一、不同地理株柔嫩艾美耳球虫(E.tenela)杂交虫株(F_1)的培育（论文文献综述）
王晶[1]（2019）在《柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用》文中研究表明鸡球虫病由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道引起,其所属的顶复门寄生虫可引起许多动物的肠道球虫病,其中7种艾美耳属球虫特异性感染家禽后,定植于肠道特定部位黏膜上皮细胞形成病灶,引起吸收不良或出血性肠炎,对家禽养殖业危害严重。多年来科研人员先后研制出大量抗球虫药物应用于临床治疗,但由于出现耐药虫株及药物残留引发的食品安全问题,免疫预防已成为当前研究热点。本试验将来自不同地域的野毒株柔嫩艾美耳球虫（山东株、吉林株、黑龙江株）用单孢子囊接种技术进行杂交,利用RAPD技术进行多态性分析,筛选出杂交株F2,再对杂交株F2代卵囊进行物理和化学两种方法致弱并进行抗球虫效果检测,具体内容如下:杂交虫株的培育:将山东株（S）与吉林株（J）柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊通过单卵囊技术接种雏鸡,收获卵囊后提取基因组DNA,利用RAPD技术对16个山东株与吉林株杂交后代的单孢子囊扩增产物进行了分析。在分析中发现1株单孢子囊扩增产物的RAPD谱带与其它株和亲本株都不同,此虫株与两亲本株间的相似值为0.83480.8340,远远小于子代株与亲本株平均相似值0.9604,又远远大于株间相似值的平均值0.6627。因此该虫株为山东株与吉林株的杂交虫株（杂交一代,F1）。获得的杂交F1进一步与黑龙江株进行杂交（杂交二代,F2）,并用RAPD方法对14个杂交后代单孢子囊扩增产物进行分析,找到了1株与亲本株相似性为0.83570.8354的虫株,确定其为杂交株F2。杂交株F2致弱及抗球虫效果检测:将柔嫩艾美耳球虫卵囊进行物理和化学两种方法致弱,物理方法采用超声波细胞破碎仪处理孢子化卵囊,超声条件为功率200W致弱10min,化学方法采用含有叠氮钠的化学致弱剂与孢子化卵囊混合,置于4℃冰箱致弱40d。免疫后根据雏鸡存活率、体重变化、粪便计分、粪便中卵囊计数、盲肠病变计分、血液中抗体OD值变化对免疫效果进行评价。试验表明,超声波致弱柔嫩艾美耳球虫杂交株F2卵囊10min可完全破碎球虫卵囊但使其仍保持良好的免疫原性,在7日龄和14日龄时对雏鸡免疫4×103个卵囊,攻虫后7d雏鸡平均增重达89.01g,与对照组每只鸡平均增重21.31g相比差异极显着（p<0.01）,攻虫存活率达100%。在7日龄和14日龄时给雏鸡灌服化学致弱的球虫卵囊8×103个,21日龄攻虫,攻虫后7d雏鸡平均增重达90.61g,与对照组相比差异极显着（p<0.01）,攻虫存活率也达100%。其他指标也说明免疫效果较好,在二次免疫后7d,使用间接ELISA法可以在血清中检测到抗体。因此,在一定功率下超声处理杂交株F2卵囊和使用化学致弱剂致弱F2株卵囊,能使其毒力降低并保持良好的免疫原性,可作为疫苗使用。确定雏鸡最佳免疫时间为7日龄和14日龄,确定最佳免疫剂量为超声波致弱的卵囊每个雏鸡4×103个,化学致弱剂致弱的卵囊每个雏鸡8×103个。将这两种方法致弱的卵囊初步制成弱毒苗,使用饮水投苗和饲料投苗两种方法,投放到长春吉星实业有限公司、吉林德翔牧业有限公司、正大集团德大有限公司的四个养鸡场,共免疫了88万只雏鸡,据合作公司统计,增加了一定经济效益,减少了球虫病造成的损失。
王晶,刘向军,赵权[2]（2019）在《不同地理株柔嫩艾美耳球虫（E.tenela）杂交虫株（F2）的培育》文中认为将山东株（S）与吉林株（J）柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊通过单卵囊技术接种雏鸡,收获卵囊后提取基因组DNA,利用RAPD技术分析DNA,筛选出杂交株（F1）,再用该F1代与黑龙江株（H）柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊单卵囊接种雏鸡,相同方法鉴别筛选,确定了1株为山东株、吉林株和黑龙江株三个地理株的杂交（F2）卵囊。该结果为深入研究球虫的免疫机制奠定了基拙。
王祯[3]（2016）在《宿主细胞F-actin聚集与鸡球虫入侵关系研究》文中提出鸡球虫病是由多种艾美耳球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内所引起的一种寄生性原虫病。鸡球虫种类不同,寄生部位和致病性亦有差异,其中柔嫩艾美耳球虫是致病性最强、危害最为严重的一种。近年来隐孢子虫、弓形虫和疟原虫在入侵机制的研究方面发展迅速,研究发现虫体入侵会引起宿主细胞骨架结构的变化。而鸡球虫也是顶复门原虫,其入侵机制是否相似?为了探讨这一问题,本试验以HCT-8传代细胞建立体外培养模型,对鸡球虫入侵该细胞的规律、球虫接种剂量、培养基类型、血清浓度、pH等培养条件进行优化;在此基础上,探索了宿主细胞骨架结构改变对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵的影响。1.柔嫩艾美耳球虫HCT-8细胞培养模型的建立。通过在24孔细胞板上接种一定数量子孢子后不同时间取样,采用HE染色后在显微镜下观察球虫入侵该细胞后的发育情况。结果显示球虫子孢子入侵HCT-8细胞后可以发育到第2代裂殖子阶段,表明建立的模型可以用于球虫入侵阶段的研究。2.柔嫩艾美耳球虫对HCT-8细胞入侵条件的优化。以Real-time RT PCR方法评价子孢子最佳入侵时间、最适接种剂量、培养基种类、pH值及血清浓度对鸡球虫子孢子入侵率的影响。结果显示,鸡球虫在体外培养条件下,最佳入侵时间为6h,子孢子接种剂量为3×105个/孔时入侵达到饱和,当培养基为RPMI 1640且pH值为6.5时子孢子入侵率最高,血清浓度为1%时最有利于子孢子入侵。试验优化了鸡球虫入侵HCT-8细胞的条件,为鸡球虫入侵机制的研究奠定了基础。3.鸡球虫入侵与宿主细胞骨架结构的关系。先将一定数量的柔嫩艾美耳球虫子孢子接种到HCT-8细胞,入侵一定时间后取样,对样品细胞内F-actin（肌动蛋白）进行亚细胞定位。用不同浓度的细胞松弛素D抑制宿主细胞F-actin聚集,免疫荧光染色同时以Real-time RT PCR方法评价子孢子对HCT-8细胞的入侵率。结果显示球虫入侵宿主细胞过程中,宿主细胞F-actin特异性聚集在球虫子孢子表面。球虫入侵率随着该药物浓度增加而下降,当浓度达到50μg/mL时入侵率下降到原来的20%左右。免疫荧光染色结果显示细胞内F-actin聚集不明显,子孢子附近的F-actin聚集亦不明显。本试验初步研究了鸡球虫的入侵机制,为进一步研究鸡球虫入侵宿主细胞的信号传导机制打下了基础。
李国良[4]（2016）在《兔大型艾美耳球虫感染调查及其潍坊株分离鉴定与早熟选育研究》文中研究指明兔球虫病是由孢子虫纲真球虫目艾美耳科艾美耳属的一种或几种艾美耳球虫引起的一种以腹泻为主要症状的疾病,病原寄生于家兔肝脏或肠上皮细胞内。其中,大型艾美耳球虫是导致该病发生的主要虫种之一,该球虫具有传染性广和致病力强等特点,严重阻碍了养兔业的发展进程。当前,我国防控兔球虫病主要使用抗球虫药,长期及不当的药物使用导致了耐药虫株和药物残留等问题的出现,一方面危及人体的健康,另一方面使得药物防治兔球虫病的弊端日益突显起来。国内外对禽球虫病免疫预防方面的研究取得了较大的成果,国内已经有了商品化鸡球虫疫苗的生产和使用,但兔球虫疫苗目前在国内研究的人很少,商品化的兔球虫疫苗在市场上更没有出现和使用。本论文第一部分研究内容是广东、广西和山东部分地区兔大型艾美耳球虫流行病学调查。分别采集潍坊、佛山、河源、阳春、玉林、桂林、南宁7个地区9个不同规模、不同品种及不同年龄段的936份新鲜兔粪便样品,然后对采集的粪便样品应用饱和盐水漂浮法检测其中有无卵囊的存在,并通过卵囊形态学去判断兔球虫卵囊的类型。结果显示,感染大型艾美耳球虫的阳性样品所占比例为33.11%（310/936）;不同地区中,玉林地区的感染率最高达到40.06%,南宁地区感染率最低为12.00%,其他地区感染率均超过20%;在不同年龄阶段中,幼兔的染率最高为60.00%,青年兔的感染率次之为29.82%,种兔的感染率最低为9.52%;不同养殖规模中,规模化大型养殖场的兔大型艾美耳球虫感染率最低为26.59%,中型和小型散养户的兔大型艾美耳球虫感染率则较高,分别为27.94%和40.28%;在不同品种中,伊拉兔的感染率最高为40.06%,比利时兔的感染率最低为12.00%,其他品种兔大型艾美耳球虫的感染率均超过25%。本论文第二部分研究内容是进行兔大型艾美耳球虫潍坊株的单卵囊分离及其基本生物学特性的研究。应用琼脂薄膜法进行兔球虫单卵囊分离,从含混合球虫卵囊的新鲜粪便中分离出大型艾美耳球虫卵囊,纯化后接种无球虫兔进行继代增殖。参照Oliveira发表设计的兔大型艾美耳球虫18s DNA序列,合成引物后对所提取的DNA进行扩增,之后进行测序比对。结果显示,所分离纯化的球虫卵囊为大型艾美耳球虫纯种虫株。对其部分生物学特性的研究结果表明:大型艾美耳球虫的潜隐期为140142 h,孢子化时间最早为32 h,80%的卵囊完成孢子化所需要时间为45 h;随机测量100个孢子化卵囊后发现其平均大小为35.76μm×21.91μm,形态指数为1.63。为测定其繁殖力,以500、1000和3000个孢子化卵囊经口分别接种40日龄无球虫兔,结果显示其繁殖能力随接种剂量的增大呈减小趋势;大型艾美耳球虫具有较强的致病性,分别以1万、3万、5万个孢子化卵囊的剂量接种40日龄无球虫兔,结果显示,三组兔子均出现精神沉郁、食欲减退、腹泻等现象。剖检可见空肠和回肠均有病变,接种3万和5万剂量组兔肠道浆膜层明显充血,肠腔明显扩张,且肠壁变薄,剪开肠道可见大量黏液样物质,且有纽扣样坏死出现,用盖玻片刮取病变肠壁黏膜,放置于显微镜下观察,可见大量裂殖体。本论文第三部分研究内容是对兔大型艾美耳球虫进行早熟选育,之后测定早熟株的潜隐期、卵囊大小、致病性以及其稳定性,同时设置亲本株试验组进行对照。经过连续27代的早熟选育后,早熟株的潜隐期由亲本株的142 h缩短至130 h,卵囊平均大小为34.41μm×21.13μm,形态指数为1.63;从临床症状及增重情况进行致病性的对比,早熟株的致病性要小于亲本株;排卵高峰期上,早熟株出现在第8天,较亲本株的第9天提前一天,且早熟株排卵高峰期峰值低于亲本株。本论文在国内第一次对兔大型艾美耳球虫进行早熟株的选育,并对其基本生物学特性做了系统的研究,这些都为后续兔球虫疫苗的研发奠定了基础。
李亚林[5]（2014）在《湖北省不同地区柔嫩艾美耳球虫的抗药性调查》文中提出鸡球虫病（Coccidiosis）是由艾美耳属的原虫寄生于鸡肠道细胞,从而引起的以肠炎、腹泻带血、饲料转化率下降甚至死亡为主要特征的寄生虫病。鸡球虫病在世界各地都有分布和流行,造成了巨大的经济损失,阻碍了养禽业的发展（Williams2002; Dalluoul and Lillehoj2005）.迄今为止,使用化学药物治疗是生产中防治鸡球虫病的主要手段,但随着抗球虫药越来越频繁的使用,球虫对药物的抗药性问题也随之浮现。由于球虫疫苗的研制存在很多关键问题尚未解决（Sharman et al2010）,因此在未来相当长的时间里,使用抗球虫药仍是防治球虫病的主要手段（Chapman and Shirley2002）。抗药性是鸡球虫病防治中最为严重的问题,也是亟待解决的难题。在本研究中,从湖北省8个地区的23个养鸡场采集新鲜粪便,通过鸡体扩大增殖实验分离得到20个柔嫩艾美耳球虫野外分离株；利用PCR和RT-PCR分别扩增不同虫株的球虫抗药性可能相关基因MIC2, SAG, cation-transporting ATPase和Cytb,测序分析了不同虫株之间基因的序列差异；通过笼养实验,检测了不同基因型和地理分布的虫株对马杜拉霉素、地克珠利和癸氧喹啉的敏感程度,分析相关抗药基因的突变与抗药性产生的关系。（1）不同地区E.tenella分离株的获得采集了湖北省黄冈、黄石、荆州、随州、天门、武汉、襄阳、咸宁8个地区23个鸡场的新鲜粪便,球虫卵囊镜检结果显示有20个样本检出球虫卵囊,感染率为87.0%。检出的卵囊孢子化后在鸡体内进行扩大增殖,根据柔嫩艾美耳球虫寄生位置的特异性,收集盲肠中的柔嫩艾美耳球虫卵囊。鸡体增殖实验得到20个柔嫩艾美耳球虫野外分离株。（2）相关抗药基因的扩增及测序通过PCR和RT-PCR,扩增得到MIC2, SAG, cation-transporting ATPase和Cytb基因,序列测定结果表明：MIC2基因无碱基突变；SAG基因虫株之间无突变,但与Genebank报道的序列存在一个碱基差异,此突变为同义突变；根据堆型艾美耳球虫阳离子转运ATPase基因保守序列设计相关PCR引物,在柔嫩艾美耳球虫中扩增得到约500bp产物,测序并进行同源性比对。同源性比对发现此段序列与其他艾美耳球虫有很高的相似性,表明扩增得到的此段序列为柔嫩艾美耳球虫阳离子转运ATPase基因的一部分,序列比对表明此段序列在不同分离虫株间无突变；Cytb基因测序发现第22位点,第49位点和第838位点存在差异,且均为错义突变,分别导致Cytb氨基酸序列第8位点（Qi site）、第17位点和第280位点的氨基酸变异。（3）不同E.tenella分离株对三种抗球虫药的敏感程度根据基因型和地理分布,把20个虫株分为9类,通过笼养实验检测对马杜拉霉素、地克珠利和癸氧喹啉的敏感程度。结果表明野外分离虫株对马杜拉霉素都表现严重的抗药性,虫株间无明显差异；野外分离虫株对地克珠利敏感,虫株间差异不大；癸氧喹啉的抗药性则表现明显的虫株地区差异与基因型的差异：湖北东部虫株敏感,其他地方虫株抗药；未突变株敏感,突变株则表现明显的抗药性。（4）相关抗药性基因的突变与抗药性产生的关系通过分析MIC2、 SAG、 cation-transporting ATPase和Cytb基因的序列与相关抗药性的关系,得出结论：本研究中无法证实球虫对地克珠利抗药性产生机制与MIC2&SAG的基因突变有关；球虫对马杜拉霉素的抗药性与ATPase基因的突变无关；Cytb第22位碱基的突变可能是导致球虫癸氧喹啉抗药性产生的原因。本研究调查了湖北省不同地区柔嫩艾美耳球虫对不同抗球虫药物的耐药情况,同时从柔嫩艾美耳球虫基因水平来揭示和阐述了抗药性产生的机制,为进一步了解球虫抗药性的产生机理、新的抗球虫药物的开发以及建立球虫抗药性的快速检测方法提供了基础。
王中宝[6]（2013）在《安徽三个地区柔嫩艾美尔球虫耐药性分析》文中认为采集安徽省巢湖市、霍邱县及定远县三个地区患球虫病鸡的盲肠，实验室分离培养，并进行单卵囊分离扩增，运用生物学特性的观察与测定及聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）对单卵囊分离物进行鉴定，为纯种柔嫩艾美尔球虫（E.tenella）的分子生物学研究奠定基础。试验选择马杜拉霉素（Maduramicin，MAD）、莫能霉素（Monensin，MON）、妥曲珠利（Toltrazuril，TOL）、磺胺氯吡嗪钠（Sulfachloropyrazinesodium，SUS）及氯羟吡啶（Clopidol，CLP）5种药物，鸡体试验法检测三地球虫的耐药性，用最适抗球虫活性百分率（Percentofoptionanti-coccidialactivity，POAA）、病变记分减少率（Reductionoflesionscores，RLS）、相对盲肠卵囊产量（Relativeoocystproduction，ROP）及抗球虫指数（Anti-coccidialindex，ACI）四项指标对三地球虫进行耐药性评价，并根据四项指标中阳性指标数量判定耐药程度。同时，通过功能亚基、DNA随机多态性扩增（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD）及同工酶电泳分析等分子生物学方法比较耐药株与敏感株间的差异，观察耐药虫株的遗传变异情况。依据三个不同地区虫株的耐药情况，试验选用新药阿德呋啉粉剂和水溶剂进行疗效观察，以ACI和综合耐药性指数（GainIndex，GI）综合评价阿德呋啉对耐药虫株的治疗效果。试验结果表明：1)单卵囊分离：1.0%琼脂单卵囊分离法简便易行，成功率高。三个地区的单卵囊感染成功率分别为50%、57%和29%，经鉴定均为纯种E.tenella。2)鸡球虫体内检测：分离的虫株对试验所选5种抗球虫药均有不同程度的耐药性。巢湖株（CH株）氯羟吡啶组（CLP组）ACI值为183.26，敏感，而该株对MON已呈完全耐药，对MAD、TOL及SUS已呈中度耐药。霍邱株（HQ株）妥曲珠利组（TOL组）ACI值为180.48，敏感，而对SUS和CLP已呈高度耐药，对MAD和MON已呈中度耐药。定远株（DY株）对5种抗球虫药均不敏感，其中对MAD、TOL及SUS已呈高度耐药，而对MON和CLP呈轻度耐药。3)球虫体外分析：与敏感株相比，安徽地区3株E.tenellacox1和cox3基因序列均无明显差异，同种不同地理株间的相似值均较高，说明E.tenellacox1和cox3基因序列相对保守，但有关遗传变异的情况有待进一步研究；RAPD扩增图谱都有不同的带，且不同虫株间亦有相似或位置相同的条带，它们之间的相似值位于50.00%—69.39%之间，SH敏感株与DY株间的SI值最小为50.00%，CH株与HQ株间的SI值最大为69.39%；耐药株间的平均SI值为58.05%，敏感株间的SI值为52.94%，与不同敏感株相比，各虫株SI值均较低，变异程度大；敏感株LDH仅有一深色的条带，HQ株也仅有一条与敏感株相同的条带，且地方耐药株间存在交叉条带，如CH株与DY株间存在交叉条带，只是条带颜色深浅不一；敏感株的GPI有两条带，而安徽地区耐药株均有不同的差异，耐药株与敏感株间、耐药株间均存在交叉条带，如CH株、HQ株间重复了GPI-2和GPI-5两条带，但带的深浅不一，敏感株与DY株间重复了GPI-3条带；敏感株G6PD仅有一条带，CH株和HQ株有相同的G6PD-2带，但HQ株多出一条G6PD-3深带，DY株与敏感株有相同的G6PD-1，但多出一条G6PD-4浅带。4)阿德呋啉疗效观察：与阳性对照组相比，除HQ株拌料给药组外，其余阿德呋啉给药组ACI值均高于180，对三地鸡球虫病均有良好的疗效。阿德呋啉拌料给药与饮水给药相比，CH株中，拌料给药组ACI值和GI值分别为185.70和87.05，高于饮水给药；HQ株中，饮水给药组ACI值和GI值分别为183.57和81,59，高于拌料给药组；DY株中，拌料给药组ACI值和GI值分别为198.27和99.58，高于饮水给药，说明不同的给药方式对不同虫株会产生不同的效果，但二者对上述虫株均有良好的疗效。
刘蕾[7]（2008）在《紫外线减毒柔嫩艾美耳球虫YL株虫苗的制备及预防效果研究》文中进行了进一步梳理鸡球虫病是一种呈全球性分布的原虫病,其发病率可高达50%～70%,死亡率为20%～30%,严重者高达80%,每年全世界因球虫病造成的经济损失超过30亿美元。虽然使用抗球虫药这种传统方法在球虫防治中发挥了积极的作用,但是球虫耐药株的不断出现、公众对药物残留的恐惧以及新药研究的缺乏,使得活疫苗接种在不久的将来会成为控制球虫病的主要措施。因此,我们开展了本项研究,并取得如下结果:（1）对E. tenella YL株进行以紫外线照射为主的6种方法进行致弱,然后将这6种方法致弱的和未照射的E. tenella YL株孢子化卵囊,分别经口接种8日龄无球虫感染的健康尼克红小公雏,剂量为1×105个/羽,对肠道病变记分、每克粪便卵囊数（OPG）、平均增重、死亡率、血便排放情况等几项指标进行测定,研究其致病性。结果显示:未照射的球虫卵囊对鸡体的影响较大,症状和病理变化严重,且有死亡现象,死亡率在5%以上。而照射后的球虫卵囊对鸡体的影响显着减轻,试验组鸡未出现死亡现象,但镜检时查出大量卵囊,其中方法5致弱的卵囊对鸡的致病性最弱,其相对增重率和盲肠病变记分等都较其他照射方法有明显减轻。（2）用6个不同方法照射致弱的E. tenella YL株虫苗免疫雏鸡,筛选免疫保护效果最好的致弱方法。结果显示:用方法5致弱的鸡E. tenella YL株的孢子化卵囊免疫鸡,鸡的日平均体重曲线呈稳定上升趋势,产生的卵囊总量少于其它试验组和阳性对照组,OPG值曲线也较其它组低且稳定,且该组鸡的组织病理变化也较其它试验组和阳性对照组轻。（3）用最佳致弱方法制得的紫外线致弱虫苗免疫雏鸡,筛选免疫保护效果最好的免疫剂量。结果显示:免疫剂量为8 000个/羽时,相对增重率较其它组高,而OPG值、组织病理学变化比其它组轻。（4）用最佳致弱方法制得的紫外线致弱虫苗免疫雏鸡,筛选免疫保护效果最好的免疫日龄。结果显示:9日龄首免时,相对增重率和成活率较其它组高,而OPG值和盲肠病变记分较其它组轻。（5）用最佳致弱方法制得的紫外线致弱虫苗免疫雏鸡,利用非特异性酯酶（ANAE）染色法,显示该虫苗免疫后鸡体内淋巴器官T细胞的数量变化,为鸡球虫疫苗的免疫机制提供组织学基础。结果显示:免疫组的胸腺、脾、盲肠扁桃体等器官的T细胞数量均高于对照组,但各器官T细胞数量增加高峰期和峰值是有差别的。其中胸腺的高峰期最早,出现在2免后第7天,峰值为118个/100μm2;其次为盲肠扁桃体,出现在2免后第10天,峰值为64个/100μm2;脾脏的高峰期出现最晚,在2免后第14天,峰值为83个/100μm2。
姜晶[8]（2007）在《不同地理株柔嫩艾美耳球虫杂交虫株F2的培育及体外培养技术的建立》文中提出鸡球虫病是危害现代化养鸡业的重大疫病之一。多年来众多科学家对本病进行了大量的研究工作。先后研制出大量抗球虫药物，并应用于临床实践。但由于耐药虫株的出现及残留药物对人体的危害，使药物防治受到限制。免疫预防已成为当前研究的热点，就目前的研究看：球虫的免疫机制尚未完全阐明，不同种株球虫共有的保护性抗原尚未得到，已有的疫苗不能对所有种或同一种不同株的球虫产生完全保护性免疫。国外的研究者已利用单卵囊杂交技术培育杂交虫株，并获得杂交亲本株的遗传标记：如共同抗原等。这方面的报道在耐药虫株的研究中较多。本研究将来自不同地域的野毒株柔嫩艾美耳球虫（甘肃株、北京株、吉林株），采用单孢子囊接种技术培育各株单孢子囊后代，利用RAPD技术进行多态性分析，培育出杂交株F2，且在RAPD中出现了特有条带，并将F2进行体外培养。具体内容如下：杂交亲本株的选择：用五个不同地理株Eimeria.tenella，即：黑龙江株、山东株、吉林株、北京株、甘肃株，对10日龄雏鸡分别进行免疫攻虫，通过OPG计数，粪便计分，盲肠病变计分，增重测定，计算保护率，选择了免疫原性好且具有较强免疫保护力的甘肃株、北京株、吉林株。RAPD分析方法的建立：应用RAPD（随机引物扩增多态性DNA）技术，对三个杂交亲本株甘肃株、北京株、吉林株及它们的子代虫株进行了分析（14条随机引物）。在RAPD分析过程中，发现甘肃株、北京株、吉林株之间存在差异，相似值为0.6022～0.6971，平均为0.6497。各亲本株与子代株也存在差异，相似值为0.9838～0.9913，平均值为0～9876。根据相似值，列出了相似性矩阵，并绘制了亲缘关系树状图，从而建立了应用RAPD技术鉴定不同地理株柔嫩艾美耳球虫的方法。杂交虫株的培育：利用杂交技术对甘肃株、吉林株、北京株进行了杂交，通过单孢子囊技术分离杂交后代，并进行单孢子囊扩增。依据建立的RAPD分析方法，对13个甘肃株与吉林株杂交后代的单孢子囊扩增产物进行了分析，在分析中发现有一个单孢子囊扩增产物的RAPD谱带与其它不同，且其与两亲本株和子代株的相似性也与其它虫株不同，即：此虫株与两亲本株间的相似值为0.7598～0.8813，远远小于子代株与亲本株平均相似值0.9876，又远远大于株间相似值的平均值0.6497。依据亲缘关系树状图，确定该虫株为甘肃株与北京株的杂交虫株（杂交一代，F1）。获得的杂交F1进一步与北京株进行杂交（杂交二代，F2），并用RAPD方法对13个杂交后代单孢子囊扩增产物进行分析，找到了一株与亲本株相似性为0.7658～0.8831的虫株，依据亲缘关系树状图，确定其为杂交F2株。体外培养的建立：将杂交株F2接种于10-12日龄的鸡胚尿囊腔，经过连续加大剂量和增加接种胚数的方法，促使球虫逐渐适应鸡胚，最后直线传至第9代，球虫已适应鸡胚，接种剂量由每胚4万条子孢子降至1万条，一直传至22代，建立起F2株的鸡胚适应株。本研究利用杂交技术，将不同地理株的柔嫩艾美耳球虫混合感染雏鸡，鸡体内配子发生随机交配，将获得等量的母型和杂交型合子，收集所产生的卵囊，通过RAPD技术鉴定、分离出杂交虫株，以获其杂交后代，此杂交后代进一步传代或直接分析，可以找到来自不同地理株的共同保护性抗原，进而为研制适合不同地理株的球虫疫苗提供了实验依据和理论基础。
刘春杰[9]（2007）在《柔嫩艾美耳球虫杂交F2株致弱方法及免疫原性的研究》文中提出鸡球虫病（Coccidiosis）是一种分布广、危害性大的肠道寄生原虫病，它主要侵害鸡的肠上皮细胞。该病以出血性肠炎、血痢、雏鸡高发病率和死亡率为特征，成为危害养鸡业的重要疾病之一。目前，控制球虫病仍以药物防治为主，但由于耐药虫株的普遍产生以及化学药物的残留等问题使得抗球虫药物的研制开发受到极大的限制。免疫预防是控制球虫病的理想方法，利用鸡弱毒球虫疫苗防治鸡球虫病不仅能彻底解决鸡球虫的耐药性问题，而且能够生产出绿色食品，保证肉、蛋质量。本研究探索致弱柔嫩艾美耳球虫杂交株卵囊的物理和化学方法，并对致弱卵囊免疫保护性和抗体消长规律进行研究。采用常规法扩增杂交株卵囊，并用物理方法和化学方法将其致弱。首先，将孢子化卵囊，在一定功率、不同超声时间的超声波作用下致弱，置于4℃冰箱备用。然后，配制化学致弱剂，将孢子化卵囊和化学致弱剂搅拌混合均匀，置于4℃冰箱致弱40d。将致弱卵囊口服接种肉鸡，进行肉鸡免疫性能试验。用卵囊计数、粪便记分、平均增重和免疫存活率等指标进行统计分析。建立检测鸡血清抗体OD值的间接酶联免疫吸附试验（ELISA），按照间接ELISA实验方法的程序确定抗原最佳包被浓度、酶结合物工作浓度、被检血清最佳稀释度。采用上述条件探讨物理和化学方法致弱杂交卵囊免疫鸡后血清抗体OD值的动态变化规律。实验表明，超声波致弱柔嫩艾美耳球虫杂交F2株卵囊10min可有效地使球虫卵囊的毒力减弱，免疫剂量为每只鸡4×103个卵囊，分别于7日龄和14日龄口服接种致弱杂交球虫卵囊疫苗免疫，攻虫后7d肉鸡平均增重达155g，与对照组每只鸡平均增重25g相比差异极显着（p＜0.01），攻虫存活率达100％。使用廉价、易得的化学试剂制备化学致弱剂，确定免疫剂量为每只鸡8×103个感染性卵囊，分别于7日龄和14曰龄口服致弱球虫卵囊疫苗免疫，攻虫后7d肉鸡平均增重达165g，与对照组每只鸡平均增重25g相比差异极显着（p＜0.01），攻虫存活率也达100％。选用的化学致弱剂致弱F2株卵囊及在一定功率下超声处理杂交F2株卵囊10min，可使F2株卵囊致弱并保持良好的免疫原性，可作为疫苗使用。建立的间接ELISA法可应用于鸡球虫疫苗免疫的抗体检测。本文揭示了超声波致弱球虫卵囊和化学试剂致弱球虫卵囊免疫抗体消长规律，为进一步的球虫疫苗免疫研究奠定了理论和实践基础。
闫鸿斌[10]（2007）在《鸡球虫病活疫苗的研制》文中提出鸡球虫病是一种呈全球性分布的原虫病，其发病率可高达50％～70％，死亡率为20％～30％，严重者高达80％。每年，全世界因球虫病造成的经济损失超过30亿美元。虽然使用抗球虫药这种传统方法在球虫病防治中发挥了积极的作用，但是球虫耐药株的不断出观、公众对药物残留的恐惧以及新药研制的缺乏，使得活疫苗接种在不久的将来会成为控制球虫病的主要措施。因此，我们开展了本项研究，并取得如下结果：（1）改进了单卵囊分离技术，成功分离到柔嫩、毒害、巨型、堆型、和缓、布氏和早熟艾美耳球虫兰州株；克隆了堆型艾美耳球虫全长1.7Kb的18S rRNA基因，分析了其遗传、进化特点，为从分子水平上研究艾美耳球虫种系发生、遗传进化、虫种分类与鉴定等奠定了基础。（2）测定了所分离虫株的毒力（即致病性）。实验证实：每只鸡感染6×104个孢子化卵囊时，引起较严重的肠道病变，生长严重受阻：每只鸡感染9×105～1.2×106个孢子化卵囊时，约半数感染鸡致死；而1.8×106个孢子化卵囊的感染剂量可致全部感染鸡死亡。这为进行疫苗配制及其免疫效果评价时选择适宜的攻虫剂量提供了参考依据。（3）研制出四价鸡球虫病活疫苗（LCV）、五价鸡球虫病活疫苗（LCV-1）和六价鸡球虫病活疫苗（LCV-2），在实验条件下，给5-10日龄雏鸡经口接种疫苗，两周后用与疫苗同源的混合孢子化卵囊大剂量攻虫，以相对增重率、死亡率、肠道剖检病变计分，平均OPG值和抗球虫指数（ACI）为评价指际，观察了这三种疫苗的安全性和免疫效果。筛选出了最佳免疫剂量，结果也证实了这三种疫苗安全性高，免疫保护效果显着，与国内外同类疫苗相当。（4）对比研究了LCV-2号对笼养和平养鸡的免疫效果，证实LCV-2对笼养鸡和平养鸡都有较强的免疫效果，而且LCV-2安全性高，即使漏免也不会造成鸡只发病。（5）评价了两种β-葡聚糖对LCV的免疫增强效果。结果表明，在攻虫后7天和14天，所有免疫组鸡的体重均极显着（P＜0.01）高于攻虫对照组、香菇糖组和酵母糖组，而香菇糖+LCV免疫组和酵母糖+LCV免疫组鸡的体重均又显着高于LCV免以组，攻虫后14天，香菇糖+LCV免疫组体重还显着高于酵母糖+LCV免疫组；在攻虫后卵囊排出量、免疫器官指数尤其胸腺指数和脾淋巴细胞增殖等指际上都有类似结果。说明两种β-葡聚糖都能作为鸡球虫疫苗的免疫增强剂，增强疫苗的免疫效果，其中香菇β-葡聚糖优于酵母β-葡聚糖。
二、不同地理株柔嫩艾美耳球虫(E.tenela)杂交虫株(F_1)的培育（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同地理株柔嫩艾美耳球虫(E.tenela)杂交虫株(F_1)的培育（论文提纲范文）
（1）柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫病概述 |
| 1.1 鸡球虫分类 |
| 1.2 鸡球虫生活史 |
| 1.3 柔嫩艾美耳球虫发育过程 |
| 1.4 鸡感染球虫后的发病机制 |
| 1.5 柔嫩艾美耳球虫病变特点 |
| 1.6 展望 |
| 第二章 鸡球虫病活疫苗的研究进展 |
| 2.1 强毒苗的研制 |
| 2.2 弱毒苗的研制 |
| 2.3 鸡对球虫的免疫应答 |
| 2.4 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 柔嫩艾美耳球虫不同地理株杂交株制备 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 实验动物及饲养 |
| 1.2.2 虫株复壮 |
| 1.2.3 卵囊分离 |
| 1.2.4 卵囊孢子化 |
| 1.2.5 孢子化卵囊的灭菌和纯化 |
| 1.2.6 孢子囊的制备 |
| 1.2.7 单孢子囊胶囊制备及扩增 |
| 1.2.8 柔嫩艾美耳球虫DNA的提取 |
| 1.2.9 选择引物 |
| 1.2.10 PCR反应条件 |
| 1.2.11 数据分析 |
| 1.2.12 虫株的培育及鉴定 |
| 1.2.12.1 杂交F1 虫株的培育 |
| 1.2.12.2 杂交F1 虫株的鉴定 |
| 1.2.12.3 杂交F2 虫株的培育 |
| 1.2.12.4 杂交F2 虫株的鉴定 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.3.1 杂交虫株F1 的培育结果 |
| 1.3.2 杂交虫株F2 的培育 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 柔嫩艾美耳球虫杂交株F2致弱方法及抗球虫效果检测 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 免疫保护效果评价指标 |
| 2.2.1.1 测量体重 |
| 2.2.1.2 存活率 |
| 2.2.1.3 血便计分 |
| 2.2.1.4 麦克马斯特法检测粪便中卵囊数(OPG) |
| 2.2.1.5 盲肠病变计分 |
| 2.2.2 超声波致弱卵囊方法 |
| 2.2.3 化学致弱剂的配制及致弱方法 |
| 2.2.4 动物试验免疫程序设计 |
| 2.2.5 ELISA检测雏鸡抗体水平 |
| 2.2.6 卵囊抗原制备 |
| 2.2.7 间接ELISA最佳反应条件的选择 |
| 2.2.8 间接ELISA实验步骤 |
| 2.2.9 数据处理 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 体重变化 |
| 2.3.2 攻虫7d存活率 |
| 2.3.3 血便计分 |
| 2.3.4 攻虫后第7d卵囊数OPG |
| 2.3.5 盲肠病变计分 |
| 2.3.6 血清抗体OD值 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 弱毒苗试验推广 |
| 3.1 试验方法 |
| 3.1.1 计算雏鸡每日饮水和饲料量 |
| 3.1.2 计算免疫剂量 |
| 3.1.3 弱毒苗的使用方法 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 疫苗特性 |
| 3.3.2 投苗方法比较 |
| 3.3.3 弱毒苗免疫效果比较 |
| 3.3.4 经济效益分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）不同地理株柔嫩艾美耳球虫（E.tenela）杂交虫株（F2）的培育（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 虫株 |
| 1.1.2 试验动物及饲料 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 实验动物及饲养 |
| 1.2.2 虫株复壮 |
| 1.2.3 卵囊分离及孢子化 |
| 1.2.4 孢子化卵囊的灭菌和纯化 |
| 1.2.5 孢子囊的制备 |
| 1.2.6 单孢子囊胶囊制备及扩增 |
| 1.2.7 DNA的提取及PCR反应条件 |
| 1.2.8 数据分析 |
| 1.2.9 杂交F2虫株的培育和鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 杂交虫株F1的培育结果 |
| 2.1.1 山东株与吉林株杂交 |
| 2.1.2 16株柔嫩艾美耳球虫相似性矩阵 |
| 2.2 杂交虫株F2的培育结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 卵囊的分离与纯化 |
| 3.2 单孢子囊的制备 |
| 3.3 杂交株的培育 |
（3）宿主细胞F-actin聚集与鸡球虫入侵关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词英汉对照表 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.3 试验动物及饲料 |
| 2.1.4 虫株及细胞 |
| 2.1.5 试验用试剂的配制 |
| 2.1.5.1 RNA提取相关试剂的配制 |
| 2.1.5.2 其他溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 柔嫩艾美耳球虫子孢子的制备 |
| 2.2.1.1 试验鸡接种 |
| 2.2.1.2 孢子化卵囊的收集与纯化 |
| 2.2.1.3 子孢子的纯化 |
| 2.2.2 柔嫩艾美耳球虫入侵HCT-8 细胞培养模型建立与入侵条件优化 |
| 2.2.2.1 HCT-8 细胞的复苏与传代培养 |
| 2.2.2.2 细胞铺板 |
| 2.2.2.3 细胞铺板量的优化 |
| 2.2.2.4 柔嫩艾美耳球虫入侵HCT-8 细胞培养模型的建立 |
| 2.2.2.5 子孢子感染HCT-8 细胞最佳入侵时间的确定 |
| 2.2.2.6 子孢子最佳接种剂量的确定 |
| 2.2.2.7 不同培养基对子孢子入侵率的影响 |
| 2.2.2.8 不同pH对子孢子入侵率的影响 |
| 2.2.2.9 不同血清浓度对子孢子入侵率的影响 |
| 2.2.3 宿主细胞F-actin聚集与鸡球虫入侵关系的研究 |
| 2.2.3.1 纯净子孢子的制备与细胞爬片准备 |
| 2.2.3.2 HCT-8 细胞的复苏与传代培养 |
| 2.2.3.3 亚细胞定位分析宿主细胞F-actin的聚集情况 |
| 2.2.3.4 抑制宿主细胞F-actin聚集对球虫入侵的影响 |
| 3 结果及分析 |
| 3.1 卵囊的纯化和子孢子制备 |
| 3.2 细胞铺版剂量优化 |
| 3.3 柔嫩艾美耳球虫入侵HCT-8 细胞培养模型的建立 |
| 3.4 子孢子感染HCT-8 细胞最佳入侵时间的确定 |
| 3.5 子孢子不同接种剂量对入侵率的影响 |
| 3.6 不同培养基对子孢子入侵率的影响 |
| 3.7 不同pH值对子孢子入侵率的影响 |
| 3.8 不同血清浓度对子孢子入侵率的影响 |
| 3.9 宿主细胞F-actin聚集与鸡球虫入侵的关系 |
| 3.9.1 亚细胞定位分析宿主细胞F-actin的聚集情况 |
| 3.9.2 不同浓度细胞松弛素D对子孢子入侵率的影响 |
| 3.9.3 宿主细胞F-actin亚细胞定位 |
| 4 讨论 |
| 4.1 柔嫩艾美耳球虫HCT-8 细胞培养模型的建立与优化 |
| 4.2 宿主细胞F-actin聚集与鸡球虫入侵的关系 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录：攻读硕士学位期间论文发表及获奖情况 |
（4）兔大型艾美耳球虫感染调查及其潍坊株分离鉴定与早熟选育研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 致病性 |
| 1.4 兔球虫疫苗研究进展 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验用动物 |
| 2.1.2 试验用饲料 |
| 2.1.3 试验用卵囊 |
| 2.2 主要仪器和设备 |
| 2.3 主要试剂与配置 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 广东、广西及山东部分地区兔大型艾美耳球虫流行病学调查 |
| 2.4.1.1 兔球虫感染情况调查抽样方法 |
| 2.4.1.2 样本采集 |
| 2.4.1.3 卵囊种类的鉴定 |
| 2.4.2 E. magna潍坊株单卵囊分离 |
| 2.4.2.1 混合卵囊的采集 |
| 2.4.2.2 单卵囊分离 |
| 2.4.2.3 大型艾美耳球虫卵囊纯化与培养 |
| 2.4.2.4 继代增殖 |
| 2.4.3 E. magna潍坊株生物学特性研究 |
| 2.4.3.1 大型艾美耳球虫繁殖、复壮和卵囊分离 |
| 2.4.3.2 潜隐期和孢子化时间的测定 |
| 2.4.3.3 卵囊大小的测定 |
| 2.4.3.4 分子生物学鉴定 |
| 2.4.3.5 E. magna潍坊株繁殖力的测定 |
| 2.4.3.6 E. magna潍坊株致病性试验 |
| 2.4.4 E. magna潍坊株早熟系的选育 |
| 2.4.5 E. magna潍坊株早熟系虫株与亲本株生物学特性的比较 |
| 2.4.5.1 E. magna潍坊株早熟系虫株与亲本株卵囊大小的比较 |
| 2.4.5.2 E. magna潍坊株早熟系虫株与亲本株致病性的比较 |
| 2.4.5.3 E. magna潍坊株早熟系虫株稳定性的研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 广东、广西及山东部分地区兔大型艾美耳球虫流行病学调查结果 |
| 3.1.1 不同品种兔大型艾美耳球虫的感染情况调查 |
| 3.1.2 不同年龄段兔大型艾美耳球虫的感染情况调查 |
| 3.1.3 不同地区兔大型艾美耳球虫的感染情况调查 |
| 3.1.4 不同规模兔场兔大型艾美耳球虫的感染情况调查 |
| 3.2 E. magna潍坊株单卵囊分离结果 |
| 3.2.1 混合卵囊的采集结果 |
| 3.2.2 单卵囊分离结果 |
| 3.3 E. magna潍坊株生物学特性的研究结果 |
| 3.3.1 E. magna潍坊株的繁殖、复壮和卵囊分离结果 |
| 3.3.2 潜隐期和孢子化过程的测定结果 |
| 3.3.3 卵囊大小测定结果 |
| 3.3.4 分子生物学鉴定结果 |
| 3.3.4.1 E. magna潍坊株特异PCR鉴定结果 |
| 3.3.4.2 外源虫种鉴定结果 |
| 3.3.5 E. magna潍坊株繁殖力的测定结果 |
| 3.3.6 E. magna潍坊株致病性试验结果 |
| 3.3.6.1 临床症状观察 |
| 3.3.6.2 病理变化 |
| 3.3.6.3 感染大型艾美耳球虫后卵囊排出规律及增重情况 |
| 3.3.7 E. magna潍坊株早熟系的选育结果 |
| 3.3.8 E. magna潍坊株早熟系虫株与亲本株生物学特性的比较结果 |
| 3.3.8.1 E. magna潍坊株早熟系虫株与亲本株卵囊大小的比较结果 |
| 3.3.8.2 E. magna潍坊株早熟系虫株与亲本株致病性的比较结果 |
| 3.3.8.3 E. magna潍坊株早熟系稳定性研究结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（5）湖北省不同地区柔嫩艾美耳球虫的抗药性调查（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 抗球虫药及抗药现状 |
| 1.2.1 聚醚类离子载体抗生素 |
| 1.2.2 化学合成药 |
| 1.3 球虫抗药性研究进展 |
| 1.3.1 球虫抗药性的分子检测技术 |
| 1.3.2 球虫耐药性相关基因 |
| 1.4 控制球虫抗药性的主要策略 |
| 1.4.1 合理的用药方案 |
| 1.4.2 免疫预防 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物和虫株 |
| 3.1.2 仪器与试剂 |
| 3.1.3 实验药物与饲料 |
| 3.1.4 溶液的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 临床样本的收集 |
| 3.2.2 镜检观察粪便中的球虫卵囊 |
| 3.2.3 粪便中卵囊计数 |
| 3.2.4 饱和盐水法收集粪便中的卵囊 |
| 3.2.5 卵囊的孢子化 |
| 3.2.6 E.tenalla虫株的分离与纯化 |
| 3.2.7 E.tenella基因组和总RNA的提取 |
| 3.2.8 相关基因引物的设计 |
| 3.2.9 PCR和RT-PCR反应 |
| 3.2.10 抗药基因的序列和生物信息学分析 |
| 3.2.11 抗药性实验 |
| 3.2.12 抗药性相关因素分析 |
| 4. 结果与分析 |
| 4.1 不同地区E.tenella分离株的获得 |
| 4.1.1 样本采集 |
| 4.1.2 样本镜检结果 |
| 4.1.3 E.tenella虫株的分离和纯化实验 |
| 4.2 不同分离株相关抗药基因的测序与生物信息学分析 |
| 4.2.1 Cytb基因 |
| 4.2.2 MIC2基因 |
| 4.2.3 SAG基因 |
| 4.2.4 ATPase基因 |
| 4.3 抗药性实验 |
| 4.3.1 临床症状 |
| 4.3.2 剖检结果 |
| 4.3.3 不同药物对不同虫株的保护效果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 湖北省禽养殖场鸡柔嫩艾美耳球虫病流行情况 |
| 5.2 碱基突变与抗药性产生之间的关系 |
| 5.3 相关抗药基因的序列分析 |
| 5.4 不同基因型和地理分布对球虫抗药性的关系 |
| 5.4.1 不同基因型与球虫抗药性的关系 |
| 5.4.2 地理分布与球虫抗药性的关系 |
| 5.5 碱基突变对Cytb蛋白三级结构的影响 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）安徽三个地区柔嫩艾美尔球虫耐药性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 附表和插图清单 |
| 缩略语表 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 技术路线 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 试验动物 |
| 1.1.2 试验虫株 |
| 1.1.3 试验药品 |
| 1.1.4 分子生物学试剂 |
| 1.1.5 溶液的配制 |
| 1.1.6 常用仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 柔嫩艾美耳球虫的分离与鉴定 |
| 1.2.2 鸡体耐药性检测 |
| 1.2.3 线粒体细胞色素C氧化酶不同亚基序列的分析 |
| 1.2.4 RAPD分析 |
| 1.2.5 同工酶分析 |
| 1.2.6 阿德呋啉的疗效试验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 单卵囊分离与鉴定 |
| 2.1.1 单卵囊感染效率 |
| 2.1.2 生物学特性鉴定 |
| 2.1.3 基因组DNA提取结果 |
| 2.1.4 PCR扩增结果 |
| 2.2 耐药性检测 |
| 2.2.1 感染后试验组鸡的临床症状与剖检变化 |
| 2.2.2 POAA |
| 2.2.3 RLS |
| 2.2.4 ROP |
| 2.2.5 ACI |
| 2.2.6 三地E.tenella对五种抗球虫药耐药性的综合判定 |
| 2.3 线粒体细胞色素C氧化酶不同亚基序列的分析结果 |
| 2.3.1 线粒体细胞色素C氧化酶第1亚基（cox1）结果分析 |
| 2.3.2 线粒体细胞色素C氧化酶第3亚基（cox3）结果分析 |
| 2.4 RAPD结果分析 |
| 2.4.1 5株E.tenella基因组DNA多态性分析 |
| 2.4.2 相似性分析 |
| 2.5 同工酶电泳结果 |
| 2.5.1 LDHSDS-PAGE电泳结果 |
| 2.5.2 GPISDS-PAGE电泳结果 |
| 2.5.3 G6PDSDS-PAGE电泳结果 |
| 2.6 阿德呋啉的抗球虫效果 |
| 2.6.1 ACI判定结果 |
| 2.6.2 GI判定结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 单卵囊感染与分离效果 |
| 3.2 单卵囊鉴定 |
| 3.3 鸡球虫耐药性体内检测 |
| 3.4 耐药性的体外分析方法 |
| 3.4.1 线粒体不同功能亚基的分析 |
| 3.4.2 RAPD分析 |
| 3.4.3 同工酶分析 |
| 3.5 抗球虫新药疗效试验 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 本人学习经历 |
| 参与科研、学术活动与发表文章 |
（7）紫外线减毒柔嫩艾美耳球虫YL株虫苗的制备及预防效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫及其免疫学研究进展 |
| 1.1 鸡球虫的概况 |
| 1.1.1 鸡E.tenella 及其生活史 |
| 1.1.2 E.tenella 的致病性研究 |
| 1.1.3 E.tenella 的鉴别与诊断 |
| 1.2 鸡球虫的免疫机理研究进展 |
| 1.2.1 鸡球虫病免疫学研究历史回顾 |
| 1.2.2 鸡球虫病免疫机理 |
| 1.3 球虫疫苗的研究概况 |
| 1.3.1 活卵囊疫苗 |
| 1.3.2 鸡球虫基因工程疫苗 |
| 1.4 展望 |
| 试验研究 |
| 第二章 鸡E.TENELLA YL 株紫外线致弱虫苗的制备及致病性研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验虫株 |
| 2.1.3 酶和试剂 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 E.tenella YL 株卵囊的复苏与分离纯化 |
| 2.2.2 E.tenella YL 株卵囊紫外线照射致弱 |
| 2.2.3 致病性研究 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 临床症状观察结果 |
| 2.3.2 增重变化 |
| 2.3.3 OPG 值统计结果 |
| 2.3.4 盲肠病变记分结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鸡E.TENELLA YL 株紫外线照射最佳致弱方法的确定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 试验虫株及虫苗 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 试验动物及分组 |
| 3.2.2 判断指标 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 临床症状观察结果 |
| 3.3.2 OPG 值测定结果 |
| 3.3.3 各组鸡的日平均体重测定结果 |
| 3.3.4 病理切片观察结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 鸡E.TENELLA YL 株紫外线致弱虫苗最佳免疫剂量的确定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 试验虫株及虫苗 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 试验动物及分组 |
| 4.2.2 判定指标 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 临床症状观察结果 |
| 4.3.2 OPG 值测定结果 |
| 4.3.3 各组鸡的日平均体重测定结果 |
| 4.3.4 病理切片观察结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 鸡E.TENELLA YL 株紫外线致弱虫苗最佳免疫日龄的确定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 试验虫株及虫苗 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 试验动物及分组 |
| 5.2.2 判断指标 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 临床症状观察结果 |
| 5.3.2 增重变化 |
| 5.3.3 OPG 值结果 |
| 5.3.4 盲肠病变记分情况 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 鸡E.TENELLA YL 株紫外线致弱虫苗免疫雏鸡后T 细胞的变化 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 试验动物 |
| 6.1.2 试验虫株及虫苗 |
| 6.1.3 固定液 |
| 6.1.4 孵育液 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 试验动物及分组 |
| 6.2.2 非特异性酯酶染色法 |
| 6.2.3 细胞计数及数据处理 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 免疫后胸腺T 细胞数量变化 |
| 6.3.2 免疫后脾T 细胞数量变化 |
| 6.3.3 免疫后盲肠扁桃体T 细胞数量变化 |
| 6.3.4 免疫后试验组几种器官T 细胞数量变化 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 ANAE 染色法 |
| 6.4.2 关于球虫疫苗免疫后几种器官T 细胞数量变化 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）不同地理株柔嫩艾美耳球虫杂交虫株F2的培育及体外培养技术的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫病的免疫研究进展 |
| 1 球虫的免疫原性 |
| 1.1 球虫各发育阶段免疫原性 |
| 1.2 球虫抗原成分分析 |
| 2 球虫保护性免疫机制 |
| 2.1 抗体在鸡球虫免疫中的作用 |
| 2.2 淋巴细胞在鸡球虫保护性免疫中作用 |
| 2.3 CD_4~+T、CD_8~+T细胞在鸡球虫保护性免疫中的作用 |
| 3 鸡球虫疫苗的研究 |
| 3.1 球虫活苗 |
| 3.2 基因工程疫苗 |
| 3.3 鸡球虫疫苗研究展望 |
| 第二章 鸡柔嫩艾美耳球虫种株鉴定方法及体外培养技术的研究进展 |
| 1 同工酶技术 |
| 1.1 同工酶的种间变异和球虫种株的关系 |
| 1.2 同工酶在种内变异和球虫的关系 |
| 2 RAPD(随机扩增多态性DNA分析) |
| 3 RFLP标记 |
| 4 限制性内切酶酶谱分析 |
| 5 杂交虫株的研究进展 |
| 6 球虫体外培养的研究进展 |
| 6.1 鸡胚培养 |
| 6.2 体外细胞培养 |
| 第二篇 研究内容 柔嫩艾美耳球虫杂交虫株F2的培育及体外培养技术的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 杂交虫株的培育 |
| 1.4 杂交F2株体外培养技术的建立 |
| 2 结果 |
| 2.1 杂交亲本株的选择 |
| 2.2 RAPD分析方法的建立 |
| 2.3 杂交虫株的培育 |
| 2.4 F2体外适应株的培养 |
| 3 讨论 |
| 3.1 单孢子囊的制备 |
| 3.2 不同虫株RAPD鉴别方法的建立 |
| 3.3 最佳反应体系的建立 |
| 3.4 反应程序的优化 |
| 3.5 杂交虫株的培育 |
| 3.6 F2体外适应株的建立 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）柔嫩艾美耳球虫杂交F2株致弱方法及免疫原性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 鸡球虫病流行病学 |
| 1.1 影响因素 |
| 1.2 鸡球虫病流行现状 |
| 1.3 鸡球虫病的危害 |
| 2 研究目的和意义 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 鸡球虫免疫研究进展 |
| 1 鸡球虫免疫原性 |
| 1.1 不同种类球虫的免疫原性 |
| 1.2 球虫各发育阶段的免疫原性 |
| 2 球虫保护性免疫作用机制 |
| 2.1 鸡球虫病细胞免疫学研究 |
| 2.2 鸡球虫病体液免疫学研究 |
| 2.3 局部免疫 |
| 第二章 鸡球虫病疫苗的研究进展 |
| 1 鸡球虫苗的种类 |
| 1.1 球虫活疫苗 |
| 1.2 亚单位疫苗 |
| 1.3 重组疫苗 |
| 1.4 合成肽疫苗 |
| 2 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 实验一 E.tenella杂交F2株致弱方法及免疫保护性试验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 粪便记分 |
| 2.2 攻虫后第7d卵囊数OPG |
| 2.3 体重变化结果 |
| 2.4 攻虫7d存活率 |
| 3 讨论 |
| 3.1 存活率 |
| 3.2 肉仔鸡增重 |
| 3.3 粪便记分 |
| 3.4 卵囊记数 |
| 4 小结 |
| 实验二 检测血清抗体间接酶联免疫吸附试验的初步建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 ELISA各步反应条件确定结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 实验三 E.tenella杂交致弱株免疫鸡血清抗体消长规律的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与讨论 |
| 2.1 化学致弱剂组血清抗体消长规律 |
| 2.2 超声波致弱组血清抗体消长规律 |
| 2.3 未致弱组血清抗体消长规律 |
| 2.4 对照组、空白组血清抗体消长规律 |
| 3 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）鸡球虫病活疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鸡抗球虫免疫机理 |
| 1.1.1 体液免疫 |
| 1.1.2 细胞免疫 |
| 1.1.3 细胞因子在抗球虫感染中的作用 |
| 1.1.4 抗球虫感染中NO的变化 |
| 1.2 球虫疫苗 |
| 1.2.1 活疫苗 |
| 1.2.2 分子疫苗 |
| 1.2.3 提高鸡抗球虫免疫水平的策略 |
| 1.2.4 小结 |
| 1.3 研究目的意义 |
| 第二章 鸡艾美耳球虫单卵囊分离技术的改进与单一虫种的分离 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 鸡堆型艾美耳球虫18S R DNA遗传变异分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 球虫18S rRNA基因目的片段的扩增 |
| 3.2.2 重组质粒的沟建及鉴定 |
| 3.2.3 数据库Blast检索与序列数据联配(alignment) |
| 3.2.4 聚类及变异特点分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 鸡艾美耳球虫兰州株的致病性研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 虫种 |
| 4.1.2 实验动物及饲料 |
| 4.1.3 分组与处理 |
| 4.1.4 观察和记录项目 |
| 4.1.5 数据处理 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 临床观察 |
| 4.2.2 各组试验鸡增重 |
| 4.2.3 各组平均料肉比 |
| 4.2.4 平均OPG值和死亡率 |
| 4.2.5 各肠段平均病变计分 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 鸡球虫苗LCV的免疫效果研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 鸡球虫病活疫苗LCV-1的免疫效果研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 临床观察 |
| 6.2.2 各组试验鸡增重 |
| 6.2.3 免疫后和攻虫后各组OPG值 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 鸡球虫病活疫苗(LCV-2号)不同剂量的免疫效果研究 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 鸡球虫病活疫苗(LCV-2号)对笼养和平养鸡的免疫效果比较 |
| 8.1 材料和方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 第九章 两种B-葡聚糖对鸡球虫活疫苗LCV的免疫增强效果研究 |
| 9.1 材料和方法 |
| 9.1.1 材料 |
| 9.1.2 方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.2.1 增重 |
| 9.2.2 卵囊排出量 |
| 9.2.3 免疫器官指数 |
| 9.2.4 脾脏淋巴细胞增殖试验 |
| 9.3 讨论与小结 |
| 第十章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、不同地理株柔嫩艾美耳球虫(E.tenela)杂交虫株(F_1)的培育（论文参考文献）
- [1]柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）不同地理株杂交虫株（F2）弱毒苗的制备及初步应用[D]. 王晶. 吉林农业大学, 2019(03)
- [2]不同地理株柔嫩艾美耳球虫（E.tenela）杂交虫株（F2）的培育[J]. 王晶,刘向军,赵权. 吉林畜牧兽医, 2019(04)
- [3]宿主细胞F-actin聚集与鸡球虫入侵关系研究[D]. 王祯. 华南农业大学, 2016(03)
- [4]兔大型艾美耳球虫感染调查及其潍坊株分离鉴定与早熟选育研究[D]. 李国良. 华南农业大学, 2016(03)
- [5]湖北省不同地区柔嫩艾美耳球虫的抗药性调查[D]. 李亚林. 华中农业大学, 2014(09)
- [6]安徽三个地区柔嫩艾美尔球虫耐药性分析[D]. 王中宝. 安徽农业大学, 2013(05)
- [7]紫外线减毒柔嫩艾美耳球虫YL株虫苗的制备及预防效果研究[D]. 刘蕾. 西北农林科技大学, 2008(11)
- [8]不同地理株柔嫩艾美耳球虫杂交虫株F2的培育及体外培养技术的建立[D]. 姜晶. 吉林农业大学, 2007(04)
- [9]柔嫩艾美耳球虫杂交F2株致弱方法及免疫原性的研究[D]. 刘春杰. 吉林农业大学, 2007(04)
- [10]鸡球虫病活疫苗的研制[D]. 闫鸿斌. 中国农业科学院, 2007(06)