛋白复合体的形式来发挥转录激活作用。此外,我们还证明了组蛋白去甲基化的定向作用是通过与多能性转录因子的结合来实现的,这一转录激活机制不仅为猪多能干细胞的建系工作提供了理论基础,而且丰富了人类对于表观遗传激活机制领域的理解。
二、胚胎干细胞凋亡的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胚胎干细胞凋亡的研究进展（论文提纲范文）
（2）外源化学物质对人胚胎干细胞脂肪酸代谢的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 一、文献综述 脂肪酸对细胞生命活动和干细胞影响的研究进展 |
| 引言 |
| 1.1 脂肪酸的合成及与相关疾病的关系 |
| 1.1.1 脂肪酸的合成 |
| 1.1.2 脂肪酸相关的信号通路 |
| 1.1.3 脂肪酸与肿瘤 |
| 1.1.4 脂肪酸控制骨骼干细胞再生 |
| 1.1.5 脂肪酸与糖尿病 |
| 1.2 外源脂质对多能干细胞的影响 |
| 1.3 外源物质对多能干细胞脂肪酸的影响 |
| 1.3.1 葡萄糖对多能干细胞脂肪酸的影响 |
| 1.3.2 乙醇对多能干细胞脂肪酸的影响 |
| 1.3.3 谷氨酰胺对多能干细胞脂肪酸的影响 |
| 1.3.4 氯化钠对多能干细胞脂肪酸的影响 |
| 1.4 小结 |
| 二、实验部分 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 人胚胎干细胞的培养 |
| 2.3.2 人胚胎干细胞脂肪酸的提取与衍生 |
| 2.3.3 气相色谱质谱联用方法分析 |
| 2.3.4 碱性磷酸酶染色 |
| 2.3.5 RNA的提取和反转录 |
| 2.3.6 实时定量PCR |
| 2.3.7 免疫荧光染色 |
| 2.3.8 数据统计与分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 外源化学物质对人胚胎干细胞多能性基因的影响 |
| 2.4.2 细胞中游离脂肪酸标准品在仪器中的检测 |
| 2.4.3 外源化学物质影响人胚胎干细胞脂肪酸的组成 |
| 2.4.4 乙醇和氯化钠促进人胚胎干细胞脂肪酸的合成 |
| 2.4.5 葡萄糖和谷氨酰胺影响着人胚胎干细胞脂肪酸的代谢 |
| 2.4.6 水溶性维生素对人胚胎干细胞的作用 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 外源化学物质影响细胞形态、多能性和脂肪酸的含量 |
| 2.5.2 乙醇增加的脂肪酸主要用于形成甘油三酯 |
| 2.5.3 氯化钠激活脂肪酸的生物合成途径 |
| 2.5.4 葡萄糖和谷氨酰胺以氧化脂肪酸的形式促进细胞生长 |
| 2.6 小结 |
| 附页 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）基于含硒纳米材料的构建及其治疗脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 SCI治疗的研究进展 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 SCI的病理生理特征 |
| 2.3 SCI的治疗策略 |
| 2.3.1 药物治疗 |
| 2.3.2 手术治疗 |
| 2.3.3 生物材料治疗 |
| 2.3.4 电刺激治疗 |
| 2.3.5 细胞移植治疗 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 硒-碳量子点(Se-CQDs)构建及其治疗SCI的实验研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.3 实验细胞和动物 |
| 3.3.1 实验细胞及细胞培养 |
| 3.3.2 实验动物 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 Se-CQDs的制备 |
| 3.4.2 Se-CQDs表征 |
| 3.4.3 Se-CQDs清除氧自由基 |
| 3.4.4 Se-CQDs的生物相容性 |
| 3.4.5 体外H_2O_2诱导的细胞毒性及其对氧化应激的保护作用.. |
| 3.4.6 Se-CQDs抑制炎症的体外实验 |
| 3.4.7 SCI挫伤动物模型制备 |
| 3.4.8 行为学分析 |
| 3.4.9 SCI H&E、LFB和免疫荧光染色的脊髓组织获取 |
| 3.4.10 H&E染色实验方法 |
| 3.4.11 Luxol fast blue(LFB)染色实验方法 |
| 3.4.12 脊髓髓鞘微观结构 |
| 3.4.13 脊髓组织免疫荧光染色 |
| 3.4.14 Se-CQDs对体内继发性损伤的抗凋亡作用 |
| 3.4.15 统计分析 |
| 3.5 结果 |
| 3.5.1 Se-CQDs制备与表征 |
| 3.5.2 Se-CQDs的生物相容性 |
| 3.5.3 Se-CQDs在H_2O_2模拟的氧化应激环境下对细胞的保护作用 |
| 3.5.4 Se-CQDs对LPS诱导BV2细胞表达促炎因子的影响 |
| 3.5.5 Se-CQDs对SCI大鼠模型的治疗作用 |
| 3.5.6 不同治疗组对脊髓组织形态学的影响 |
| 3.5.7 不同治疗组脊髓组织神经元及轴突的保护性作用 |
| 3.5.8 Se-CQDs在体内的抗炎作用及减少胶质瘢痕能力。 |
| 3.5.9 Se-CQDs在体内的抗细胞凋亡能力。 |
| 3.6 讨论 |
| 3.6.1 生物材料通过清除ROS治疗SCI |
| 3.6.2 清除ROS有助于促进SCI功能恢复 |
| 3.7 本章小结 |
| 第四章 透明质酸-硒(Hyaluronic Acid-Selenium,HA-Se)纳米粒子构建及其治疗SCI的实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.3 实验细胞和动物 |
| 4.3.1 实验细胞及细胞培养 |
| 4.3.2 实验动物 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 HA-Se纳米粒子的制备 |
| 4.4.2 HA-Se纳米粒子表征 |
| 4.4.3 HA-Se纳米粒子清除氧自由基 |
| 4.4.4 HA-Se纳米粒子的生物相容性 |
| 4.4.5 体外H_2O_2诱导的细胞毒性及其对氧化应激的保护作用.. |
| 4.4.6 HA-Se纳米粒子抑制炎症的体外实验 |
| 4.4.7 创伤性SCI挫伤动物模型制备 |
| 4.4.8 行为学分析 |
| 4.4.9 SCI后H&E、LFB和免疫荧光染色的脊髓组织获取 |
| 4.4.10 H&E染色实验方法 |
| 4.4.11 Luxol fast blue(LFB)染色实验方法 |
| 4.4.12 脊髓髓鞘微观结构 |
| 4.4.13 脊髓组织免疫荧光染色 |
| 4.4.14 HA-Se纳米粒子对体内继发性损伤的抗凋亡作用 |
| 4.4.15 统计分析 |
| 4.5 结果 |
| 4.5.1 HA-Se纳米粒子制备与表征 |
| 4.5.2 HA-Se纳米粒子的生物相容性 |
| 4.5.3 HA-Se纳米粒子在H_2O_2模拟的氧化应激环境下对细胞的保护 |
| 4.5.4 HA-Se纳米粒子抑制炎症的作用 |
| 4.5.6 SCI后CD44 表达 |
| 4.5.7 星形胶质细胞对HA-Se纳米粒子的内吞 |
| 4.5.8 HA-Se纳米粒子体内分布 |
| 4.5.9 HA-Se纳米粒子疗效分析 |
| 4.5.10 HA-Se纳米粒子体内抑制炎症的作用 |
| 4.5.11 HA-Se纳米粒子体内抗凋亡的作用 |
| 4.5.12 HA-Se纳米粒子体内安全性评价 |
| 4.6 讨论 |
| 4.6.1 靶向性纳米粒子治疗脊髓损伤 |
| 4.6.2 纳米粒子减轻继发性SCI促进神经功能恢复 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）类胰酶TPSD1和糖苷酶UNG系统调控肝癌网络计算比较（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究现状 |
| 1.1.1 TPSD1研究现状 |
| 1.1.2 UNG研究现状 |
| 1.2 研究方法和原始结果 |
| 1.2.1 数据来源和方法 |
| 1.2.2 TPSD1网络构建 |
| 1.2.3 UNG网络构建 |
| 1.3 问题提出和解决方案 |
| 1.3.1 TPSD1和UNG有丝分裂差异 |
| 1.3.2 TPSD1和UNG神经内分泌和先天性免疫反应差异 |
| 1.3.3 TPSD1和UNG炎症反应差异 |
| 1.4 论文的课题来源和创新点 |
| 1.5 论文的主要内容和结构安排 |
| 第二章 TPSD1知识和分子网络 |
| 2.1 TPSD1反馈激活网络 |
| 2.2 TPSD1上游激活网络 |
| 2.3 TPSD1下游激活网络 |
| 2.4 TPSD1反馈抑制网络 |
| 2.5 TPSD1上游抑制网络 |
| 2.6 TPSD1下游抑制网络 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 UNG知识和分子网络 |
| 3.1 UNG反馈激活网络 |
| 3.2 UNG上游激活网络 |
| 3.3 UNG下游激活网络 |
| 3.4 UNG反馈抑制网络 |
| 3.5 UNG上游抑制网络 |
| 3.6 UNG下游抑制网络 |
| 3.7 本章小结 |
| 第四章 TPSD1与UNG网络比较 |
| 4.1 有丝分裂 |
| 4.1.1 TPSD1与有丝分裂抑制 |
| 4.1.2 UNG与有丝分裂激活 |
| 4.2 神经内分泌和先天性免疫反应 |
| 4.2.1 TPSD1与神经内分泌抑制 |
| 4.2.2 UNG与先天性免疫反应抑制 |
| 4.3 炎症反应 |
| 4.3.1 TPSD1与炎症反应激活 |
| 4.3.2 UNG与炎症反应抑制 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（5）组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 精子发生与精原干细胞 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 精原干细胞 |
| 1.3 精原干细胞增殖调控 |
| 1.3.1 GDNF对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.2 ETV5 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.3 BCL6B对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.4 ID4 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.5 PLZF对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.6 POU5F1 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.7 FOXO1 对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.3.8 活性氧对精原干细胞增殖的调控 |
| 1.4 精原干细胞分化调控 |
| 1.4.1 SOX3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.2 STAT3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.3 NGN3 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.4 SOHLH1和SOHLH2 对精原干细胞分化的调控 |
| 1.4.5 DMRT1 对精原干细胞分化的调控 |
| 第二章 表观修饰与SETDB1 的研究进展 |
| 2.1 组蛋白甲基化 |
| 2.2 H3K9me3 修饰 |
| 2.2.1 H3K9me3 与异染色质形成 |
| 2.2.2 H3K9me3 与细胞命运决定 |
| 2.3 组蛋白甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.1 H3K4 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.2 H3K9 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.3 H3K27 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.4 H3K36 甲基化修饰与DNA损伤应答 |
| 2.3.5 H3K9 甲基化和DNA甲基化对转座子的调控 |
| 2.4 组蛋白甲基化对精原干细胞增殖与分化的调控 |
| 2.5 m~6A修饰对精原干细胞增殖与分化的调控 |
| 2.6 SETDB1 的结构 |
| 2.7 SETDB1 的亚细胞定位 |
| 2.8 SETDB1 对转座子的调控 |
| 2.9 SETDB1 在雄性生殖细胞中的功能 |
| 2.10 研究目的与意义 |
| 试验部分 |
| 第三章 SETDB1 对小鼠精原干细胞存活的调控作用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Setdb1 si RNA干扰效率检测 |
| 3.2.2 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞内活性氧水平的影响 |
| 3.2.3 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞存活的影响 |
| 3.2.4 Setdb1-KD对小鼠精原干细胞增殖速率的影响 |
| 3.2.5 Setdb1-KD诱导活性氧上调的分子机制 |
| 3.2.6 Setdb1-KD通过调节细胞内活性氧水平调控精原干细胞存活 |
| 3.2.7 Setdb1-KD激活活性氧下游信号通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 SETDB1在Ythdf2-KO诱导的DNA损伤敏感性增加过程中的功能 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 Ythdf2-KO导致小鼠精原细胞DNA损伤敏感性增加 |
| 4.2.2 Ythdf2-KO影响DNA损伤修复 |
| 4.2.3 体内试验说明Ythdf2 cKO影响DNA损伤修复 |
| 4.2.4 Ythdf2-KO对 H3K9me3 修饰的影响 |
| 4.2.5 Ythdf2-KO诱导的DNA损伤敏感性增加的分子机制 |
| 4.2.6 SETDB1与γH2AX具有相互作用 |
| 4.2.7 Setdb1-KD导致精原细胞DNA损伤敏感性增加 |
| 4.2.8 Setdb1-KD影响DNA损伤修复 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 SETDB1 对猪精原干细胞分化的调控 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 猪精原干细胞的分离纯化及其鉴定 |
| 5.2.2 猪分化精原细胞的分离纯化及其鉴定 |
| 5.2.3 猪精原干细胞分化过程中的基因表达分析 |
| 5.2.4 猪精原干细胞分化过程中染色质可及性变化 |
| 5.2.5 SETDB1 介导的H3K9me3 修饰与染色质可及性之间的关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 后续研究工作 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究的目的和意义 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 诱导多能干细胞的研究进展 |
| 2.1.1 体细胞重编程的机制 |
| 2.1.2 多能干细胞由不同信号通路调节 |
| 2.1.3 提高体细胞重编程效率的研究 |
| 2.2 家畜诱导多能干细胞的研究现状 |
| 2.2.1 猪诱导多能干细胞 |
| 2.2.2 绵羊和山羊诱导多能干细胞 |
| 2.2.3 牛诱导多能干细胞 |
| 2.3 miRNAs与多能干细胞 |
| 2.3.1 miRNA简介及生物学功能 |
| 2.3.2 miRNA在多能干细胞中的作用 |
| 2.3.3 miRNAs促进体细胞重编程 |
| 2.4 多能干细胞定向分化原始生殖细胞的研究进展 |
| 2.4.1 形成原始生殖细胞的关键因子和基因 |
| 2.4.2 ESC/iPSC定向分化原始生殖细胞的途径 |
| 2.4.3 ESC/iPSC体外诱导分化为生殖细胞的培养体系 |
| 3 研究内容 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 试验研究 |
| 试验一 促进绵羊体细胞重编程miRNAs的筛选研究 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物和细胞 |
| 1.1.2 主要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂耗材 |
| 1.1.4 质粒 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 绵羊肾细胞(SKC)分离培养及鉴定 |
| 1.2.2 小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养与饲养层细胞制作 |
| 1.2.3 促绵羊体细胞重编程miRNAs的初步筛选 |
| 1.2.4 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 1.2.5 慢病毒包装 |
| 1.2.6 慢病毒收集及病毒滴度测定 |
| 1.2.7 miRNAs促绵羊肾上皮细胞重编程效率比较 |
| 1.2.8 siPSC的鉴定 |
| 1.2.9 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊体细胞的分离纯化 |
| 2.2 MEF细胞分离培养及饲养层细胞的制备 |
| 2.3 慢病毒质粒提取与酶切鉴定 |
| 2.4 成功包装各类慢病毒 |
| 2.5 促绵羊SKC重编程的miRNAs筛选 |
| 2.5.1 慢病毒成功感染SKC |
| 2.5.2 比较不同miRNA诱导绵羊SKC的效率 |
| 2.5.3 miR-200c-141+8因子诱导绵羊iPSC |
| 2.6 由miR-200c-141促进重编程获得的siPSC的多能性鉴定 |
| 2.6.1 AP染色鉴定 |
| 2.6.2 细胞免疫荧光技术鉴定siPSC中多能性蛋白因子表达 |
| 2.6.3 qPCR鉴定siPSC中多能性因子基因转录 |
| 2.6.4 siPSC中多能基因Nanog启动子甲基化分析 |
| 2.6.5 siPSC核型分析 |
| 2.6.6 siPSC向拟胚体(EB)三胚层分化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 绵羊iPSC的特征及诱导效率 |
| 3.2 miRNA提高干细胞诱导效率 |
| 4 小结 |
| 试验二 miR-200c提高羊体细胞重编程机制研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 miR-200c靶蛋白的预测 |
| 1.2.2 合成绵羊miR-200c模拟物、抑制物和阴性对照 |
| 1.2.3 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 1.2.4 双荧光素酶报告基因分析miR-200c靶基因 |
| 1.2.5 实时荧光定量PCR检测miR-200c靶基因的m RNA水平 |
| 1.2.6 Western blot检测miR-200c靶基因的蛋白水平 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 miR-200c靶基因的预测 |
| 2.2 双荧光素酶报告基因载体的构建 |
| 2.2.1 靶基因ZEB1和TWISTNB3’UTR区扩增测序 |
| 2.2.2 靶基因双荧光素酶报告载体的构建 |
| 2.3 靶基因双荧光素酶报告系统分析 |
| 2.4 实时荧光定量PCR检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin转录水平 |
| 2.5 Western blot检测ZEB1、TWISTNB及 E-cadherin蛋白表达水平 |
| 3 讨论 |
| 3.1 TGF-β信号通路与细胞重编程 |
| 3.2 miRNA提高重编程的机制 |
| 4 小结 |
| 试验三 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和载体 |
| 1.1.2 重要仪器和设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 1.2.2 PLVX-Dazl和 PLVX-Boule的慢病毒包装 |
| 1.2.3 慢病毒滴度测定 |
| 1.2.4 绵羊卵巢细胞的分离培养 |
| 1.2.5 绵羊iPSC定向分化原始生殖细胞样细胞(PGCLC) |
| 1.2.6 绵羊iPSC定向分化雌性PGC样细胞鉴定 |
| 1.2.7 数据统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体的构建 |
| 2.1.1 绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE的扩增 |
| 2.1.2 成功构建绵羊生殖相关基因DAZL和 BOULE慢病毒载体 |
| 2.1.3 成功包装慢病毒LV-DAZL和 LV-BOULE |
| 2.2 绵羊卵巢细胞分离培养 |
| 2.3 稳转DAZL和 BOULE基因siPSC的建立 |
| 2.4 原始生殖细胞样细胞(PGCCL)的鉴定 |
| 2.4.1 绵羊PGC样细胞的分化条件和过程 |
| 2.4.2 细胞免疫荧光技术检测绵羊PGC样细胞 |
| 2.4.3 实时定量RT-PCR验证绵羊PGC样细胞 |
| 3 讨论 |
| 3.1 原始生殖细胞与多能干细胞 |
| 3.2 体外重构原始生殖细胞的方法 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（7）c-Jun在人胚胎干细胞多能性维持与退出中的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 多能干细胞 |
| 1.2 c-Jun与细胞命运调控 |
| 1.3 CRISPR/Cas9 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 试剂耗材 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 确定敲除策略,设计sgRNA |
| 2.2.2 构建质粒PX330-sgRNA-PURO |
| 2.2.3 sgRNA切割活性鉴定 |
| 2.2.4 将sgRNA质粒转入h ESCs中 |
| 2.2.5 PCR鉴定基因型 |
| 2.2.6 测序 |
| 2.2.7 荧光定量PCR |
| 2.2.8 蛋白质印迹法 |
| 2.2.9 RNA-seq文库构建与分析 |
| 2.2.10 人胚胎干细胞向肝细胞分化 |
| 2.2.11 人胚胎干细胞向体节前体细胞分化 |
| 2.2.12 人胚胎干细胞向肾脏细胞分化 |
| 2.2.13 人胚胎干细胞向心肌细胞分化 |
| 2.2.14 人胚胎干细胞向神经细胞分化 |
| 2.2.15 畸胎瘤检测 |
| 2.2.16 HE染色 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 用于敲除c-Jun的 sgRNA质粒的构建 |
| 3.2 sgRNA切割效率验证 |
| 3.3 c-Jun敲除人胚胎干细胞的构建及其对多能性维持的影响 |
| 3.3.1 .c-Jun敲除人胚胎干细胞的构建 |
| 3.3.2 .畸胎瘤检测c-Jun敲除人胚胎干细胞向三胚层早期分化 |
| 3.3.3 .RNA-seq检测比较分析c-Jun敲除人胚胎干细胞转录组变化 |
| 3.4 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向不同胚层谱系终末分化的影响 |
| 3.4.1 c-Jun敲除显着促进人胚胎干细胞向肝细胞分化 |
| 3.4.2 c-Jun敲除显着抑制人胚胎干细胞向心肌细胞分化 |
| 3.4.3 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向体节前体细胞分化没有显着影响 |
| 3.4.4 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向肾脏细胞分化没有显着影响 |
| 3.4.5 c-Jun敲除对人胚胎干细胞向神经细胞分化没有显着影响 |
| 讨论与总结 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 综述 人多能干细胞诱导分化为骨骼肌相关细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）骨化三醇促进肝样细胞成熟及缓解酒精性肝细胞损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 骨化三醇促进多能干细胞来源的肝样细胞成熟 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 多能干细胞向肝细胞分化的研究进展 |
| 1.1.2 线粒体在多能干细胞分化中的作用 |
| 1.1.3 骨化三醇调节细胞分化 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 本课题所用细胞系 |
| 1.2.2 本课题所用抗体 |
| 1.2.3 本课题所用实验试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 人多能干细胞的复苏、培养和传代 |
| 1.3.2 VDR敲除胚胎干细胞系的构建与鉴定 |
| 1.3.3 多能干细胞肝向分化 |
| 1.3.4 肝细胞功能分析 |
| 1.3.5 免疫荧光染色 |
| 1.3.6 基因表达分析 |
| 1.3.7 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 1.3.8 线粒体呼吸检测 |
| 1.3.9 细胞内ATP含量的测定 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 多能干细胞向肝细胞分化鉴定 |
| 1.4.2 骨化三醇促进HLCs的功能成熟 |
| 1.4.3 骨化三醇增强HLCs的代谢能力 |
| 1.4.4 骨化三醇增强HLCs的线粒体呼吸功能 |
| 1.4.5 骨化三醇诱导HLCs的线粒体生物发生和线粒体自噬 |
| 1.4.6 骨化三醇对肝细胞成熟和线粒体功能的促进作用依赖于VDR |
| 1.4.7 骨化三醇保护乙醇诱导的肝细胞损伤 |
| 1.5 讨论与结论 |
| 第二章 骨化三醇通过AMPK/mTOR通路增强自噬缓解乙醇诱导的肝细胞损伤 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 酒精性肝病概述 |
| 2.1.2 自噬对酒精性肝病的影响 |
| 2.1.3 骨化三醇与酒精性肝病 |
| 2.1.4 骨化三醇对自噬的调控作用 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 本课题所用细胞系 |
| 2.2.2 本课题所用抗体 |
| 2.2.3 本课题所用实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 肝细胞培养 |
| 2.3.2 VDR基因敲除肝细胞系的构建 |
| 2.3.3 细胞活性检测 |
| 2.3.4 细胞凋亡检测 |
| 2.3.5 细胞内ROS及丙二醛检测 |
| 2.3.6 线粒体膜电位检测 |
| 2.3.7 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 2.3.8 透射电镜样品制备 |
| 2.3.9 自噬流检测 |
| 2.3.10 线粒体自噬分析 |
| 2.3.11 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 骨化三醇减少乙醇诱导的肝细胞毒性和凋亡 |
| 2.4.2 骨化三醇缓解乙醇诱导的氧化应激和线粒体损伤 |
| 2.4.3 骨化三醇缓解乙醇诱导的肝细胞脂质累积 |
| 2.4.4 骨化三醇促进乙醇诱导的Nrf2的核转移 |
| 2.4.5 骨化三醇通过增强自噬缓解乙醇诱导的肝细胞损伤 |
| 2.4.6 骨化三醇通过AMPK/mTOR信号通路促进乙醇诱导的自噬 |
| 2.4.7 骨化三醇对AMPK信号通路的激活依赖于VDR |
| 2.5 讨论及结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 QPCR所用引物及序列 |
| 附录二 缩略词表 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（9）线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 GPAM基因的研究进展 |
| 1.1 GPAM基因家族基因 |
| 1.2 GPAM基因的生物学作用 |
| 1.3 线粒体GPAM的功能 |
| 1.4 酵母中的GPAT表达 |
| 1.5 GPAM在甘油三酯合成中的调控作用 |
| 1.6 结语 |
| 第二章 影响乳品质的重要因素及乳脂代谢通路的研究进展 |
| 2.1 甘油三酯的在乳品质评价中意义 |
| 2.2 哺乳动物乳腺中的甘油三酯合成 |
| 2.3 乳脂代谢相关基因的简介 |
| 2.4 多不饱和脂肪酸在乳脂中的调控作用 |
| 2.5 乳汁中的甘油三酯表达 |
| 2.6 结语 |
| 第三章 线粒体基因及线粒体能量代谢的研究进展 |
| 3.1 线粒体的主要功能 |
| 3.2 线粒体在生命活动中的重要意义 |
| 3.3 线粒体在细胞死亡过程中的作用 |
| 3.4 线粒体能量代谢 |
| 3.5 结语 |
| 第四章 基因编辑技术的研究进展 |
| 4.1 转基因技术概况 |
| 4.2 精原干细胞技术 |
| 4.3 原始生殖细胞技术 |
| 4.4 胚胎干细胞基因打靶技术 |
| 4.5 条件基因靶向技术 |
| 4.6 诱导多能干细胞技术 |
| 4.7 CRISPR-CAS9 技术 |
| 4.8 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系的建立及其对细胞内乳脂代谢的影响 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验细胞 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 实验用酶 |
| 1.1.4 其他药品及试剂 |
| 1.1.5 试剂的配置 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.2.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆及鉴定 |
| 1.2.3 GPAM基因敲除靶位点的设定以及sg RNA的设计 |
| 1.2.4 gRNA的体外筛选 |
| 1.2.5 GPAM基因g RNA表达载体的构建 |
| 1.2.6 细胞培养及传代 |
| 1.2.7 敲除载体的的转染 |
| 1.2.8 细胞内编辑效率验证 |
| 1.2.9 敲除细胞的筛选、培养及鉴定 |
| 1.2.10 实时荧光定量PCR和 Western Blot检测候选基因的表达 |
| 1.2.11 GPAM基因表达载体与干扰载体鉴定 |
| 1.2.12 细胞内甘油三酯和胆固醇含量检测 |
| 1.2.13 细胞内脂肪酸含量的测定 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 乳腺上皮细胞系的支原体检测 |
| 1.3.2 GPAM基因第一和第二外显子的克隆和鉴定 |
| 1.3.3 gRNA浓度的测定 |
| 1.3.4 gRNA的体外筛选结果 |
| 1.3.5 敲除载体的构建及细胞转染 |
| 1.3.6 细胞内敲除效率验证 |
| 1.3.7 阳性细胞测序验证 |
| 1.3.8 GPAM过表达和干扰载体鉴定与检测结果 |
| 1.3.9 牛GPAM基因敲除后细胞内m RNA和蛋白表达的检测 |
| 1.3.10 GPAM基因表达对细胞内甘油三酯含量的影响 |
| 1.3.11 GPAM基因表达对细胞内胆固醇含量的影响 |
| 1.3.12 GPAM基因表达对细胞内脂肪酸含量的影响 |
| 1.3.13 GPAM敲除对脂代谢相关基因的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 牛GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 其他药品及试剂 |
| 2.1.4 试剂的配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 总RNA提取及质量检测 |
| 2.2.2 文库建立及测序 |
| 2.2.3 原始数据质量控制 |
| 2.2.4 Mapping结果统计及基因结构分析 |
| 2.2.5 差异基因表达分析 |
| 2.2.6 差异基因GO富集和KEGG分析 |
| 2.2.7 差异基因表达水平验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细胞总RNA提取及检测 |
| 2.3.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系转录组测序数据筛选及分析 |
| 2.3.3 差异表达基因分析 |
| 2.3.4 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.3.5 差异基因蛋白互作预测分析 |
| 2.3.6 GPAM敲除后信号通路互作关系预测分析 |
| 2.3.7 基因共表达网络关系预测分析 |
| 2.3.8 差异基因的表达水平验证 |
| 2.3.9 GPAM基因对甘油三酯合成相关基因的调控作用 |
| 2.3.10 GPAM基因对脂肪酸合成相关基因的调控作用 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 牛GPAM基因对乳腺上皮细胞线粒体能量代谢的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验样品 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 其他药品及试剂 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 分析软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细胞线粒体的提取 |
| 3.2.2 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体呼吸的检测 |
| 3.2.3 GPAM基因敲除乳腺上皮细胞系线粒体线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.2.4 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.2.5 敲除细胞对ATP 需求的影响 |
| 3.2.6 细胞线粒体数量的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敲除细胞中线粒体呼吸的检测 |
| 3.3.2 敲除细胞中线粒体糖酵解速率测定 |
| 3.3.3 敲除细胞对ATP需求的影响 |
| 3.3.4 GPAM基因敲除后细胞内线粒体数量的改变 |
| 3.3.5 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中三羧酸循环检测分析 |
| 3.3.6 GPAM基因敲除后细胞内线粒体中氧化磷酸化检测分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于敲除小鼠模型验证GPAM基因对脂肪代谢的调控作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 其他药品及试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 分析软件 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 GPAM基因敲除小鼠模型的制备 |
| 4.2.2 GPAM基因敲除小鼠的扩繁 |
| 4.2.3 GPAM基因敲除小鼠的鉴定 |
| 4.2.4 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.2.5 目的基因敲除小鼠相关生长性状的测定 |
| 4.2.6 组织形态学的检测 |
| 4.2.7 敲除小鼠血清学相关指标的检测 |
| 4.2.8 敲除小鼠组织中甘油三酯和胆固醇含量的检测 |
| 4.2.9 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的检测 |
| 4.2.10 敲除小鼠组织中脂肪酸成分及含量的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 敲除小鼠的阳性鉴定 |
| 4.3.2 目的基因敲除小鼠在mRNA和蛋白水平上的检测 |
| 4.3.3 目的基因敲除小鼠相关生长性状测定 |
| 4.3.4 目的基因敲除小鼠各组织形态学分析 |
| 4.3.5 敲除小鼠血清中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.6 敲除小鼠血清中胆固醇含量的测定 |
| 4.3.7 敲除小鼠乳腺组织和脂肪组织甘油三酯和胆固醇含量的测定 |
| 4.3.8 敲除小鼠乳汁中甘油三酯含量的测定 |
| 4.3.9 敲除小鼠乳腺脂肪酸含量的测定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表的文章及专利 |
| 致谢 |
（10）OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 多能干细胞研究进展 |
| 1.1 多能干细胞的建立及分类 |
| 1.1.1 多能干细胞的概述 |
| 1.1.2 胚胎干细胞研究进展 |
| 1.1.3 细胞重编程的研究进展 |
| 1.1.3.1 诱导性多能干细胞的建立 |
| 1.1.3.2 猪诱导性多能干细胞的研究进展 |
| 1.2 多能干细胞的维持机制研究 |
| 1.2.1 多能性核心转录因子的研究进展 |
| 1.2.1.1核心转录因子Oct4 |
| 1.2.1.2核心转录因子Sox2 |
| 1.2.2 多能性调控通路 |
| 1.2.2.1 细胞因子维持多能性 |
| 1.2.2.2 小分子抑制剂维持多能性 |
| 1.2.2.2.1 Wnt信号通路与多能性维持 |
| 1.2.2.2.2 MAPK/Erk信号通路与多能性维持 |
| 1.2.2.2.3 TGFβ/SMAD信号通路抑制剂SB431542 |
| 1.2.2.3 MEF饲养层细胞 |
| 第二章 H3K9甲基化修饰的研究进展 |
| 2.1 细胞重编程过程中的表观遗传调控 |
| 2.1.1 表观遗传学 |
| 2.1.2 DNA甲基化修饰 |
| 2.1.2 组蛋白共价修饰 |
| 2.1.3.1 组蛋白乙酰化修饰 |
| 2.1.3.2 组蛋白甲基化修饰 |
| 2.2 H3K9甲基化及功能 |
| 2.3 多能态建立过程中H3K9甲基化的作用 |
| 2.3 组蛋白去甲基化酶的研究进展 |
| 2.4 组蛋白去甲基化酶KDM3A与 KDM3B的研究进展 |
| 2.5 多能态建立过程中组蛋白去甲基化酶KDM3A与 KDM3B的作用 |
| 2.6 小结与展望 |
| 试验研究 |
| 第三章 猪iPSCs多能态转换过程中H3K9 甲基化的变化规律 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 撤去DOX及多能培养体系对猪DOX-i PSCs的影响 |
| 3.2.2 piPSCs多能性丧失过程中H3K9与H3K4 甲基化修饰水平的变化 |
| 3.2.3 筛选影响H3K9甲基化的主要因素 |
| 3.2.4 F-与FD-处理下pi PSCs表型检测 |
| 3.2.5 F-与FD-处理下pi PSCs多能基因检测 |
| 3.2.6 F-与FD-处理下pi PSCs组蛋白甲基化修饰水平的变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Feeder与外源基因协同维持猪i PSCs多能性机制解析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 转录组测序揭示F-与FD-组的基因表达变化 |
| 4.2.2 功能富集分析揭示整个分化过程中转录变化 |
| 4.2.3 H3K9me2/me3 在基因组上的分布情况 |
| 4.2.4 Ch IP-seq分析分化过程中H3K9me2和H3K9me3 的变化情况 |
| 4.2.5 多能性丧失过程中H3K9 甲基化motif变化分析。 |
| 4.2.6 H3K9甲基化与转录组联合分析揭示其作用机理 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 KDM3A与 KDMB协同调节H3K9 甲基化修饰维持猪多能性调控网络 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验材料与耗材 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 KDM3A与 KDM3B共干扰导致猪i PSCs丧失多能性 |
| 5.2.2 猪i PSCs中共干扰KDM3A与 KDM3B后的转录组变化 |
| 5.2.2 干扰KDM3A与 KDM3B抑制PI3K-AKT信号通路影响多能性 |
| 5.2.4 KDM3A与 KDM3B过表达对猪i PSCs多能性的影响 |
| 5.2.5 转录组测序揭示KDM3A与 KDM3B过表达的分子作用机制 |
| 5.2.6 KDM3A过表达可抑制F-处理下引发的细胞分化 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 转录因子OCT4与SOX2 是维持猪i PSCs多能性调控网络的核心 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 试验材料与耗材 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 不同DOX浓度下猪i PSCs的表型变化 |
| 6.2.2 筛选维持猪iPSCs多能性的关键转录因子 |
| 6.2.3 无DOX下过表达OCT4与SOX2 维持猪i PSCs多能性 |
| 6.2.4 Ch IP-seq揭示OCT4与SOX2 维持猪i PSCs多能性机理 |
| 6.2.5 转录因子之间调控网络建立 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 OCT4/SOX2 与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B互作维持猪i PSCs多能性 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 试验材料与耗材 |
| 7.1.2 试验方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 OCT4与SOX2 并未直接调控KDM3A与KDM3B的表达 |
| 7.2.2 H3K9去甲基化作用与核心转录因子之间的协同关系 |
| 7.2.3 转录调控水平揭示KDM3A与 OCT4/SOX2 之间的协作关系 |
| 7.2.4 IP-MS揭示KDM3A与 KDM3B的蛋白互作网络 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点及下一步研究方向 |
| 创新点 |
| 下一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、胚胎干细胞凋亡的研究进展（论文参考文献）
- [1]尼古丁对干细胞的影响[J]. 曾睿,海冰. 中国组织工程研究, 2022(25)
- [2]外源化学物质对人胚胎干细胞脂肪酸代谢的影响[D]. 李紫洪. 内蒙古大学, 2021
- [3]基于含硒纳米材料的构建及其治疗脊髓损伤的实验研究[D]. 罗文琪. 吉林大学, 2021(01)
- [4]类胰酶TPSD1和糖苷酶UNG系统调控肝癌网络计算比较[D]. 陈庆春. 北京邮电大学, 2021
- [5]组蛋白甲基转移酶SETDB1对精原干细胞增殖与分化的调控作用及其机制研究[D]. 李学亮. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [6]促绵羊iPSC生成效率的miRNAs筛选与评价及向雌性PGC样细胞定向分化研究[D]. 张云峰. 石河子大学, 2021(01)
- [7]c-Jun在人胚胎干细胞多能性维持与退出中的研究[D]. 蔡泽坡. 广州医科大学, 2021(02)
- [8]骨化三醇促进肝样细胞成熟及缓解酒精性肝细胞损伤的机制研究[D]. 袁方. 中国科学技术大学, 2021(06)
- [9]线粒体甘油-3-磷酸乙酰转移酶（GPAM）基因沉默对牛乳脂代谢的影响[D]. 于海滨. 吉林大学, 2020
- [10]OCT4/SOX2与组蛋白去甲基化酶复合体KDM3A/3B协同调控猪多能干细胞自我更新的机制[D]. 祝振硕. 西北农林科技大学, 2020