一、流式细胞术实体瘤组织标本制备的研究（论文文献综述）
高嫦娥[1]（2021）在《PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究》文中研究说明研究背景与目的靶向T细胞抑制性检测点肿瘤免疫治疗是当今生物医学研究的最热点。研究表明,利用单抗药物直接作用于PD-1可以有效地阻断抑制性免疫检测点,激活T细胞,增强T细胞的功能,达到治疗肿瘤的目的。在机体的免疫系统中,肠道由于接触抗原的表面积最大并且免疫细胞数量较多,因而被认为是体内最大的免疫器官[1],发生于结直肠的恶性肿瘤与免疫逃逸有关。本研究利用CRISPR/Cas9技术对T细胞PD-1基因进行靶向敲除,采用小鼠结肠癌模型进行PD-1基因敲除的T细胞的体内抗肿瘤作用及其可能机制研究,采用非人灵长类动物食蟹猴作为实验动物,高度模拟PD-1基因敲除T细胞在体内的安全性评价,以期建立利用CRISPR/Cas9技术靶向T细胞PD-1基因进行肿瘤细胞免疫治疗的策略,进而为临床研究的实施奠定坚实的实验基础。第一章:小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其机制研究第一部分:小鼠PD-1基因敲除T细胞的建立及其体外抑制肿瘤的作用[方法]在GENEBANK数据库中查找获得小鼠PD-1基因序列,设计靶向小鼠PD-1基因的sgRNA,构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体,经扩增、酶切鉴定及测序验证,获得正确的CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体。分离获得小鼠外周血PBMC,富集细胞数量为1×107,加入敲除PD-1基因的PX458敲除载体5μg,采用Lonza-4D电转仪进行电转染,48h后检测转染效率,采用PCR技术和T7E1酶切验证PD-1基因的敲除。体外培养结直肠癌细胞株CT-26,分为:阴性对照组:CT-26细胞组、PD-1基因敲除T细胞组,实验组:CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除的T细胞及PD-1单抗共培养组。绘制各组细胞生长曲线,细胞杀伤检测试剂盒检测PD-1基因敲除的T细胞的杀伤能力,通过流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比例的变化及体外分泌细胞因子的水平变化。[结果]成功获得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表达载体,建立小鼠PD-1基因敲除T细胞,对其体外特性进行检测,结果显示:流式细胞仪检测PD-1基因敲除T细胞CD3、CD4、CD8比例无明显变化;PD-1基因敲除T细胞与结直肠癌细胞株CT-26在不同效靶比作用下体外抑制肿瘤效应结果显示:各组细胞生长曲线示:与其他两组相比,CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组,72小时细胞活率明显下降,与其他两组相比,CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组,与肿瘤细胞共培养后:IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平增加。[结论]建立了稳定的体外定向敲除T细胞抑制性免疫检测点PD-1的技术,获得了小鼠同种异体PD-1基因敲除T细胞,体外实验显示,可抑制肿瘤细胞的生长,为体内抗肿瘤的研究奠定了基础。第二部分:小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及可能机制[方法]培养结直肠癌细胞株CT-26,制备小鼠结直肠癌移植瘤模型;实验分组分别为模型对照组（经尾静脉注射PBS）、阴性对照组（经尾静脉注射未经基因敲除的T细胞）、PD-1基因敲除T细胞组（经尾静脉注射PD-1基因敲除的T细胞）、PD-1单抗组（经尾静脉注射PD-1单抗）,观察结直肠癌移植瘤模型中各组小鼠体重,活动度,生存期等,绘制小鼠生存率曲线;处死各组中小鼠,分别取肝,肺和肠等组织进行病理学分析;分离MLNs、脾脏淋巴细胞,采用流式细胞仪检测MLNs、脾脏CD4+,CD8+T细胞,Treg细胞比例,ELISA法检测MLNs、血清中肿瘤免疫相关细胞因子的分泌水平变化。[结果]与模型对照组相比较,同种异体PD-1基因敲除T细胞可抑制结直肠癌荷瘤小鼠原位移植瘤的生长及向肝脏和肺部的转移,延长了小鼠的存活时间。PD-1基因敲除T细胞回输结直肠荷瘤小鼠,ELISA结果显示,与同模型对照组、阴性对照组相比较,PD-1基因敲除T细胞回输组MLNs和血清中IFN-y,TNF-α和IL-12的水平增加,IL-6无明显变化,IL-17水平减少。在结直肠癌小鼠PD-1基因敲除T细胞回输后,PD-1敲除组小鼠的CD44+CD62L-记忆T细胞比例明显提升,CD4+FoxP3+调节性T细胞比例降低。[结论]同种异体PD-1基因敲除T细胞在结直肠癌中显示出体内抑制肿瘤转移的作用,且可能通过依赖CD8+T细胞在结直肠癌中发挥抗肿瘤作用。第二章:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性评价第一部分:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的建立及其生物学特性[方法]在GENEBANK数据库中搜索食蟹猴PD-1基因序列,设计靶向食蟹猴PD-1基因的sgRNA,构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体,经扩增、酶切鉴定及测序验证,获得正确的sgRNA表达载体;分离培养食蟹猴PBMC,采用Lonza-4D电转仪进行电转染,48h后检测转染效率,采用PCR技术及T7E1酶切鉴定PD-1基因的敲除。在细胞因子刺激下诱导食蟹猴T细胞增殖,定期观察细胞形态变化及集落形成并计数,绘制食蟹猴PD-1基因敲除T细胞生长曲线,FACS检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞周期、凋亡,CCK-8法检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞增殖,以及食蟹猴PD-1基因敲除T细胞表面特征分子的表达,通过ELISA法检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞分泌的IFN-γ、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2水平。[结果]成功获得了靶向食蟹猴PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向食蟹猴PD-1基因的敲除重组表达载体sgRNA/Cas9,成功培养了食蟹猴PD-1基因敲除的T细胞,细胞生长周期为28天,生长曲线呈S形,符合Logistic生长曲线。CCK-8法检测结果显示,与未经敲除PD-1基因的T细胞相比较,PD-1基因敲除的T细胞增殖未受到抑制,生长曲线基本与未经敲除PD-1基因的T细胞相同;流式细胞仪检测T细胞表型无改变,具有杀伤性作用的CD8+T细胞所占比例有所升高;细胞周期及凋亡检测结果显示:与未经敲除PD-1基因的T细胞相比较,PD-1基因敲除的T细胞G0/G1期,S期,G2/M期比例两者无统计学差异,早期凋亡、死亡细胞比例两者无统计学差异。ELISA法对细胞因子IFN-γ、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2进行检测,结果显示:PD-1基因敲除的T细胞释放细胞因子与相同培养条件下,未进行PD-1敲除的T细胞释放细胞因子量统计学无差异。[结论]抑制性检查点基因PD-1的破坏导致PD-1表达的降低,但在体外培养期间不影响PD-1基因敲除T细胞的活力、PD-1基因敲除T细胞特征标志物的表达、PD-1基因敲除T细胞凋亡和PD-1基因敲除T细胞周期,且扩增的PD-1基因敲除T细胞也不影响具有细胞因子表达的能力,为其体内安全性评价奠定基础。第二部分:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性评价[方法]多次富集PD-1基因敲除T细胞后,经静脉回输入食蟹猴体内,参照人细胞因子诱导的淋巴细胞回输有效剂量（2×107/kg）,溶解于100ml 0.9%氯化钠注射液中,对照组经静脉注射100ml/（kg·次）0.9%氯化钠注射液,每3d上午同一时间给药1次,共给药3次,分别在回输后4h,24h,48h,1w,2w,3w,4w直到100天抽取外周血,流式细胞仪检测CD3,PD-1的表达,观察各组食蟹猴体重,活动度等一般情况,监测血常规、血生化,ELISA法检测各组食蟹猴Th1:IL-2、IL-12、IFN-γ;Th2:IL-4、IL-10;炎症细胞因子:TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子水平的变化,并分别取肝、肺、骨髓、脾脏、胸腺、甲状腺、垂体、肾上腺、睾丸等组织进行病理学分析,观察其毒性反应。[结果]将PD-1基因敲除的T细胞回输到食蟹猴体内,PD-1基因敲除的T细胞未显示出对其体重、活动度等一般情况的影响,血液学检查指标:白细胞数、单核细胞数与对照组相比,均未出现明显变化;生化学检查指标:总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、谷草转移酶、谷丙转移酶、尿素氮、肌酐等与对照组相比,均未出现明显变化;组织病理学分析显示没有与输注的PD-1基因敲除T细胞相关的损伤;流式细胞术监测外周血中PD-1基因敲除的T细胞的体内持久性为两个月。[结论]我们的研究结果证明了食蟹猴用于评估PD-1基因敲除T细胞免疫治疗安全性的效用,并为基于T细胞的过继免疫治疗提供了新的策略。
张超亭,陆哲明[2]（2021）在《个体化肿瘤特异TCR的筛选策略》文中研究表明基因修饰T细胞疗法在肿瘤治疗领域取得突破性进展,主要包括嵌合抗原受体基因修饰T（chimeric antigen receptor engineered T,CAR-T）细胞和T细胞受体基因修饰T（T-cell receptor modified T,TCR-T）细胞。虽然CAR-T细胞疗法在血液系统肿瘤治疗领域呈现良好的临床治疗效果,但CAR-T细胞仅能识别肿瘤细胞膜抗原（占细胞全部抗原的比例约10%）,而TCR-T细胞可以识别人白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）提呈的细胞内抗原,因此TCR-T细胞可以识别更多种类的肿瘤抗原,进而实现对CAR-T细胞的合理补充。由于TCR-T细胞需要同时识别细胞内抗原和对应的HLA,而不同患者的HLA分型和表达的肿瘤抗原都可能存在巨大差异,因此有必要为每个/每类肿瘤患者定制个体化的TCR-T细胞,其中的关键为筛选特异识别肿瘤抗原的TCR。当前主要有筛选靶向"已知"肿瘤抗原TCR和筛选靶向"未知"肿瘤抗原TCR的两种策略,但其各有适用性,应针对每个患者制定适合的筛选方法,以制备多种肿瘤特异性TCR-T细胞,从而实现个体化TCR-T细胞的肿瘤治疗。
宋晓萍[3]（2021）在《七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究》文中指出本实验室前期从七鳃鳗组织中分离纯化一种选择性识别并杀伤肿瘤细胞的免疫蛋白LIP（Lamprey Immune Protein）,其具有凝集素结构域（Jacalin＿like）和气单胞菌溶素结构域（Aerolysin correlation）,LIP蛋白通过识别乳腺癌细胞（MCF-7）膜表面Neu5Gc唾液酸修饰的糖型结构靶向肿瘤细胞,在细胞膜表面沉积进而杀伤肿瘤细胞。由于正常细胞表面没有Neu5Gc修饰的糖型结构,因此LIP蛋白对正常组织细胞（MCF-10A）没有较强或者很少的识别、结合和杀伤效果。肺癌是我国以及国际范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,晚期肺癌主要依靠药物治疗,在治疗过程中对正常细胞也产生杀伤作用等一系列药物副作用。由于药物副作用的存在使得肺癌治疗药物的选择成为临床医生的关注点之一,所以探究LIP对小细胞肺癌和非小细胞肺癌的识别和杀伤作用并揭示其作用机制至关重要。首先,使用LIP蛋白筛查23株不同组织来源的肿瘤细胞系,LIP对各组织来源的肿瘤细胞系有不同的识别能力和杀伤作用,说明LIP对肿瘤细胞杀伤具有特异性选择和一定的广谱性,而对正常组织细胞无结合和杀伤作用。通过高内涵成像分析系统和乳酸脱氢酶（LDH）方法检测LIP对人小细胞肺癌NCI-H446、人肺鳞癌细胞NCI-H520、人肺腺癌A549和正常肺上皮细胞L132的杀伤情况,细胞死亡率结果表明随着LIP浓度的增加,NCI-H446、NCI-H520、A549细胞的活力降低。A549细胞死亡率最低,为26.7%;NCI-H520细胞的死亡率最高,为61.3%。和临床常用的化疗药物顺铂,紫杉醇,5-Fu尿嘧啶比较,低剂量的LIP蛋白也可以达到高剂量化疗药物的杀伤效率,使细胞微团塌陷,破碎,不再聚集成团。同时发现LIP蛋白除单独应用对肿瘤细胞有作用外,与顺铂联合用药处理肿瘤细胞更能增加其对肺癌细胞的杀伤效果,随着浓度的增加,杀伤效率增加。细胞迁移实验结果显示,LIP显着抑制三种肺癌细胞的迁移,相反,它并没有抑制L132细胞的迁移。通过荧光探针、免疫荧光结合共聚焦显微镜对线粒体,内质网及细胞骨架进行观察,结果显示LIP促使肺癌细胞线粒体变短并皱缩成球形,线粒体数量明显减少,荧光消失;LIP引起内质网肿胀和损伤,导致空泡化,严重破坏细胞稳态,使细胞内容物外泄导致凋亡;LIP造成肺癌细胞骨架系统瓦解,微管解聚。采用Annexin V-FITC方法检测LIP对肺癌细胞凋亡的影响,结果显示LIP促使三种肺癌细胞磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）外翻。流式细胞术实验结果显示,2μM和4μM LIP处理L132细胞24 h后,细胞处于相对稳定状态。相同剂量LIP处理NCI-H446、NCI-H520、A549细胞24 h后,细胞凋亡率明显增高。同时,LIP破坏线粒体,降低线粒体膜电位。从共聚焦显微镜图像可以看出,LIP处理的三种肺癌细胞的活性氧（ROS）水平高于未处理的对照组,说明LIP介导肿瘤细胞的破坏与活性氧有关。为了探究LIP诱导肺癌细胞凋亡的机制,LIP处理NCI-H446、NCI-H520和A549细胞后,通过免疫印迹检测PARP1、GRP94、Bip、Caspase-12、Caspase-3、CHOP和p21的表达均显着上调且呈时间和剂量依赖性,明确内质网诱导的凋亡依赖于IRE-1、ATF-6和PERK通路,导致下游CHOP表达上调。在内质网应激抑制剂4-PBA作用48h后,PARP1、GRP94、Bip、Caspase-12、Caspase-3、CHOP和p21的表达水平显着降低。总之,七鳃鳗免疫蛋白LIP通过内质网应激信号通路介导肺癌细胞凋亡。本文建立肺癌小鼠荷瘤模型并在细胞瘤处直接注射LIP蛋白,能显着延缓肿瘤生长速度,肿瘤组织明显缩小,但是对小鼠正常组织细胞没有明显的副作用。通过免疫组化实验检测发现,LIP可以选择性识别人肺癌组织样本,而对癌旁组织无识别效果。
杜杨[4]（2021）在《肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的表型鉴定及不同亚群表达差异的研究》文中认为目的:明确肿瘤浸润淋巴细胞（TILs:Tumor Infiltrating Lymphocytes）在肝癌中存在的表型,比较不同亚群淋巴细胞在肝癌中的表达差异,找出肿瘤组织相对于癌旁组织中存在明显差异的淋巴细胞亚群。内容:1.用流式细胞仪检测鉴定出肝癌中肿瘤浸润淋巴细胞的表型。2.分析各淋巴细胞亚群在肝癌标本淋巴细胞中的表达比例。3.统计分析找出具有差异表达的亚群。4.对研究TILs功能的实验思路及一些初步工作。方法:1.收集临床已经确诊的肝癌手术标本76例、肝癌癌旁组织及血液后提取各类标本的淋巴细胞,采用流式细胞术的方法检测淋巴细胞的不同表型。2.统计各种淋巴细胞在肿瘤、癌旁及血液中的表达比例,以平均值±标准差（单位:%）的方式呈现数据。3.应用SPSS进行统计分析,比较TILs中各种细胞亚型的表达在肿瘤、癌旁及血液中的差异,找出可能具有临床意义的细胞亚群。4.在个体水平上,进行小鼠肝癌模型构建,提取小鼠的肿瘤浸润的淋巴细胞,分选出差异亚群的TILs。结果:1.在肿瘤浸润淋巴细胞中,检测出以下几种表型的细胞:CD3+CD56+NKT细胞,CD3-CD56+NKG2D+NK细胞,CD3-CD56+NKp30+NK细胞,CD3-CD56+NKp46+NK细胞,CD3-CD56+CD158a+NK细胞,CD3-CD56+CD158b+NK细胞,CD3-CD56+CD158e+NK细胞,CD3+CD8+T细胞,CD3+CD8+CCR7+CD45RA+T细胞,CD3+CD8+CXCR5+T细胞,CD3+CD8+IFN-γ+T细胞,CD3+CD4+T细胞,CD3+CD4+CCR7+CD45RA+T细胞,CD3+CD4+IL-17A+T细胞,CD3+CD4+IFN-γ+T细胞,CD3+CD4+CXCR5+T细胞,CD4+CD25hiCD127lowT细胞,CD4+CD25hiFoxp3+T细胞,CD4+CD25hiHelios+T细胞。2.以表格形式汇总了各细胞亚群在肿瘤、癌旁及血液中的表达比例,以平均数±标准差的形式呈现数据。3.肿瘤组织相对于癌旁高表达CD4+CD25hiHelios+Treg细胞（P<0.05）。4.肝癌造模小鼠20天后处死观察肝癌造模结果,有成瘤现象,可取出肿瘤组织提取TILs,收集足够量的TILs用于研究观察对小鼠肝癌肿瘤影响。结论:1.鉴定了肿瘤浸润淋巴细胞中十分重要的T细胞和NK细胞的各种表型,共检测出19种表型的细胞存在。2.记录并比较各种淋巴细胞亚群的表达比例,并且统计发现肿瘤组织相对于癌旁组织高表达CD4+CD25hiHelios+Treg细胞（P<0.05）。3.研究差异表达的淋巴细胞亚群的功能可以更好的服务于肿瘤的免疫治疗,为临床工作的开展作出基础的工作。
张知云[5]（2021）在《电针足三里激活迷走神经调控乳腺癌小鼠炎性水平和抗肿瘤免疫功能的研究》文中提出研究背景炎性水平和免疫功能与肿瘤的发生发展密切相关,而作为促进肿瘤进展的重要危险因素,炎性因子能通过多种机制抑制荷瘤机体的抗肿瘤免疫应答,其中一种方式是诱导髓系免疫抑制细胞（myeloid-derived suppressive cells,MDSC）的大量扩张和激活,不同程度地破坏CD8+T细胞和自然杀伤（naturalkiller,NK）细胞的增殖、迁移和活化。减轻荷瘤机体的炎性水平以解除免疫抑制状态进而增强抗肿瘤免疫功能已成为肿瘤治疗的重要策略。针灸对多种免疫效应分子和细胞具有良好的调控作用,能有效增强机体的免疫功能。此外,针灸干预能减轻过度的炎性反应,在多项炎性疾病的临床研究中均显示出良好疗效。有关针灸抗炎效应机制的研究表明,激活迷走传出神经抑制过度产生的炎性因子是电针足三里发挥抗炎作用的重要途径。研究目的及意义探索电针足三里能否通过迷走传出神经抑制荷瘤小鼠的炎性水平,减轻免疫抑制状态,增强抗肿瘤免疫功能,减缓肿瘤的进展,为扩大针灸在肿瘤的临床应用提供一定的科学依据。研究方法第一部分:将雌性BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型组和电针组,在模型和电针组小鼠右侧第二乳垫下注射4T1-luc2小鼠乳腺癌细胞制备原位乳腺癌模型,对电针组小鼠的双侧足三里行电针干预（0.1 mA,2/15 Hz,30 min）,隔日一次。使用游标卡尺测量并计算肿瘤体积;采用活体成像技术在体检测瘤体的位置、面积和荧光强度;电针干预结束后取出瘤体和脾脏称重比较,以整体观察小鼠的肿瘤生长情况。第二部分:采用MSD多因子和Western Blot技术检测实验小鼠血清和肿瘤局部组织内炎性细胞因子肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor,TNF）-α、白细胞介素（interleukin,IL）-1β和IL-10的含量,同时采用HE染色观察荷瘤小鼠肿瘤局部组织内的炎性浸润情况,以观察电针对乳腺癌模型小鼠的抗炎作用。第三部分:采用流式细胞术分析实验小鼠外周血、脾脏和肿瘤局部组织内的抗肿瘤免疫细胞CD8+T细胞和NK细胞的比例,同时采用Western Blot技术分析肿瘤局部组织内穿孔素和颗粒酶B的蛋白表达水平,以评价荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫功能。第四部分:采用流式细胞术分析实验小鼠外周血、脾脏和肿瘤局部组织内免疫抑制细胞MDSC的比例,采用Western Blot技术分析肿瘤局部组织内环氧合酶-2（Cyclooxygenase 2,COX-2）和精氨酸酶-1（Arginase-1,Arg-1）的蛋白表达水平;此外,分离正常小鼠的脾T细胞与模型组和电针组荷瘤小鼠的脾MDSC进行体外共培养,采用CellTrace Far Red检测T细胞的增殖水平,流式细胞术分析CD25分子的表达量以显示T细胞的活化水平,以分析荷瘤小鼠体内的免疫抑制状态。第五部分:共包括三个部分。实验一验证了电针足三里对荷瘤小鼠迷走传出神经的作用:首先采用荧光免疫组织化学技术对荷瘤小鼠脑干迷走神经背核（dorsal motor nucleus of vagus,DMV）内胆碱乙酰转移酶（Choline acetyltransferase,ChAT）阳性神经元的c-Fos进行标记,观察迷走传出神经元的激活水平;其次,采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠血浆和肿瘤局部组织内乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）的水平,以反映迷走传出神经被激活后的效应。实验二观察了激活α7nAchR对乳腺癌模型小鼠免疫功能与炎性反应的作用:将正常和乳腺癌模型小鼠随机分为正常对照组,二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO）组和 PNU-282987 组,对 DMSO 组小鼠腹腔注射DMSO,PNU-282987组小鼠腹腔注射选择性α7亚型烟碱受体（α7 subunit ofthe nicotinic acetylcholine receptors,α7nAchR）激动剂 PNU-282987（0.1 mg/kg）,隔日注射一次,游标卡尺测量并计算肿瘤体积,并进行活体成像检测,干预结束后取出脾脏和瘤体称重;MSD多因子技术检测外周血和肿瘤局部组织内炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-10的含量;流式细胞术分析外周血和脾脏内的CD8+T细胞、NK细胞和MDSC的比例。实验三采用了膈下迷走神经切断术进行了反向验证:对小鼠行膈下迷走神经切断术或假手术后接种4T1-luc2细胞制备原位乳腺癌模型,再随机分为手术-模型组（VNX）、手术-电针组（VNX-EA）、假手术-模型组（sVNX）和假手术-电针组（sVNX-EA）,对VNX-EA和sVNX-EA组小鼠双侧足三里行电针干预,干预结束后对小鼠进行活体成像检测并取出瘤体和脾脏称重,采用流式细胞术分析各组小鼠外周血和脾脏内的CD8+T细胞、NK细胞和MDSC的比例。研究结果第一部分:电针足三里可有效减缓乳腺癌模型小鼠肿瘤的进展。接种4T1-luc2细胞的第18天,电针组小鼠的肿瘤体积开始低于模型组（P<0.05）,且持续到接种后第22天（P<0.05）;活体成像结果显示,与模型组小鼠相比,电针组小鼠瘤体的成像面积减小,荧光强度降低（P<0.05）,重量明显减轻（P<0.01）。此外,荷瘤小鼠出现明显脾肿大,而电针组小鼠脾肿大程度较模型组减轻（P<0.01）。第二部分:电针足三里减轻了乳腺癌模型小鼠系统性和肿瘤局部炎性水平。荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10的含量均显着上升（P<0.001）,电针干预后,小鼠血清（P<0.01）和肿瘤局部组织（P<0.05）中促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的水平降低,抗炎性细胞因子IL-10无明显变化（P>0.05）。HE染色结果显示,电针组小鼠肿瘤局部的炎性浸润情况较模型组减轻。第三部分:电针足三里对乳腺癌模型小鼠的抗肿瘤免疫细胞具有明显的促进作用。荷瘤小鼠外周血和脾脏内CD8+T细胞和NK细胞的比例均显着降低（P<0.001）,电针干预后,外周血、脾脏和肿瘤局部组织内CD8+T细胞（外周血,P<0.01;脾脏,P<0.05;肿瘤局部组织,P>0.05）和NK细胞（P<0.05）的比例均升高。此外,电针组小鼠肿瘤局部组织内穿孔素（P<0.05）和颗粒酶B（P<0.01）的蛋白表达水平较模型组明显增高。第四部分:电针足三里能有效抑制乳腺癌模型小鼠的MDSC。荷瘤小鼠外周血、脾脏和肿瘤局部组织内出现大量MDSC（P<0.001）,电针干预后,小鼠外周血（P<0.05）、脾脏（P<0.001）和肿瘤局部组织内（P<0.05）MDSC的比例均明显降低,MDSC的扩张程度减轻。此外,电针组小鼠肿瘤局部组织中COX-2（P<0.05）和Arg-1（P<0.05）的蛋白表达水平明显低于模型组。体外共培养结果显示,相比较与模型组小鼠MDSC共培养的T细胞,与电针组小鼠MDSC共培养的T细胞增殖和活化的程度升高（P<0.05）。第五部分:迷走传出神经参与了电针足三里对乳腺癌模型小鼠炎性水平与免疫功能的调控作用。实验一中,荷瘤小鼠脑干DMV区ChAT+神经元的c-Fos表达量在电针干预后显着增多,血浆和肿瘤局部组织内ACh的水平也明显升高。实验二中,从肿瘤生长情况来看,相比于DMSO组,PNU-282987组小鼠肿瘤生长速度减慢（P<0.05）,瘤体的成像面积和荧光强度降低（P<0.05）;多因子检测结果显示,相比于DMSO组,PNU-282987组小鼠血清TNF-α和IL-1β的含量明显降低（P<0.05）,IL-10无明显变化（P>0.05）;在肿瘤局部组织内,PNU-282987 组小鼠 TNF-α 和 IL-1β 的含量无明显变化（P>0.05）,IL-10 的含量明显升高（P<0.05）;流式细胞术结果显示,相比于DMSO组,PNU-282987组小鼠脾脏内的CD8+T细胞比例回升（P<0.05）,NK细胞比例无明显变化（P>0.05）,同时,外周血和脾脏内MDSC的比例降低（P<0.05）。实验三中,对实验小鼠行膈下迷走神经切断术或假手术后,相比于sVNX组,sVNX-EA组小鼠的瘤体成像面积缩小,荧光强度降低（P<0.05）,瘤体（P<0.05）和脾脏（P<0.01）的尺寸减小,重量减轻;外周血和脾脏内CD8+T细胞和NK细胞的比例升高,MDSC的比例下降。而相比于VNX组,VNX-EA组小鼠瘤体的成像面积、荧光强度、瘤体和脾脏的尺寸及重量、外周血和脾脏内的CD8+T细胞、NK细胞以及MDSC的比例均无明显改变。研究结论电针足三里可能通过激活迷走传出神经,减轻荷瘤小鼠系统性和肿瘤局部的炎性水平,促进CD8+T细胞和NK细胞的比例和细胞杀伤功能,同时降低MDSC的比例和免疫抑制水平,增强荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫功能,减缓肿瘤的生长。
吉国锋[6]（2021）在《生物可降解高分子免疫植入器件用于结直肠癌术后免疫治疗研究》文中研究表明结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是消化道常见的恶性肿瘤之一,手术切除是治疗结直肠癌首选也是最有效的方案。但对于中晚期结直肠癌,由于癌肿浸润广泛,手术无法达到根治性切除,或者手术时已经发生远处转移,局部残留肿瘤细胞和远端转移灶肿瘤细胞在术后继续生长引起肿瘤复发和转移,是导致手术失败和患者死亡的主要原因。全身系统性化疗和放射治疗是预防中晚期结直肠癌术后局部复发和远处转移的重要治疗措施。然而考虑到患者术后体质较弱,需要一定时间的恢复期,加之切口愈合等因素,一般至少在术后2～3周方可进行全身化疗和放疗。在这一时期,往往错过了消灭残留肿瘤细胞的最佳时机,而且这个间隙也为肿瘤的复发创造了早期条件。因此,寻找更佳的术后治疗措施来解决进展期结直肠癌术后复发和转移仍是目前临床最亟待解决的术后难题。近年来,多种肿瘤免疫疗法被证实可以有效杀灭肿瘤并可预防肿瘤复发,但在实体瘤治疗方面,肿瘤免疫治疗面临诸多挑战,如免疫治疗响应性低,免疫药物耐药,非肿瘤靶向分布（on-target but off-tumor）,毒副作用大等。近年来有研究发现,通过在肿瘤内/附近局部缓释免疫药物能够较好的解决上述难题,而且安全性更高。对于结直肠癌,在肿瘤切除过程中,外科医生有独特的直接接触肿瘤机会,因此,原位（肿瘤切除部位）免疫治疗可能是一种很有前途的术后预防肿瘤复发和转移的策略。近年来基于生物高分子材料的肿瘤局部免疫治疗彰显了巨大治疗潜力,包括可植入支架、可注射水凝胶和原位形成的水凝胶等,这种局部免疫治疗可产生全身抗肿瘤免疫效果,甚至达到治愈的效果。这种易于装载、可降解和控制缓释特性,使基于生物可降解高分子免疫植入器件的局部免疫疗法成为肿瘤切除术后免疫治疗一种有前途的策略和途径。基于此,我们设计了一种由4臂氨基聚乙二醇（4-arm poly（ethylene glycol）amine,4臂PEG-NH2）和氧化葡聚糖（oxidized dextran,ODEX）交联得到的支架材料,并在材料制备过程中分别装载瑞喹莫德（Resiquimod,R848）和抗OX40抗体（CD134,anti-OX40 antibody,aOX40）,制备了生物可降解高分子免疫植入器件用于进展期结直肠癌术后免疫治疗。目的:借助于在结直肠癌手术中外科医生有独特的直接接触肿瘤机会,设计一种生物可降解高分子免疫植入器件用于进展期结直肠癌术后免疫治疗,以期解决结直肠癌术后复发和转移的难题。方法:（1）制备空白植入器件:用不同质量比的4臂PEG-NH2与ODEX交联,通过醛基与氨基的席夫碱反应（Schiff base reaction）形成交联网格的水凝胶,冻干后得到生物可降解高分子植入器件。并分别测试不同质量比制备的植入器件的强度和粘附性,根据测试结果选择最佳的质量比;（2）植入器件的表征:测试最佳质量比条件下制备的植入器件在体内和体外的降解情况;（3）制备免疫植入器件:将瑞喹莫德（R848）和抗OX40抗体（aOX40）担载到植入器件中,并测试其缓释效果;（4）验证免疫植入器件杀灭残留肿瘤效果:构建BALB/c小白鼠皮下不完全切除肿瘤模型,术中将免疫植入器件埋植到肿瘤切除后的残腔内,监测并记录残留肿瘤生长情况;并分析植入术后第3天和第10天残留肿瘤免疫微环境改变;（5）验证经免疫植入器件治疗后建立的肿瘤特异性免疫记忆效应:皮下不完全切除肿瘤模型中经免疫植入器件治愈的小鼠,再次进行肿瘤复种挑战实验,监测并记录复种肿瘤生长情况;并分析系统性免疫微环境（脾脏）的改变;（6）验证经免疫植入器件治疗后激活了全身系统性免疫反应（远端效应）:建立小鼠皮下双侧肿瘤模型,将免疫植入器件埋植入到其中一侧肿瘤腔内,然后监测并记录对侧肿瘤生长情况;并分析对侧肿瘤免疫微环境改变;结果:（1）当4臂PEG-NH2与ODEX的质量比为1:1时,交联形成的植入器件同时拥有较大的强度和较好的组织粘附性;在体外,植入器件降解时间大于9天;在体内,其降解时间大于21天;（2）R848和aOX40抗体被成功装载到植入器件中,并且能够随着植入器件的降解而同步缓慢释放,R848和aOX40抗体的释放时间均长于9天;（3）在皮下不完全切除肿瘤模型中,术中在肿瘤切除残腔中埋入免疫植入器件,可以根除残留肿瘤,而且治疗组所有小鼠在150天的观察期内均无肿瘤复发。残留肿瘤免疫微环境分析结果显示:在术后第3天,固有免疫被迅速激活,自然杀伤细胞（Nature killer cells,NK细胞）的浸润增多,树突状细胞（Dendritic cells,DCs）的活化增强,随后适应性免疫被激活,肿瘤内T细胞浸润数量显着增加（第10天）;（4）在小鼠对侧皮下复种肿瘤挑战模型中,结果显示经免疫植入器件治愈的小鼠能抵抗该挑战,再次在对侧皮下种瘤后,所有小鼠均未成瘤;全身系统性免疫分析结果显示:脾脏内记忆T细胞数量显着增多;（5）在构建的小鼠皮下双侧肿瘤模型中,将免疫植入器件植入到其中一侧肿瘤腔后,对侧肿瘤的生长得到了显着的抑制;对侧肿瘤免疫分析结果显示:对侧肿瘤内浸润T细胞数目也显着增多。结论:（1）我们设计了一种简单并易于操作的结直肠癌术后免疫治疗策略和方法,即将合成的治疗性的生物可降解高分子免疫植入器件植入到肿瘤切除腔内,通过协同激活固有免疫、适应性免疫和免疫记忆效应,有效清除术后残余肿瘤细胞和远端转移灶,并且能够防止术后肿瘤复发;（2）我们设计的生物高分子免疫植入器件被证实是术后结直肠癌免疫治疗的合理选择,这种术后免疫治疗管理更具有特异性、更有效、毒性更小,有着巨大临床转化潜能。
王博[7]（2021）在《疏肝化症方治疗三阴性乳腺癌临床疗效及其作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:通过临床回顾性队列研究、荷瘤小鼠体内实验和乳腺癌细胞体外实验,初步探究疏肝化症方治疗TNBC临床疗效及其作用机制,为疏肝化症方的进一步研究提供循证医学和基础研究证据,拓宽其临床应用空间。方法:1.应用回顾性队列研究方法,设立对照组和观察组,比较两组患者近期疗效、肿瘤标志物变化、功能状态改善、远期存活和毒副反应发生情况。2.应用乳腺癌4T1细胞构建小鼠乳腺癌模型,设立对照组及疏肝化症方各剂量组,对比各组小鼠的瘤体体积、食量、体质量变化,观察小鼠肿物的病理形态。3.培养乳腺癌4T1细胞,设立正常对照组和疏肝化症方各剂量组:观察疏肝化症方对4T1细胞形态的影响;细胞计数法检测疏肝化症方对4T1细胞生长数量的影响;MTT比色法检测疏肝化症方对4T1细胞增殖抑制率的影响;划痕实验检测疏肝化症方对4T1细胞侵袭能力的影响;PI染色流式细胞术检测疏肝化症方对4T1细胞周期的影响;Annexin V-PI染色流式细胞术检测疏肝化症方对4T1细胞凋亡的影响;RT-PCR检测疏肝化症方对4T1细胞PI3K/AKT/Bax通路相关基因m RNA表达的影响;Western Blot检测疏肝化症方对4T1细胞PI3K/AKT/Bax通路相关基因蛋白表达的影响。结果:1.与对照组比较,观察组患者近期疗效稳定率、肿瘤标志物（CEA、CA125及CA153）总改善率、功能状态总改善率均显着升高（P<0.05）,而远期存活及毒副反应发生情况未见显着差异（P>0.05）。2.疏肝化症方各剂量组作用荷瘤小鼠一定时间,结果发现:第21d时,0.10、1.00和10.00g/kg剂量组小鼠抑瘤率显着增加（P<0.05或P<0.01）;各剂量组小鼠每日进食量未见显着差异（P>0.05）;第14d和21d时,10.00g/kg剂量组小鼠体质量显着增加（P<0.01）;各剂量组小鼠瘤体较小,其血管逐渐减少、出血及坏死面积逐渐增大,差异显着（P<0.01）;肿瘤细胞的形态逐渐消失,核分裂相逐渐减少,且可观察到显着细胞碎裂。3.疏肝化症方各剂量组作用4T1细胞后一定时间,结果发现:各剂量组细胞体积缩小、凝集和碎裂,且与药物浓度存在依赖关系;各剂量组细胞生长数量:正常对照组>低剂量组>中剂量组>高剂量组,差异显着（P<0.01）;各剂量组细胞增殖抑制率显着增加（P<0.05）,且与药物浓度和时间存在依赖关系;各剂量组细胞划痕修复率显着减少（P<0.05）,且与药物浓度和时间存在依赖关系;中、高剂量组G0/G1期、G2/M期细胞DNA含量显着升高,S期细胞DNA含量均显着降低（P<0.05或P<0.01）,且与药物浓度存在依赖关系;各剂量组早期及晚期凋亡率显着升高（P<0.05或P<0.01）,且与药物浓度存在依赖关系;各剂量组PI3K、Akt、caspase-3和Bax的m RNA表达显着上升,而Bc1-2的m RNA表达显着下降（P<0.05或P<0.01）,且与药物浓度存在依赖关系;各剂量组PI3K和Akt的蛋白表达无显着变化,p-PI3K、p-Akt和Bcl-2的蛋白的表达显着下降,而Bax和caspase-3的蛋白的表达显着上升（P<0.05或P<0.01）,且与药物浓度存在依赖关系。结论:1.疏肝化症方对晚期TNBC患者具有治疗作用,可提高肿瘤近期治疗稳定率,降低肿瘤标志物水平,提升功能状态,且无毒副反应。2.疏肝化症方对乳腺癌荷瘤小鼠具有抑瘤作用,可减缓瘤体生长,破坏瘤体组织结构,提高小鼠体质量,且不影响小鼠进食量。3.疏肝化症方对乳腺癌4T1细胞具有抑制作用,可诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,抑制细胞侵袭能力,其机制可能通过调节PI3K/AKT/Bax信号通路上相关基因来实现。
郭志伟[8]（2021）在《PI3K/AKT/mTOR信号通路在亚砷酸钠联合黄芪甲苷抗肝癌中的作用研究》文中认为临床报告亚砷酸钠（NaAsO2）对肝癌等实体肿瘤的疗效较好,但有毒副作用。研究表明黄芪甲苷（AS-Ⅳ）具有抗癌、抗氧化应激、提升免疫力、保护肝脏等表现。本试验假设NaAsO2联合AS-Ⅳ或能产生协同抑癌的作用。鉴于PI3K/AKT/mTOR信号通路在肝癌等多种肿瘤中被激活,且与细胞增殖、凋亡、分化及自噬有关。论文拟通过HepG2细胞和裸鼠肝癌模型,运用毒理学、组织形态学和分子生物学等方法,以PI3K/AKT/mTOR信号通路及关键调控点为切入点,从体内外多层面（机体、组织、细胞、蛋白、基因水平）系统探究NaAsO2联合AS-Ⅳ的协同抗肝癌作用。第一部分NaAsO2和AS-Ⅳ最佳有效浓度的筛选及其抑制HepG2细胞增殖的转录组学研究（1）采用NaAsO2和AS-Ⅳ处理HepG2细胞,设置0.078、0.156、0.312、0.625和1.250μg/m L五个浓度,作用HepG2细胞24、48、72、96 h,筛选出了NaAsO2的最佳浓度为0.5μg/m L,AS-Ⅳ的最佳浓度为0.8μg/m L,药物联合组采用0.5μg/m L NaAsO2+0.8μg/m L AS-Ⅳ进行研究,时间为72 h。（2）不同处理组（药物组）与对照组基因表达差异分析结果显示,下调基因数量明显高于上调基因,表明NaAsO2和AS-Ⅳ对基因的影响以下调为主,且组间共同表达差异基因为181个,提示不同处理间可能存在共同的作用途径。所有处理组以多细胞生物过程调控、发育过程调控、解剖结构发育等参与生物过程的基因最多。所有处理组富集的集中作用通路主要有细胞因子-细胞因子受体相互作用、铁死亡、造血细胞系、雌激素信号通路等,并在组间还发现PI3K-AKT、FOXO、c AMP、MAPK等多条信号通路均存在显着差异（P<0.05）,提示NaAsO2与AS-Ⅳ主要通过调控癌症相关信号通路发挥抗肝癌作用。第二部分NaAsO2和AS-Ⅳ抑制HepG2肝癌细胞增殖的体外研究（1）本研究采用CCK8法、划痕试验、Transwell试验检测了在NaAsO2和AS-Ⅳ单独及联合使用下HepG2细胞的活性及迁移侵袭能力。除划痕试验显示仅NaAsO2+AS-Ⅳ组细胞迁移能力降低外（P<0.05）,其余试验均显示NaAsO2组、AS-Ⅳ组和NaAsO2+AS-Ⅳ组细胞增殖率、迁移侵袭能力显着下降（P<0.05）,其中NaAsO2+AS-Ⅳ组最为显着,在GNGT1siRNA组,HepG2细胞增殖率升高,迁移侵袭能力增强（P<0.05）。（2）采用流式细胞术检测NaAsO2和AS-Ⅳ单独及联合对HepG2细胞周期及凋亡的影响。结果显示:NaAsO2组、NaAsO2+AS-Ⅳ组及GNGT1siRNA组G0/G1期细胞所占百分比均显着降低（P<0.05）;NaAsO2组、AS-Ⅳ组、NaAsO2+AS-Ⅳ组及GNGT1 siRNA组S期细胞所占百分比均显着增高（P<0.05）。NaAsO2组、AS-Ⅳ组、NaAsO2+AS-Ⅳ组诱导细胞凋亡作用均显着升高（P<0.01）,NaAsO2与AS-Ⅳ联用诱导细胞凋亡的作用显着高于NaAsO2和AS-Ⅳ单独使用（P<0.01）,且NaAsO2诱导细胞凋亡的作用显着高于AS-Ⅳ（P<0.01）。（3）在体外采用免疫荧光、Real time PCR和Western Blot法检测NaAsO2和AS-Ⅳ对PI3K/AKT/mTOR通路关键基因、蛋白（PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR）的影响。结果显示:GNGT1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR在HepG2细胞中均有表达。各药物组GNGT1 m RNA表达量均显着升高（P<0.05）,GNGT1 siRNA组GNGT1 m RNA和蛋白表达量均显着降低（P<0.05）。从整体上看,经NaAsO2和AS-Ⅳ单独及联合处理后,各组细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR表达量明显下降,在抑制上游基因GNGT1后,以上基因蛋白表达均显着升高（P<0.05）,提示GNGT1可能参与了对PI3K/AKT/mTOR通路的调控。从各药物组对目的基因、蛋白的影响看,以NaAsO2+AS-Ⅳ组调控变化最为显着（P<0.05）,呈现出NaAsO2+AS-Ⅳ组>NaAsO2组>AS-Ⅳ组的结果。第三部分NaAsO2和AS-Ⅳ抗肝癌作用的体内研究（1）建立裸鼠肝癌移植瘤模型,分为对照组（即模型组,给予等量生理盐水）、NaAsO2组（30 mg/kg）、AS-Ⅳ组（30 mg/kg）、NaAsO2+AS-Ⅳ组（各15 mg/kg）,给药频率次/3 d,持续25 d。结果显示裸鼠体重无显着变化,而NaAsO2+AS-Ⅳ组瘤体积在第16 d显着减小（P<0.05）,NaAsO2组、AS-Ⅳ组及NaAsO2+AS-Ⅳ组瘤体积在第19 d均显着减小（P<0.05）。（2）采用ELISA法检测了不同处理对裸鼠血清肿瘤标志物AFP、DCP、CEA和TNF-α的影响,结果显示:NaAsO2组、AS-Ⅳ组和NaAsO2+AS-Ⅳ组血清AFP、DCP、TNF-α含量均显着低于对照组（P<0.05）;AS-Ⅳ组和NaAsO2+AS-Ⅳ组血清CEA含量均显着降低（P<0.05）。以上指标在NaAsO2+AS-Ⅳ组降低最为显着（P<0.05）。（3）采用HE和TUNEL染色法观察NaAsO2和AS-Ⅳ对裸鼠肝癌移植瘤的病理组织学影响,结果表明NaAsO2+AS-Ⅳ组的肿瘤细胞核固缩及细胞凋亡最为明显。（4）在体内采用Real time PCR和Western Blot法检测NaAsO2和AS-Ⅳ对PI3K/AKT/mTOR通路关键基因、蛋白的影响,结果显示:NaAsO2组、AS-Ⅳ组和NaAsO2+AS-Ⅳ组PI3K、AKT和mTOR m RNA表达量均显着低于对照组（P<0.05）,其中NaAsO2+AS-Ⅳ组表达量最低。NaAsO2+AS-Ⅳ组PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-mTOR蛋白表达量均显着低于对照组（P<0.05）;NaAsO2组、AS-Ⅳ组和NaAsO2+AS-Ⅳ组GNGT1 m RNA表达量均显着高于对照组（P<0.05）。本研究采用祛邪与扶正中药联合方案进行抗肝癌研究,结果表明NaAsO2与AS-Ⅳ均具有抗肝癌作用。体外研究显示出NaAsO2与AS-Ⅳ联用抑制HepG2细胞的作用显着高于二者单独使用,初步表明二者具有协同抗肝癌作用。体内研究显示低剂量NaAsO2与低剂量AS-Ⅳ联合的抗肝癌作用仍优于其高剂量单独使用,进一步表明二者具有协同抗肝癌作用。PI3K/AKT/mTOR通路关键基因、蛋白（PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR）与致癌性密切相关,体内外研究结果均显示NaAsO2与AS-Ⅳ下调了其表达,表明NaAsO2与AS-Ⅳ可通过PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗肝癌作用,且NaAsO2与AS-Ⅳ联用对目的基因、蛋白的调控作用更为显着,从分子水平表明NaAsO2与AS-Ⅳ存在协同抗肝癌作用,同时提示PI3K、AKT和mTOR可以作为抗肝癌药物的治疗靶点。
李雅[9]（2021）在《靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并抑制肿瘤干细胞特性的研究》文中提出研究目的肝细胞癌（Hepatocellular carcinomα,HCC）是一种高发生率及高死亡率的原发性肝癌。在全球范围内,每年死于肝癌的患者数目超过80万,在各种恶性肿瘤中死亡率位居第一。目前,临床上除手术切除病灶、经导管肝动脉化疗栓塞术及肝移植等治疗手段外,索拉非尼和乐伐替尼是被FDA批准用于治疗晚期HCC的一线化学药物。临床仅不足30%的患者可以手术治疗,而索拉非尼对患者生存期的延长有限,总生存期仅延长2.3～2.7个月。另外,现有的手术、化疗或放疗的治疗方式对肝癌的转移和复发却难以产生有效的抑制作用。因此,探索肝癌的发生发展机制、寻找潜在的干预靶点或治疗手段极为重要。有研究证实,在铂类、蒽环类等化学药物或放射治疗肿瘤时,肿瘤细胞可发生免疫原性死亡,即肿瘤细胞在发生凋亡的同时,由非免疫原性的细胞转变为具有免疫原性的细胞。免疫原性死亡的肿瘤细胞表面高表达钙网蛋白（Calreticulin,CRT）、内质网中蛋白二硫化异构酶（Endoplasmic reticulum resident protein 57,ERp57）、热休克蛋白（Heat shock proteins,HSPs）、高迁移率族迁徙族蛋白B1（High mobility group protein B1,HMGB-1）等特征性的蛋白分子,这些分子能激发机体免疫细胞对肿瘤细胞的识别与攻击。Calreticulin和ERp57等被作为“eat me”信号分子,促进肿瘤细胞对DC的粘附,激活DC的MHC-I抗原呈递信号通路,从而活化CD8+T细胞。肿瘤细胞膜上的糖蛋白CD47由于能抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用,因而被认为是一种“don’t eat me”信号。死亡的肿瘤细胞释放的ATP可通过P2Y2嘌呤受体促进DC的募集被称作“find me”信号分子。细胞在发生免疫原性死亡早期,作为“eat me”信号的calreticulin和ERp57等在大量转移到细胞表面的同时,细胞膜上CD47的表达水平显着性下降,“don’t eat me”信号和“eat me”信号的此消彼长,使得肿瘤细胞能被DC和巨噬细胞有效识别和吞噬。因此,诱导免疫原性肿瘤细胞死亡是抗肿瘤治疗的目标之一,该作用可以通过激活机体免疫系统产生更强而有效的抗肿瘤效应。信号传导及转录激活因子 3（Signal transducer and activator of transcription,STAT）STAT3是STAT家族的重要成员,其在肿瘤组织中的异常持续激活,可介导多种细胞因子和生长因子的信号向细胞核转导,促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭和转移,抑制肿瘤细胞的凋亡,这与恶性肿瘤的发生发展密切相关。约60%的肝癌患者伴有STAT3高表达,并与不良预后呈正相关。我们之前的研究也证明,阻断STAT3可以通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞抑制HCC的增殖;另外,阻断HCC中STAT3信号通路可以明显提高NK细胞介导的抗肿瘤免疫应答;并且,阻断STAT3的HCC可以诱导抗肿瘤免疫记忆、改善肿瘤免疫微环境。然而,该过程是否与免疫原性死亡有关尚未进行深入的研究。Napabucasin是一种口服的针对STAT3和癌细胞多能性的抑制剂,可下调STAT3驱动的干细胞基因表达和自我更新能力,并诱导细胞死亡。Li等在体内外证实,Napabucasin通过阻断STAT3信号抑制胰腺癌、咽鳞癌、结直肠癌等肿瘤干性特征,进一步影响肿瘤的复发和转移。在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中,Napabucasin针对胰腺癌、结肠癌、卵巢癌等多种转移性实体瘤疗效显着,控制率均达到80%以上。然而,Napabucasin对肝癌的治疗是否有效尚未见报道。鉴于STAT3在肝癌发生发展中的重要作用,我们推测Napabucasin有望应用于肝癌的治疗。因此,本研究利用携带STAT3-shRNA的慢病毒和新型小分子抑制剂Napabucasin阻断肝癌细胞中STAT3信号通路,在体内外模型中观察其是否可以诱导肝癌细胞免疫原性死亡,并深入阐述其作用机制;进一步,系统评价了Napabucasin对肝癌干细胞特征的影响。该研究为肝细胞癌的治疗提供了有潜力的靶点,也为Napabucasin对肝癌治疗的临床应用提供良好的实验依据。研究方法1.利用携带STAT3-shRNA的慢病毒感染Huh7和HepG2.2.15肝癌细胞系,48h后使用RT-qPCR技术检测细胞内STAT3的mRNA水平,其中挽救实验使用携带STAT3-WT和STAT3-Y705F的慢病毒感染STAT3干扰组细胞;CCK-8和Annexin-V/PI标记分别检测细胞的增殖和凋亡;流式细胞术检测细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70、HSP90 和 CD47 的表达变化;ELISA 检测细胞培养上清中ATP的分泌水平。2.从健康志愿者外周血中分离单个核细胞,诱导形成未成熟的hDC,与Huh7和HepG2.2.15细胞共孵育48h后,流式细胞术检测hDC细胞表面CD80和CD86的表达变化。3.使用PMA诱导THP-1形成贴壁巨噬细胞,并进行CM-Dil染料进行标记,与CFSE标记的肝癌细胞共孵育2小时后,流式细胞术检测巨噬细胞对肝癌细胞的吞噬情况。4.利用 western bloting 检测 Huh7 和 HepG2.2.15 细胞中 STAT3/p-STAT3、PKR/p-PKR、eIF2α/p-eIF2α 的表达水平;IP 和 GST pull-down 实验观察 STAT3与PKR的结合作用。5.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中STAT3与CD47表达水平的相关性;从JASPAR数据库获取分析CD47的启动子序列,进一步应用ChIP实验鉴定STAT3是否直接与CD47的启动子序列结合。6.不同浓度的2-DG处理Huh7和HepG2.2.15细胞0-72h,CCK-8检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞表面calreticulin和CD47的表达变化。7.应用Seahorse XF24细胞能量代谢分析仪检测Huh7和HepG2.2.15细胞的糖酵解水平。8.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中HIF-1α、GLUT1、HK2和LDHA的表达水平及与病人生存期的相关性;分析肝癌患者癌组织中STAT3与HIF-1α、LDHA表达水平的相关性。9.应用RT-qPCR技术检测Huh7和HepG2.2.15细胞中糖酵解相关分子HIF-1α、GLUT 1、HK2 和 LDHA 的 mRNA 水平。10.TCGA数据库分析肝癌患者癌组织中GLUT1与CD47表达水平的相关性;从JASPAR数据库获取分析GLUT1的启动子序列,进一步应用ChIP实验观察STAT3是否直接与GLUT1的启动子序列结合。11.以人肝癌细胞系Huh7、HepG2和HepG2.2.15,以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6 为研究对象,CCK-8 检测 Napabucasin、Cryptotanshinone 和 Oxaliplatin处理上述肝癌细胞系48h后的细胞活力。12.Napabucasin 处理 Huh7、HepG2.2.15 和 Hepa1-6 细胞 12h 后,western bloting检测细胞中STAT3/p-STAT3Tyr705的水平;PI标记分析细胞周期;Annexin-V/PI标记检测细胞凋亡情况;Hoechst标记观察细胞核固缩情况;RT-qPCR技术检测肿瘤干性相关的分子Nanog、Sox-2、Klf4和OCT4的mRNA水平;细胞集落形成实验和细胞成球实验分别检测细胞集落形成抑制率和细胞成球率。13.Napabucasin 处理 Huh7、HepG2.2.15 和 Hepa1-6 细胞球后,RT-qPCR 技术检测肿瘤干性相关的分子Nanog、Sox-2、Klf4和OCT4的mRNA水平;JuLITM Stage实时检测细胞球形态;CCK-8检测细胞球活力。14.应用 RT-qPCR技术检测 HepG2.2.15 细胞中 HBx、HBc 和 HBs/p 的 mRNA水平。15.Napabucasin 处理 Huh7、HepG2.2.15 和 Hepa1-6 细胞后,Seahorse XF24细胞能量代谢分析仪检测细胞糖酵解水平;流式细胞术检测细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90的表达变化;与DC共孵育48h后,流式细胞术检测DC表面CD80、CD86、CD40和MHC Ⅱ的表达变化。16.利用携带STAT3-shRNA的质粒转染小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞,48h后使用RT-qPCR技术检测细胞内STAT3的mRNA水平;流式细胞术检测细胞表面 calreticulin、ERp57、HSP70、HSP90 和 CD47 的表达变化。17.从C57BL/6J小鼠骨髓中分离骨髓细胞,诱导培养形成未成熟的mDC,与Hepa1-6细胞共孵育48h后,流式细胞术检测mDC细胞表面CD80、CD86、CD40和MHC Ⅱ的表达变化。18.使用Hepal-6细胞构建C57BL/6J肝脏原位移植瘤小鼠模型,于2周后腹腔注射20mg/kg的Napabucasin,每2天一次,连续治疗8次;分离小鼠肝脏的肝细胞,流式细胞术检测CD95和PD-L1表达水平;分离小鼠肝脏中浸润的淋巴细胞,流式细胞术分析巨噬细胞、DC和CD8+T细胞的浸润量及活化水平。19.使用Hepa1-6细胞构建C57BL/6J皮下移植瘤小鼠模型,第5天开始给予药物治疗,每2天给予小鼠腹腔注射20mg/kg的Napabucasin,连续8次。随后,将小鼠分为两组,一组小鼠剥离其皮下肿瘤,并于1周后在另一侧皮下注射Hepa1-6细胞观察肿瘤复发情况,另一组小鼠用于生存期观察。20.对剥离的小鼠皮下移植瘤组织进行免疫荧光组织化学检测,分析calreticulin、ERp57、CD47和GLUT1的表达水平;分离皮下移植瘤中的肿瘤细胞,流式细胞术检测Ki67、CD95和PD-L1表达水平;RT-qPCR技术检测Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平。21.分离小鼠皮下移植瘤中浸润的淋巴细胞,流式细胞术分析巨噬细胞和DC等抗原呈递细胞的浸润量及活化情况;流式细胞术分析CD4+T和CD8+T细胞的浸润量及免疫抑制功能状态。22.对Hepa1-6细胞构建的皮下移植瘤小鼠模型,第12天皮下形成明显肿瘤块时给予腹腔注射Napabucasin治疗,每2天一次,连续治疗8次。随后,剥离小鼠皮下移植瘤组织分别进行HE和Tunel染色分析肿瘤病理和细胞凋亡情况;分离皮下移植瘤中肿瘤细胞,RT-qPCR技术检测Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平;分离皮下移植瘤中浸润的淋巴细胞,流式细胞术分析CD8+T和NK细胞的浸润量及活化情况。研究结果1.靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡干扰人肝癌细胞系Huh7、HepG2.2.15以及小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞中STAT3信号通路可以显着性抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,同时促进calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90等“eat me”信号分子的膜转移,促进ATP向细胞外的释放。另外,干扰肝癌细胞中STAT3信号通路可以促进其对DC的活化作用,增加DC表面CD80和CD86的表达。我们观察到“don’t eat me”信号分子CD47在肝癌患者肿瘤组织中高表达,并与STAT3的表达水平呈正相关;CHIP实验证实,STAT3可通过与CD47的启动子区域结合直接调控CD47的转录与表达。因此,干扰肝癌细胞中STAT3信号通路可降低CD47在细胞表面的表达,促进巨噬细胞对其的吞噬。2.STAT3通过与PKR形成复合物调控免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化STAT3通过与eIF2α的上游调节分子PKR结合形成STAT3-PKR复合物,从而调节游离的PKR及其磷酸化水平,进一步调控eIF2α的磷酸化水平。干扰STAT3在Huh7和HepG2.2.15细胞的表达,可以减少STAT3-PKR复合物的形成,使游离的PKR及pPKR增多,从而促进免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化。3.STAT3通过调控糖酵解关键酶-GLUT1抑制HCC免疫原性死亡与正常组织相比,肝癌患者肿瘤组织中糖酵解关键酶HIF-1α、GLUT1、HK2表达水平明显升高,且癌组织中高表达GLUT1、HK2和LDHA的肝癌患者往往伴随着生存期缩短。另外,肝癌患者的癌组织中STAT3与HIF-1α和LDHA的表达水平呈正相关。干扰Huh7和HepG2.2.15细胞中STAT3信号通路,显着性降低糖酵解相关的关键分子HIF-1α、GLUT1、HK2和LDHA的mRNA水平,伴随肝癌细胞的糖酵解水平和最大糖酵解能力均明显降低。糖酵解阻断剂2-DG可抑制Huh7和HepG2.2.15细胞的增殖,并诱导肝癌细胞免疫原性死亡。TCGA数据库显示,肝癌患者的癌组织中GLUT1与CD47的表达水平呈正相关。GLUT1抑制剂STF-31可以显着性增加calreticulin在HepG2.2.15细胞表面的表达,而降低CD47的表达水平。进一步通过CHIP实验证实,STAT3可通过与GLUT1的启动子区域结合直接调控GLUT1的转录与表达。4.STAT3抑制剂Napabucasin体内外诱导肝癌细胞免疫原性死亡并改善肿瘤免疫微环境Napabucasin可显着性增加Huh7和HepG2.2.15以及Hepa1-6细胞表面calreticulin、ERp57、HSP70和HSP90的表达量,促进肝癌细胞对DC的活化作用。在Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠模型中,Napabucasin治疗组小鼠肿瘤的生长速度低于溶剂对照组,并且肿瘤细胞表面calreticulin和ERp57的表达水平明显升高,而CD47和GLUT1的水平显着性降低;肿瘤浸润的CD11b+F4/80+巨噬细胞、CD11c+DC细胞明显增加且活化水平提高,同时肿瘤浸润的CD4+T和CD8+T细胞数量明显增加,并且具有免疫抑制功能的LAG-3、PD1和KLRG1在CD8+T细胞上的表达较对照组均明显减少。进一步,在Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠Rechallenge实验中,Napabucasin治疗组中有75%的小鼠能抵抗第二次接种的Hepa1-6细胞的生长,而溶剂对照组小鼠100%出现肿瘤复发的情况。虽然,Napabucasin在对晚期给予Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠治疗中没有表现出明显的抑制作用,但是可以促进NK细胞的肿瘤浸润,并具有免疫抑制功能的LAG-3、Tim-3在CD8+T细胞和NK细胞上的表达降低,而IFNγ的表达水平的提高。5.STAT3抑制剂Napabucasin激发肝脏原位移植瘤小鼠的抗肿瘤免疫应答在Hepal-6细胞肝脏原位移植瘤小鼠中,Napabucasin治疗可以明显缩小肝脏癌变组织的大小,并伴随CD95+肝细胞数的增加和PD-L1+肝细胞数的减少。同时,Napabucasin治疗组小鼠肝脏中巨噬细胞的浸润数量及表达共刺激分子CD86的表达水平都明显高于溶剂对照组。另外,两组小鼠肝脏中浸润的DC数量虽然明显差异,但Napabucasin治疗组小鼠肝脏中浸润的DC表达的CD80和MHCⅡ的水平较溶剂对照组明显增加。更为重要的是,Napabucasin治疗组小鼠肝脏中CD8+T细胞数量明显增多,并且免疫抑制受体PD-1和LAG-3在CD8+T细胞上的表达降低。6.STAT3抑制剂Napabucasin显着抑制肝癌细胞的干性特征体外实验发现 Napabucasin 抑制 Huh7、SMMC-7721、HepG2、HepG2.2.15和Hepa1-6等肝癌细胞的活力作用强于Cryptotanshinone和Oxaliplatin,其IC50值明显低于另外两种药物。同时,Napabucasin可以抑制Huh7、HepG2.2.15和Hepal-6细胞的集落形成以及成球数,并可以裂解肝癌细胞球体。进一步分析发现,Napabucasin可以抑制Huh7和Hepa1-6细胞及细胞球体中Nanog、Sox-2和OCT4等肿瘤干性相关分子的mRNA水平。7.STAT3抑制剂Napabucasin可抑制Hepa1-6细胞皮下移植瘤生长早期给予Napabucasin治疗可明显抑制肿瘤的生长,延长小鼠生存期。Napabucasin治疗组小鼠肿瘤组织中Nanog、SOX2、Klf4和OCT4等干性相关分子的mRNA水平明显降低,并伴随CD95+肿瘤细胞数的增加和Ki67+、PD-L1+肿瘤细胞数的减少。晚期给予Napabucasin治疗,可以增加肿瘤组织中细胞凋亡数目及坏死区域,与早期治疗结果一致,Napabucasin可以抑制肿瘤组织中干性相关分子的表达。结论在本研究证明干扰STAT3信号通路可诱导肝癌细胞免疫原性死亡,表现为作为“eat me”信号的calreticulin和ERp57等大量转移到细胞表面,而细胞膜上“don’t eat me”信号分子CD47的表达水平显着性下降,且STAT3可以直接靶向CD47启动子;同时,细胞培养上清中作为“find me”信号的ATP释放增加,促使肝癌细胞被DC和巨噬细胞对肿瘤细胞的有效识别和吞噬。另外,干扰STAT3信号通路可降低肝癌细胞糖酵解关键酶水平,降低糖酵解水平,促进肿瘤细胞免疫原性死亡,并且STAT3可直接调控GLUT1的转录。进一步,利用小鼠皮下移植瘤和肝脏原位移植瘤模型证明,STAT3抑制剂Napabucasin处理可以增加肿瘤组织中DC和巨噬细胞的浸润数量及抗原呈递功能,促进CD4+T和CD8+T细胞在肿瘤组织的募集,减少KLRG1+及免疫抑制受体LAG-3+、PD1+的CD8+T细胞数,并产生抗肿瘤的免疫记忆作用。另外,Napabucasin在抑制Hepa1-6细胞的生长的同时,还可以抑制肿瘤干细胞的形成,延长小鼠生存期。意义该研究证明,靶向STAT3信号通路可以诱导肝癌细胞免疫原性死亡,改善肿瘤免疫微环境,逆转肿瘤的免疫耐受状态,在机体产生抗肿瘤免疫记忆中发挥着极为重要的作用,为STAT3作为肝癌治疗靶点及Napabucasin的临床应用提供了充分的理论依据和详实的实验依据,也为下一步建立新的肝癌治疗策略提供新思路。
饶佳月[10]（2021）在《低密度中性粒细胞对T-SPOT.TB检测的影响及其相关机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的:T-SPOT.TB（T-SPOT）检测被广泛用于检测结核分枝杆菌感染,其原理是在PBMCs中检测结核分枝杆菌特异的分泌IFN-γ的T细胞。最近,研究发现在结核病患者的PBMCs中存在高比例的低密度粒细胞（LDGs）。因此,本研究探讨了肺结核患者LDGs对T-SPOT检测的影响及相关机制。研究方法:1.纳入活动性肺结核患者作为研究对象,采集外周血后通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs）,取部分PBMCs采用流式细胞术检测其中LDGs的比例,另一部分PBMCs用于T-SPOT检测,在此基础上分析LDGs的比例和T-SPOT检测结果之间的相关性。2.分离肺结核患者的PBMCs,分别加入结核分枝杆菌（Mtb）抗原早期分泌性抗原靶6（ESAT-6）或培养滤液蛋白10（CFP-10）进行刺激,培养18-20小时后用流式细胞术检测其中LDGs胞内γ干扰素（IFN-γ）水平;分离纯化肺结核患者的LDGs,再按说明书使用纯化的LDGs代替PBMCs进行T-SPOT检测,探讨在Mtb抗原的刺激下LDGs本身是否会分泌IFN-γ。3.分离肺结核患者的PBMCs,将获得的PBMCs分为两组,其中一组采用免疫磁珠正选法去除PBMCs中的LDGs再进行T-SPOT检测,另一组直接进行T-SPOT检测,探讨去除LDGs对T-SPOT检测的影响。4.分离肺结核患者的PBMCs,取一部分PBMCs采用免疫磁珠负选法从中分离纯化LDGs。剩余的PBMCs分成两组,向其中一组PBMCs中加入纯化的自体LDGs,再进行T-SPOT检测,另一组直接进行T-SPOT检测,探讨加入外源性的LDGs对T-SPOT检测的影响。5.分离肺结核患者的PBMCs,取其中一部分通过流式细胞术检测其中LDGs的比例,据此将PBMCs标本分为低LDGs比例组和高LDGs比例组;同时,培养剩余的PBMCs并按照T-SPOT检测相同的剂量采用结核分枝杆菌的特异性抗原进行刺激,然后采用流式细胞术检测其中产生IFN-γ的T细胞比例,探讨LDGs的比例与IFN-γ分泌T细胞水平的相关性,评价LDGs对T淋巴细胞产生IFN-γ的影响。6.纳入结核病患者和健康对照者作为研究对象:（1）分离和培养肺结核患者的PBMCs,采用结核分枝杆菌特异性抗原刺激后检测上清中白细胞介素10（IL-10）的水平,比较低LDGs比例组的PBMCs和高LDGs比例组的PBMCs培养上清中IL-10的水平差异;（2）分离纯化肺结核患者外周血中的LDGs和健康人外周血中的正常密度中性粒细胞（NDGs）,采用流式细胞术检测和比较两群细胞上程序性死亡受体1（PD-1）、程序性死亡受体-配体1（PD-L1）、T淋巴细胞免疫球蛋白和含粘蛋白域的蛋白3（TIM-3）和含Ig及ITIM结构域的T细胞免疫受体（TIGIT）等负性共刺激分子的表达水平差异。7.选择含有较高比例LDGs（>3%）的肺结核患者的PBMCs,将其分成三组,按如下方法进行分别处理:（1）加入抗PD-L1的单克隆抗体预处理1h,以阻断PD-L1信号;（2）采用免疫磁珠正选法去除PBMCs中的LDGs;（3）不处理。将上述三组PBMCs同时进行T-SPOT检测,探讨阻断PBMCs上的PD-L1信号对T-SPOT检测的影响。8.通过免疫磁珠负选法分离纯化LDGs,将其分成两部分,其中一部分用抗PD-L1的单克隆抗体进行预处理,1小时后通过洗涤法去除上清后收获LDGs备用;另一部分不处理。将这两部分LDGs分别等量加入自体来源的PBMCs中,然后与未加入LDGs的PBMCs分别用于T-SPOT检测,探讨特异性阻断LDGs上的PD-L1对T-SPOT的影响。研究结果:1.高LDGs比例组（LDGs>3%）的ESAT-6刺激孔（25.41±3.987 vs55.73±7.078,P=0.0002）和CFP-10刺激孔（39.87±4.893 vs 64.82±7.941,P=0.0064）的T-SPOT检测斑点数均显着少于低LDGs比例组（LDGs≤3%）,两个刺激孔的斑点数总和也显着少于低LDGs比例组（65.28±7.985 vs 120.5±13.84,P=0.0004）。高LDGs比例组的T-SPOT阳性率也显着低于低LDGs比例组（P=0.015）。2.流式细胞术检测结果显示,无论是否接受了ESAT-6和CFP-10的刺激,LDGs均不表达IFN-γ;以LDGs进行T-SPOT检测后的结果显示,LDGs在Mtb抗原刺激和PHA刺激下均不会分泌IFN-γ。3.去除PBMCs中的LDGs后,ESAT-6刺激孔（25.72±5.137 vs 39.94±6.520,P=0.0049）和CFP-10刺激孔（18.39±4.281 vs 40.83±8.988,P=0.0055）的T-SPOT检测斑点数均显着增多,两个刺激孔斑点数的总和也显着增多（44.11±8.407 vs80.78±14.69,P=0.0041）;T-SPOT检测的阳性率也从77.78%增高至94.44%,但由于阴性样本量比较小,差异无显着性意义。4.外源性地加入LDGs后,ESAT-6刺激孔（25.32±5.456 vs 9.455±2.397,P=0.0008）和CFP-10刺激孔（35.95±8.188 vs 17.09±6.922,P=0.0027）的斑点数均显着减少,两个刺激孔的斑点数总和（61.27±11.89 vs 26.55±7.699,P=0.0008）也显着减少;T-SPOT检测阳性率也从100.00%下降至59.09%（P=0.0008）。5.无论是在ESAT-6刺激下（1.058±0.2680 vs 0.4743±0.09035,P=0.0088）还是在CFP-10刺激下（0.9953±0.1260 vs 0.5479±0.1017,P=0.0082）,低LDGs比例组的患者产生IFN-γ的T淋巴细胞比例均显着高于高LDGs比例组的患者。相关性分析结果显示,在ESAT-6的刺激下,产生IFN-γ的T淋巴细胞比例与LDGs的比例呈负相关（rho=-0.43,P=0.0207）。6.在ESAT-6和CFP-10刺激下,不同LDGs比例的PBMCs上清液中IL-10的水平没有显着差异;肺结核患者LDGs上PD-L1表达水平显着高于健康人NDGs（28.26±4.521 vs 5.721±1.227,P=0.0001）。肺结核患者LDGs和健康人NDGs中PD-1、TIM-3和TIGIT表达水平之间没有显着差异。7.与未处理组相比,PD-L1单克隆抗体阻断组的ESAT-6刺激孔（17.09±6.388 vs 31.91±8.065,P=0.0042）和CFP-10刺激孔（45.55±16.52 vs57.00±20.31,P=0.0176）的T-SPOT斑点数均显着增多,两个孔的斑点数总和也显着增多（62.64±22.34 vs 88.91±27.36,P=0.0023）。与去除LDGs组相比,PDL1单克隆抗体阻断组的ESAT-6刺激孔和CFP-10刺激孔斑点数均无显着差异,但两孔的总斑点数显着减少（98.91±27.36 vs 88.91±27.36,P=0.0165）。8.与未加入LDGs组相比,加入未处理的LDGs组ESAT-6刺激孔（21.92±4.361 vs 11.85±2.655,P=0.0038）和CFP-10刺激孔（47.62±13.85 vs39.69±13.69,P=0.0134）的T-SPOT斑点数均显着减少,两个孔的斑点数总和也显着减少（74.92±14.48 vs 55.50±14.45,P=0.0067）。而与加入未处理的LDGs组相比,加入了PD-L1阻断的LDGs组的ESAT-6刺激孔（11.85±2.655 vs18.15±4.223,P=0.0073）和CFP-10刺激孔的斑点数（39.69±13.69 vs 46.92±14.66,P=0.0038）均显着增多,两个孔的斑点数总和也显着增多（55.50±14.45vs 69.92±15.73,P=0.0025）。结论:LDGs可以通过负性免疫调节分子PD-L1抑制T淋巴细胞产生IFN-γ,从而导致T-SPOT检测出现假阴性结果。采用抗PD-L1的单克隆抗体预处理可有效提高T-SPOT的阳性率。
二、流式细胞术实体瘤组织标本制备的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、流式细胞术实体瘤组织标本制备的研究（论文提纲范文）
（1）PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景及立题依据 |
| 一、转移性结直肠癌的治疗现状及研究进展 |
| 二、靶向PD-1肿瘤细胞免疫治疗的机制及发展现状 |
| 三、大肠癌发生与肿瘤免疫治疗的关系研究进展 |
| 四、本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第一章、小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其机制研究 |
| 第一部分、小鼠PD-1基因敲除T细胞的建立及其体外抑制肿瘤的作用 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 靶向PD1基因sgRNA的设计构建及鉴定 |
| 2. PCR扩增和T7E1酶切鉴定 |
| 3. PD-1基因敲除T细胞亚群比例检测 |
| 4. PD-1基因敲除T细胞体外抑制肿瘤细胞生长 |
| 5. PD-1基因敲除T细胞与CT-26细胞株共培养的体外抗肿瘤效应 |
| 6. PD-1基因敲除T细胞与CT-26细胞株共培养的体外细胞因子分泌 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及可能机制 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 结直肠癌小鼠模型中CD8~+细胞中PD-1表达显着升高 |
| 2. 小鼠结直肠癌移植瘤模型的建立 |
| 3. 小鼠CT-26结直肠癌移植瘤模型体内抗肿瘤效应 |
| 4. 小鼠CT-26结直肠癌模型体内抗肿瘤效应可能机制 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二章、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的体内安全性评价 |
| 第一部分、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的建立及其生物学特性 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 食蟹猴外周血T细胞的培养 |
| 2. 食蟹猴PD-1敲除T细胞载体的构建及敲除效率的检测 |
| 3. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞增殖的影响 |
| 4. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞亚群的影响 |
| 5. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞周期的影响 |
| 6. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞死亡殖的影响 |
| 7. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞细胞因子分泌的影响 |
| 8. 混合淋巴细胞反应 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的体内安全性评价 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 食蟹猴一般情况 |
| 2. 食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内持续时间的检测 |
| 3. 食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性的评价 |
| 4. PD-1基因敲除T细胞回输对食蟹猴各组织器官的影响 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 PDH/PD-L1信号通路及其相关抗肿痛免疫疗法在结直肠癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）个体化肿瘤特异TCR的筛选策略（论文提纲范文）
| 1 筛选靶向“已知”肿瘤抗原的TCR |
| 2 筛选靶向“未知”肿瘤抗原的TCR |
| 3 结语 |
（3）七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的发病机制及临床表现 |
| 1.1.1 肺癌的发生 |
| 1.1.2 罹患肺癌的危险因素 |
| 1.1.3 肺癌的临床表现 |
| 1.2 肺癌的诊断 |
| 1.2.1 肺癌的辅助影像学检查 |
| 1.2.2 获取肺癌组织学或细胞学检查技术 |
| 1.2.3 肺癌的实验室血清学检查 |
| 1.2.4 肺癌的病理学评估 |
| 1.3 肺癌的治疗 |
| 1.4 肺癌的靶向治疗 |
| 1.4.1 非小细胞肺癌靶向药物 |
| 1.4.1.1 以表皮生长因子受体为靶点的药物 |
| 1.4.1.2 间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制药 |
| 1.4.1.3 ROS1 重排抑制药 |
| 1.4.1.4 血管内皮生长因子为靶点的药物 |
| 1.4.1.5 其他 |
| 1.4.2 非小细胞肺癌免疫治疗药物 |
| 1.4.3 SCLC靶向药物的现状 |
| 1.5 七鳃鳗LIP的发现及细胞毒作用 |
| 1.6 本研究目的及意义 |
| 第2章 七鳃鳗LIP蛋白对23 种肿瘤细胞杀伤活性比较分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组LIP蛋白的表达及纯化 |
| 2.2.2 重组LIP蛋白浓度测定 |
| 2.2.3 重组LIP蛋白活性鉴定 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 重组LIP蛋白细胞毒性测定 |
| 2.2.6 流式细胞仪对LIP蛋白杀伤肿瘤细胞定量分析 |
| 2.2.7 Western blot检测LIP蛋白在细胞膜表面的沉积 |
| 2.2.8 数据统计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组LIP蛋白的纯化 |
| 2.3.2 流式细胞仪检测LIP蛋白对肿瘤和正常细胞的识别 |
| 2.3.3 Western Blot检测LIP蛋白在细胞表面的沉积 |
| 2.3.4 LIP蛋白细胞毒性测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 LIP蛋白对三种肺癌细胞的生物学活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Operetta TM高内涵成像分析系统检测LIP蛋白对三种肺癌细胞的杀伤活性 |
| 3.2.2 荧光显微镜检测LIP对三种肺癌细胞微团杀伤活性 |
| 3.2.3 LDH检测LIP对三种肺癌细胞的杀伤活性 |
| 3.2.4 Operetta TM高内涵成像分析系统检测LIP联合顺铂对三种肺癌细胞的杀伤作用 |
| 3.2.5 细胞划痕实验检测LIP蛋白对三种肺癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.2.6 免疫荧光检测LIP蛋白对细胞骨架的影响 |
| 3.2.7 数据统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞杀伤活性探究 |
| 3.3.2 LIP蛋白与多种化疗药物对三种肺癌细胞杀伤活性比较探究 |
| 3.3.3 LIP蛋白与顺铂联合作用三种肺癌细胞探究 |
| 3.3.4 LIP蛋白对三种肺癌细胞迁移能力探究 |
| 3.3.5 LIP蛋白对三种肺癌细胞骨架的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 LIP蛋白对三种肺癌细胞线粒体膜电位及细胞凋亡的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫荧光检测LIP蛋白对线粒体的影响 |
| 4.2.2 Annexin V-FITC检测LIP作用肺癌细胞后细胞凋亡情况 |
| 4.2.3 流式细胞仪检测LIP作用肺癌细胞后细胞凋亡情况 |
| 4.2.4 流式细胞术检测LIP蛋白作用后肺癌细胞线粒体膜电位变化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞线粒体损伤探究 |
| 4.3.2 LIP蛋白诱导三种肺癌细胞凋亡检测 |
| 4.3.3 LIP蛋白通过影响线粒体膜电位变化抑制线粒体功能 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 LIP蛋白通过引起内质网应激激活细胞凋亡通路 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 免疫荧光检测LIP蛋白对三种肺癌细胞内质网的影响 |
| 5.2.2 共聚焦监测LIP蛋白对三种肺癌细胞内ROS的影响 |
| 5.2.3 细胞蛋白提取及蛋白浓度定量 |
| 5.2.4 WesternBlot检测内质网应激及加入抑制剂后凋亡通路相关蛋白的表达 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞内质网的损伤 |
| 5.3.2 LIP蛋白作用三种肺癌细胞后ROS含量变化情况 |
| 5.3.3 三种肺癌细胞中内质网应激诱导的凋亡通路相关蛋白表达情况 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 LIP蛋白在荷瘤小鼠及人源肿瘤组织水平对瘤体的识别和抑瘤作用 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 主要材料 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 注射LIP蛋白对小鼠肺癌细胞瘤的影响 |
| 6.2.2 透射电镜观察鼠肺癌肿瘤组织 |
| 6.2.3 人肺癌肿瘤组织的保存处理 |
| 6.2.4 肿瘤组织包埋及冰冻切片的制备 |
| 6.2.5 人肺癌肿瘤组织的HE染色 |
| 6.2.6 人肺癌肿瘤组织的免疫组织化学染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 小鼠肺癌细胞瘤注射LIP蛋白后的变化 |
| 6.3.2 LIP蛋白促小鼠A549-Luc-C8 细胞瘤的细胞凋亡 |
| 6.3.3 LIP蛋白对荷瘤小鼠正常组织形态的影响 |
| 6.3.4 人肺癌组织的HE染色 |
| 6.3.5 LIP蛋白特异性识别人肺癌组织 |
| 6.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 读博期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
（4）肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的表型鉴定及不同亚群表达差异的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料与仪器 |
| 1.1.1 肿瘤标本收集 |
| 1.1.2 肝细胞株 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.2.1 流式细胞术常用试剂耗材 |
| 1.2.2 细胞提取及培养常用试剂耗材 |
| 1.2.3 其他 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 淋巴细胞提取实验 |
| 1.4.2 流式细胞术检测淋巴细胞表面蛋白和胞内细胞因子表达 |
| 1.4.3 小鼠原位肝癌模型构建 |
| 1.4.4 小鼠TILs的提取 |
| 1.4.5 流式细胞分选仪分选出小鼠TILs中的CD4~+CD25~(hi)Helios~+T细胞 |
| 1.4.6 小鼠肿瘤浸润淋巴细胞对肿瘤的治疗 |
| 1.4.7 细胞培养基本操作 |
| 1.5 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 TILs在肝癌中的表型鉴定结果 |
| 2.1.1 TILs中各细胞亚群在肝癌组织、患者血液及癌旁组织中的表达情况 |
| 2.1.2 TILs中具有差异的细胞亚群 |
| 2.2 小鼠肝癌造模并提取其TILs进行功能研究的思路及初步结果 |
| 2.2.1 小鼠肝癌原位造模结果 |
| 2.2.2 小鼠肝癌模型TILs细胞提取及CD4~+CD25~(hi)Helios~+T 细胞的分选 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤浸润淋巴细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（5）电针足三里激活迷走神经调控乳腺癌小鼠炎性水平和抗肿瘤免疫功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 电针足三里对乳腺癌模型小鼠肿瘤生长的作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠肿瘤生长的作用 |
| 2. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠脾脏的作用 |
| 三、小结 |
| 第二部分 电针足三里对乳腺癌模型小鼠的抗炎作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠系统性抗炎作用 |
| 2. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠肿瘤局部抗炎作用 |
| 三、小结 |
| 第三部分 电针足三里对乳腺癌模型小鼠抗肿瘤免疫细胞的作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠外周血内抗肿瘤免疫细胞的作用 |
| 2. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠脾脏内抗肿瘤免疫细胞的作用 |
| 3. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠肿瘤局部组织内抗肿瘤免疫细胞的作用 |
| 4. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠抗肿瘤免疫细胞杀伤功能相关蛋白的作用 |
| 三、小结 |
| 第四部分 电针足三里对乳腺癌模型小鼠免疫抑制细胞的作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠外周血内MDSC的作用 |
| 2. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠脾脏MDSC的作用 |
| 3. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠肿瘤局部组织内MDSC的作用 |
| 4. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠MDSC免疫抑制功能相关蛋白的作用 |
| 5. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠MDSC免疫抑制功能的作用 |
| 三、小结 |
| 第五部分 迷走神经介导电针足三里调节抗炎-免疫减缓乳腺癌进展 |
| 实验一 电针足三里对乳腺癌模型小鼠迷走传出神经的作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠脑干DMV区ChAT阳性神经元的作用 |
| 2. 电针足三里对乳腺癌模型小鼠血浆和肿瘤局部组织内ACh的作用 |
| 实验二 激活α7nAChR对乳腺癌模型小鼠的抗炎-免疫调控作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 激活α7nAchR对乳腺癌模型小鼠肿瘤生长的作用 |
| 2. 激活α7nAchR对乳腺癌模型小鼠的抗炎作用 |
| 3. 激活α7nAchR对乳腺癌模型小鼠免疫功能的作用 |
| 实验三膈下迷走神经切断验证电针足三里对乳腺癌模型小鼠的调控作用 |
| 一、材料与方法 |
| 1. 实验动物与细胞 |
| 2. 主要实验试剂与仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 二、实验结果 |
| 1. 膈下迷走神经对电针减缓乳腺癌模型小鼠肿瘤生长作用的影响 |
| 2. 膈下迷走神经对电针减轻乳腺癌模型小鼠脾肿大作用的影响 |
| 3. 膈下迷走神经对电针增强乳腺癌模型小鼠抗肿瘤免疫功能作用的影响 |
| 小结 |
| 分析与讨论 |
| 一、对乳腺癌模型小鼠足三里行电针干预的依据及方式 |
| 1. 理论依据 |
| 2. 电针干预方式 |
| 3. 电针干预时程 |
| 二、电针足三里对乳腺癌模型小鼠的抗炎作用 |
| 三、电针足三里对乳腺癌模型小鼠免疫功能的调节 |
| 1. 对抗肿瘤免疫细胞CD8+T细胞和NK细胞的调节 |
| 2. 对免疫抑制细胞MDSC的调节 |
| 3. 体外实验验证电针足三里对乳腺癌模型小鼠MDSC的抑制作用 |
| 四、电针足三里调控乳腺癌模型小鼠炎性水平与免疫功能的相关性 |
| 五、电针足三里对乳腺癌模型小鼠抗炎-免疫调控作用的机制 |
| 1. 迷走传出神经介导电针足三里对乳腺癌模型小鼠的抗炎-免疫调控 |
| 2. 迷走神经与胂瘤进展的相关性 |
| 全文总结及展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 文献综述 针灸通过迷走神经调控免疫炎性反应的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（6）生物可降解高分子免疫植入器件用于结直肠癌术后免疫治疗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 结直肠癌的流行病学 |
| 2.2 结直肠癌发生发展的机制 |
| 2.3 结直肠癌的诊查现状 |
| 2.4 结直肠癌的治疗现状 |
| 2.5 基于生物高分子材料的免疫治疗新策略 |
| 2.6 总结 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 化学及生物试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞系及培养条件 |
| 3.2.2 动物实验 |
| 3.2.3 细胞复苏 |
| 3.2.4 细胞传代 |
| 3.2.5 细胞冻存 |
| 3.2.6 氧化葡聚糖(ODEX)的合成 |
| 3.2.7 4臂PEG-NH_2的合成 |
| 3.2.8 免疫植入器件的合成 |
| 3.2.9 植入器件的流变试验和拉伸试验 |
| 3.2.10 组织相容性实验和细胞毒性(MTT)实验 |
| 3.2.11 植入器件的体外和体内降解分析 |
| 3.2.12 免疫植入器件中R848和IgG的体外释放 |
| 3.2.13 体内抗肿瘤实验 |
| 3.2.14 外科手术和免疫植入器件的植入 |
| 3.2.15 肿瘤组织和血清中细胞因子分析 |
| 3.2.16 细胞流式分析 |
| 3.2.17 统计分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 免疫植入器件的合成和表征 |
| 4.2 免疫植入器件用于术后免疫治疗效果 |
| 4.3 治疗后肿瘤免疫微环境分析 |
| 4.4 对远端肿瘤的抑制作用 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在攻读博士期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（7）疏肝化症方治疗三阴性乳腺癌临床疗效及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 第一章 疏肝化症方对三阴性乳腺癌的临床疗效研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 研究结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 疏肝化症方对乳腺癌小鼠的抑瘤作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 疏肝化症方可通过PI3K/AKT/Bax通路抑制小鼠乳腺癌的发生和发展 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（8）PI3K/AKT/mTOR信号通路在亚砷酸钠联合黄芪甲苷抗肝癌中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 砷与黄芪的抗癌作用 |
| 1.1.1 砷的应用 |
| 1.1.2 黄芪的应用 |
| 1.2 砷与中药联合的抗癌研究 |
| 1.3 PI3K/AKT/mTOR信号通路与癌症 |
| 1.3.1 PI3K/AKT/mTOR信号通路调控机制 |
| 1.3.2 PI3K/AKT/mTOR信号通路的作用及其与癌症的关系 |
| 1.4 砷、黄芪甲苷与PI3K/AKT/mTOR信号通路 |
| 1.4.1 砷通过PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗癌作用 |
| 1.4.2 黄芪甲苷通过PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抗癌作用 |
| 1.5 本研究目的及意义 |
| 1.5.1 研究目的 |
| 1.5.2 研究意义 |
| 2 NaAsO_2和AS-Ⅳ最佳有效浓度的筛选及其抑制HepG2 细胞增殖的转录组学研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 NaAsO_2和AS-Ⅳ抑制HepG2 细胞的时间及IC50 的确定 |
| 2.2.2 NaAsO_2和AS-Ⅳ抑制HepG2 细胞的转录组学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 NaAsO_2和AS-Ⅳ抑制HepG2 细胞的有效浓度及时间 |
| 2.3.2 不同药物处理差异基因表达情况 |
| 2.3.3 不同药物处理差异基因GO功能富集分析 |
| 2.3.4 不同药物处理差异基因KEGG功能富集分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 NaAsO_2和AS-Ⅳ抑制HepG2 细胞的体外研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂耗材 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 siRNA筛选 |
| 3.2.2 CCK-8 试验 |
| 3.2.3 划痕试验 |
| 3.2.4 Transwell迁移侵袭试验 |
| 3.2.5 流式细胞术检测细胞周期凋亡试验 |
| 3.2.6 RT-qPCR试验 |
| 3.2.7 Western Blot试验 |
| 3.2.8 免疫荧光试验 |
| 3.2.9 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 siRNA筛选结果 |
| 3.3.2 CCK8 法检测NaAsO_2和AS-Ⅳ对 HepG2 细胞增殖情况的影响 |
| 3.3.3 划痕试验检测NaAsO_2和AS-Ⅳ对 HepG2 细胞迁移的影响 |
| 3.3.4 Transwell试验检测NaAsO_2和AS-Ⅳ对 HepG2 细胞迁移的影响 |
| 3.3.5 Transwell试验检测NaAsO_2和AS-Ⅳ对 HepG2 细胞迁移的影响 |
| 3.3.6 NaAsO_2和AS-Ⅳ对 HepG2 细胞周期的影响 |
| 3.3.7 NaAsO_2和AS-Ⅳ对 HepG2 细胞凋亡的影响 |
| 3.3.8 NaAsO_2和AS-Ⅳ对 PI3K/AKT/mTOR通路关键基因、蛋白的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 NaAsO_2和AS-Ⅳ抗肝癌作用的体内研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 裸鼠肝癌移植瘤模型的建立 |
| 4.2.2 ELISA试验 |
| 4.2.3 HE染色 |
| 4.2.4 TUNEL染色 |
| 4.2.5 RT-qPCR试验 |
| 4.2.6 Western Blot试验 |
| 4.2.7 数据处理 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 NaAsO_2和AS-Ⅳ对裸鼠肝癌移植瘤的抑制作用 |
| 4.3.2 NaAsO_2和AS-Ⅳ对裸鼠血清AFP、DCP、CEA、TNF-α的影响 |
| 4.3.3 HE染色观察NaAsO_2和AS-Ⅳ对裸鼠肝癌移植瘤的影响 |
| 4.3.4 TUNEL染色检测裸鼠肝癌移植瘤凋亡情况 |
| 4.3.5 NaAsO_2和AS-Ⅳ对 PI3K/AKT/mTOR通路关键基因、蛋白的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并抑制肿瘤干细胞特性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语说明 |
| 第一部分: 文献综述 STAT3对肿瘤细胞有氧糖酵解的调节作用 |
| 一、STAT3对肿瘤细胞有氧糖酵解调节酶的调控作用 |
| 1. STAT3对HIF-1α的调节作用 |
| 2. STAT3对HIF-2α的调节作用 |
| 二、STAT3对肿瘤细胞有氧糖酵解关键酶的调控作用 |
| 1. STAT3对糖酵解第一阶段关键酶GLUT1的调控作用 |
| 2. STAT3对糖酵解第二阶段关键酶HK2的调控作用 |
| 3. STAT3对糖酵解第二阶段关键酶PFK的调控作用 |
| 4. STAT3对糖酵解第二阶段关键酶PKM2的调控作用 |
| 5. STAT3对糖酵解第三阶段关键酶LDHA的调控作用 |
| 三、STAT3对免疫细胞有氧糖酵解的调控作用 |
| 四、STAT3和糖酵解对肿瘤细胞免疫原性死亡的影响 |
| 五、总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分:靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并改善肿瘤免疫微环境 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂材料和制剂 |
| 二、主要试剂配制 |
| 三、主要仪器设备 |
| 四、主要实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. 靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡 |
| 1.1 干扰STAT3的表达可以抑制肝癌细胞的增殖并促进细胞凋亡 |
| 1.2 干扰STAT3的表达促进calreticulin和ERp57等“eat me”信号分子在肝癌细胞的膜转移 |
| 1.3 干扰STAT3的表达减少“don't eat me”信号分子CD47在肝癌细胞表面的表达 |
| 1.4 干扰STAT3的表达促进肝癌细胞释放ATP |
| 1.5 干扰STAT3的表达增强肝癌细胞对DC的活化作用 |
| 1.6 干扰STAT3的表达增强巨噬细胞对肝癌细胞的吞噬作用 |
| 2. 靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡的机制研究 |
| 2.1 STAT3通过结合PKR调控免疫原性死亡标志分子eIF2α的磷酸化 |
| 2.2 STAT3通过调控糖酵解关键酶-GLUT1抑制免疫原性死亡 |
| 2.3 STAT3通过调控“don't eat me”信号分子-CD47抑制免疫原性死亡 |
| 3. 抑制小鼠肝癌模型中STAT3信号通路可诱导机体抗肿瘤免疫应答及免疫记忆的产生 |
| 3.1 干扰小鼠肝癌细胞Hepa1-6中STAT3表达可以诱导细胞免疫原性死亡 |
| 3.2 STAT3抑制剂Napabucasin体外诱导肝癌细胞免疫原性死亡 |
| 3.3 STAT3抑制剂Napabucasin体内诱导肝癌细胞免疫原性死亡 |
| 3.4 STAT3抑制剂Napabucasin抑制Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠肿瘤的生长并改善肿瘤免疫微环境 |
| 3.5 STAT3抑制剂Napabucasin激发肝脏原位移植瘤小鼠的抗肿瘤免疫应答 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分: STAT3抑制剂Napabucasin抑制肝癌干细胞特性的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、主要试剂材料和制剂 |
| 二、主要试剂配制 |
| 三、主要仪器设备 |
| 四、主要实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. Napabucasin体外显着抑制肝癌细胞的活力 |
| 2. Napabucasin体外抑制肝癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡 |
| 3. Napabucasin抑制肝癌细胞干性相关分子的表达 |
| 4. Napabucasin抑制肝癌细胞集落形成和成球能力 |
| 5. Napabucasin抑制肝癌干细胞球的细胞活力及干性相关分子的表达 |
| 6. Napabucasin抑制HBV的复制 |
| 7. Napabucasin抑制Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠肿瘤的生长 |
| 8. Napabucasin促进中晚期Hepa1-6细胞皮下移植瘤小鼠肿瘤的坏死 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 论文创新性及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议 |
| 已发表学术论文 |
| 待发表学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）低密度中性粒细胞对T-SPOT.TB检测的影响及其相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 第2章 LDGs对肺结核患者T-SPOT检测结果的影响探讨 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血PBMCs的分离 |
| 2.2.2 T-SPOT检测 |
| 2.2.3 流式细胞术检测PBMCs中的LDGs比例 |
| 2.2.4 免疫磁珠正选法去除PBMCs中的LDGs |
| 2.2.5 免疫磁珠负选法分离纯化LDGs |
| 2.2.6 结核分枝杆菌培养及外周血感染 |
| 2.2.7 流式细胞术检测细胞内IFN-γ |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 研究对象基本情况 |
| 2.3.2 LDGs比例与肺结核患者T-SPOT检测结果相关 |
| 2.3.3 LDGs本身不分泌IFN-γ |
| 2.3.4 去除PBMCs中 LDGs显着提高T-SPOT检测的阳性率和斑点数 |
| 2.3.5 加入外源性LDGs显着下调T-SPOT检测的阳性率和斑点数 |
| 2.3.6 LDGs可抑制T淋巴细胞的IFN-γ生成 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 LDGs影响T-SPOT 检测结果的机制及T-SPOT 检测的优化方案探讨 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 研究对象及分组 |
| 3.1.2 主要试剂及器材 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PBMCs培养上清液中的IL-10 水平检测 |
| 3.2.2 外周血NDGs的分离 |
| 3.2.3 细胞表面负性共刺激分子的表达水平检测 |
| 3.2.4 PBMCs表面PD-L1 分子的功能阻断 |
| 3.2.5 LDGs表面PD-L1 分子的功能阻断 |
| 3.2.6 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 研究对象基本情况 |
| 3.3.2 肺结核患者外周LDGs高表达PD-L1 |
| 3.3.3 阻断PD-L1对T-SPOT检测结果的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论与展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 结核病中性粒细胞胞外诱捕网的研究进展 |
| 参考文献 |
四、流式细胞术实体瘤组织标本制备的研究（论文参考文献）
- [1]PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究[D]. 高嫦娥. 昆明医科大学, 2021(01)
- [2]个体化肿瘤特异TCR的筛选策略[J]. 张超亭,陆哲明. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2021(09)
- [3]七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究[D]. 宋晓萍. 辽宁师范大学, 2021(09)
- [4]肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的表型鉴定及不同亚群表达差异的研究[D]. 杜杨. 桂林医学院, 2021(01)
- [5]电针足三里激活迷走神经调控乳腺癌小鼠炎性水平和抗肿瘤免疫功能的研究[D]. 张知云. 浙江中医药大学, 2021
- [6]生物可降解高分子免疫植入器件用于结直肠癌术后免疫治疗研究[D]. 吉国锋. 吉林大学, 2021(01)
- [7]疏肝化症方治疗三阴性乳腺癌临床疗效及其作用机制研究[D]. 王博. 长春中医药大学, 2021(01)
- [8]PI3K/AKT/mTOR信号通路在亚砷酸钠联合黄芪甲苷抗肝癌中的作用研究[D]. 郭志伟. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [9]靶向干预STAT3信号通路诱导肝癌细胞免疫原性死亡并抑制肿瘤干细胞特性的研究[D]. 李雅. 山东大学, 2021
- [10]低密度中性粒细胞对T-SPOT.TB检测的影响及其相关机制研究[D]. 饶佳月. 南昌大学, 2021(01)