一、神经生长抑制因子相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及其生物学特性(论文文献综述)
吴飞[1](2021)在《Hc-SPI-I8抑制宿主凝血及炎症反应的功能及机制研究》文中提出寄生性线虫能在动物群体中造成相当高的发病率和死亡率,其中,捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是世界范围内具有重大经济意义的小型反刍动物寄生性线虫之一,无论是在发展中国家还是发达国家其流行率均居高不下。该虫感染后引起的捻转血矛线虫病(haemonchosis)能够造成宿主生长发育障碍、生产力低下,严重时亦可导致死亡,极大地威胁了反刍动物的健康,另外,高昂的防治费用也制约了畜牧业的可持续发展。虽然,目前仍有数种广谱抗蠕虫药物单独或联合用药对捻转血矛线虫感染有较好的治疗效果,但长期过度依赖这些药物使得不同地区的捻转血矛线虫对抗蠕虫药物产生了不同程度的耐药性,这将导致可用的药物越来越少。另外,由于缺乏可投入生产的疫苗,使得目前寄生性蠕虫的防控形势极为严峻。因此,寻找新的关键药物靶位及疫苗候选基因,开发无污染、无残留的新型药物和研制安全、高效的疫苗是目前线虫病防治的重要研究方向。丝氨酸蛋白酶抑制因子(serine protease inhibitors,SPIs)在寄生性线虫寄生阶段高表达,是其长期与宿主相互作用的进化表现,可抑制宿主丝氨酸蛋白酶从而保障自身生存需要和逃避宿主的杀伤机制。明确SPIs在寄生虫-宿主交互过程中的作用,能为寄生虫病的防治提供新的方向。本研究从课题组前期的蛋白质组学数据中筛选出一种在捻转血矛线虫L4期高表达的SPI,扩增获得了Hc-spi-i8a和Hcspi-i8b两个剪切体,并对其表达特性进行分析;通过血液凝固和活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)实验研究Hc-SPI-I8A的功能;利用酵母双杂交、Co IP、GST pull-down和共定位技术筛选并验证Hc-SPI-I8A与绵羊含TSP1结构域蛋白(Ovis aries TSP1-containing protein,Oa TSP1CP)间的互作关系,初步分析Hc-SPI-I8A发挥抗凝血功能的机制;结合泛素化、p65入核和点突变等实验初步明确Hc-SPI-I8调控RACK1/IKKs/NF-κB/TNF-α通路的机制。研究结果为深入研究捻转血矛线虫抗凝血和抑制宿主免疫反应的机制奠定了坚实的理论基础和现实依据,同时也为新型疫苗和药物的研发提供了新的靶标。1.捻转血矛线虫Hc-spi-i8基因表达特性分析为分析捻转血矛线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子Hc-spi-i8的表达特性,本研究通过Blast获得Hc-spi-i8的CDS序列,结合信号肽与结构域预测以及同源性与进化树分析结果,推测Hc-SPI-I8可能发挥的功能;利用真核转染技术在HEK293T细胞中对其信号肽活性进行初步验证;通过荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)检测该基因在不同发育阶段虫体内的转录特征;使用免疫荧光组织化学(immunohistofluorescence,IHF)呈现Hc-SPII8在虫体中的定位。结果显示,Hc-spi-i8具有两个剪切体,分别为Hc-spi-i8a和Hc-spi-i8b,两者均有一个N端的信号肽,前者在C端还有一个与吸血性寄生虫(如钩虫)高度相似的TIL结构域;两者在捻转血矛线虫寄生阶段的转录水平均显着高于自由生活阶段,且Hc-SPI-I8主要表达于虫体肠道、性腺和皮下组织,说明Hc-SPI-I8可能具有抑制宿主血液凝固的功能,为后续实验指明了研究方向。2.Hc-SPI-I8A抑制宿主凝血及其作用机制为明确Hc-SPI-I8抗凝血功能及其分子机制,本研究通过绵羊全血抗凝血实验验证其功能;截断表达Hc-SPI-I8蛋白,探究TIL结构域对Hc-SPI-I8抗凝血功能的重要性;通过酵母双杂交实验筛选羊全血中可能与Hc-SPI-I8存在相互作用的凝血相关因子;经过昆虫杆状病毒表达系统表达Hc-SPI-I8的互作蛋白Oa TSP1CP,并分析其在Hc-SPI-I8发挥抗凝血功能中的作用;利用c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)扩增Oa TSP1CP、绵羊主要凝血因子(II、VII、X和XI)。结果显示,Hc-SPI-I8A能通过TIL结构域影响外源性和内源性途经;Hc-SPI-I8可与四种绵羊血液中的蛋白结合,其中Oa TSP1CP可能参与凝血途经且特异性结合Hc-SPI-I8A进而帮助后者干扰外源性凝血途经;RACE获得了Oa TSP1CP和绵羊凝血因子的CDS全长。综合上述结果,本研究初步解析了Hc-SPI-I8A影响外源性凝血途经的机制,为全面揭示Hc-SPI-I8A抑制血液凝固的机制奠定坚实的基础。3.Hc-SPI-I8抑制宿主TNF-α型炎症反应及其分子机制为明确Hc-SPI-I8是否能通过与Oa RACK1互作而调控NF-κB活性进而抑制TNF-α型炎症反应,本研究验证了Hc-SPI-I8、RACK1和MKRN1间的互作关系并分析RACK1与两者结合的区域;利用进化树分析和p65入核实验验证RACK1/IKKs/NF-κB通路在不同物种间的保守性;经多种实验确定Hc-SPI-I8和MKRN1对NF-κB活性的影响;明确Hc-SPI-I8和MKRN1是否通过RACK1影响NF-κB活性;经过泛素化实验确定MKRN1和Hc-SPI-I8对RACK1泛素化以及MKRN1对Hc-SPI-I8泛素化的影响,进而阐明两者及RACK1泛素化对RACK1/IKKs/NF-κB通路介导的TNF-α型炎症反应的影响。结果表明,Hc-SPII8、RACK1和MKRN1能够两两结合且RACK1结合Hc-SPI-I8和MKRN1的位置相同;RACK1/IKKs/NF-κB通路在物种间保守且Hc-SPI-I8和MKRN1能通过RACK1影响NF-κB活性;MKRN1能促进RACK1和Hc-SPI-I8泛素化,Hc-SPII8能够抑制RACK1泛素化,且两者均影响RACK1 K183和K185位点的泛素化,而这两个位点的泛素化影响了RACK1在RACK1/IKKs/NF-κB通路介导的TNF-α型炎症反应中的作用。综合上述结果表明,Hc-SPI-I8可能够通过抑制MKRN1对RACK1的泛素化进而抑制TNF-α型炎症反应,研究结果能为后续更深入探究Hc-SPI-I8抑制TNF-α型炎症反应的分子机制奠定基础。综上所述,本研究从捻转血矛线虫蛋白质组学中筛选到一种在寄生阶段显着高表达的TIL型SPI,其主要表达于肠道、性腺和皮下组织;Hc-SPI-I8A依赖TIL结构域干扰宿主外源性和内源性凝血途经且与Oa TSP1CP互作有关;MKRN1、RACK1和Hc-SPI-I8间两两互相结合且MKRN1和Hc-SPI-I8结合RACK1相同的区域,RACK1/IKKs/NF-κB通路在物种间保守,且MKRN1和Hc-SPI-I8通过作用于RACK1的两个关键泛素化位点进而影响其在RACK1/IKKs/NF-κB通路中的功能。研究结果不仅进一步揭示了捻转血矛线虫抑制宿主凝血和炎症反应的机制,也为捻转血矛线虫新型药物开发和疫苗研制提供了新的靶位点。
樊友宏[2](2021)在《SIBSD1对番茄叶片衰老和果实糖度的调控》文中研究说明叶片衰老是叶生命周期中的最后一个重要阶段。它不是一个简单的退化过程,而是一个受到高度调控的生物学过程,旨在将有价值的资源回收并重新分配给活跃生长的器官。叶片衰老的发生与进程受到严格的动态控制,涉及调节因子之间复杂的协同和拮抗作用。本研究在番茄中鉴定了一个新型的叶片衰老调控因子Sl BSD1。亚细胞定位和转录激活试验表明Sl BSD1定位在细胞核中并具有转录激活活性。Sl BSD1基因的下调表达导致番茄叶片过早地出现一系列衰老相关的特征,包括叶绿素含量的降低、细胞程序性死亡的增加以及衰老标记基因表达的上调。相反,过表达Sl BSD1基因显着延迟番茄叶片的衰老,表明Sl BSD1是番茄叶片衰老的负调控因子。转录组数据显示,Sl BSD1基因的下调表达导致许多叶片衰老相关基因的差异表达,其中参与光合作用、碳水化合物代谢和蛋白质合成代谢过程基因的表达显着下调,而参与分解代谢和营养转运过程基因的表达显着上调,进一步支持了Sl BSD1在叶片衰老中的负调控作用。Sl BSD1的蛋白水平受到E3泛素连接酶Sl SINA1的调控。酵母双杂交、体外蛋白结合和免疫共沉淀试验表明Sl SINA1和Sl BSD1之间存在相互作用。瞬时表达和体外泛素化试验显示,Sl SINA1作为泛素连接酶可以特异地识别Sl BSD1,并通过泛素-蛋白酶体途径促进Sl BSD1的降解。与此相符,过表达Sl SINA1基因导致了番茄叶片的提前衰老。转录组之间的韦恩分析表明Sl SINA1对番茄叶片衰老的正调控作用至少在一定程度上归因于其对衰老抑制因子Sl BSD1稳定性的调控。此外,Sl BSD1和Sl SINA1还参与调控番茄的营养生长和黑暗诱导的叶片衰老。最后,本研究发现过表达Sl BSD1基因在延缓叶片衰老的同时,还可以显着提升番茄果实中可溶性固形物的含量。综上所述,本研究以番茄为研究对象,通过遗传学、生物化学、分子生物学和基因工程等研究方法,鉴定了一个新型的叶片衰老调控模块Sl BSD1-Sl SINA1,并提供了一种通过调控叶片衰老提升果实品质的有效策略,为番茄品质改良提供了分子靶标和理论基础。
张影[3](2020)在《抗Cyclin D1胞内抗体对三阴性乳腺癌生长和转移的抑制作用及机制研究》文中认为乳腺癌是全球女性最常见的癌症类型,亦是我国女性发病率最高、引起癌症相关性死亡的主要病因。三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是一种缺乏雌激素受体、孕激素受体和表皮生长因子受体2表达的特殊类型乳腺癌,具有高侵袭性、高转移性和显着耐药性等特点。TNBC发病率占乳腺癌总发病率的20%,死亡率占乳腺癌总死亡率的83%,与其他类型的乳腺癌相比,TNBC患者的愈后差、远期生存率低,目前TNBC尚无标准的治疗方案。因此开展三阴性乳腺癌的新型治疗策略及分子机制的研究具有重要的科学意义和临床应用价值。Cyclin D1是由CCND1基因编码的细胞周期蛋白,具有促进细胞增殖和基因转录等功能,可在多种癌症中呈高表达。现有研究表明,阻断Cyclin D1的治疗策略将有助于干扰多种癌症特异性信号通路达到癌症治疗的目的。但是Cyclin D1在三阴性乳腺癌中的表达及其与愈后的关系尚存在争议,且Cyclin D1在TNBC发生、发展中的作用机制尚未明确。因此,深入研究TNBC中Cyclin D1的表达以及靶向拮抗Cyclin D1的作用效能,对于进一步理解TNBC发生和发展的分子机制,改善TNBC的治疗效果具有重要意义。胞内抗体技术是在细胞内表达且作用于同一细胞内靶抗原的具有功能的抗体分子,通过阻断或调节靶蛋白的活性,在翻译后水平实现蛋白质的敲低,作为RNA干扰(RNAi)和小分子抑制剂等靶分子敲低技术的互补手段,在蛋白质功能的研究中发挥重要作用。越来越多的研究表明,可以通过对胞内抗体进行工程化修饰等手段,将抗体蛋白定位于细胞各区间内,从而在多种疾病(例如病毒感染、退行性疾病和肿瘤)中发挥诊断和治疗作用。本实验室前期工作中构建了内质网滞留型抗Cyclin D1胞内抗体(命名为ER-ADκ),能够在ER阳性乳腺癌及肝癌细胞内结合并抑制Cyclin D1活性,有效抑制MCF-7、Hep G2等肿瘤细胞系增殖并诱导细胞凋亡的发生。但ER-ADκ能否在TNBC中发挥抑制肿瘤生长及转移的作用尚不清楚。因此,为了深入研究TNBC中Cyclin D1的致癌机制以及ER-ADκ能否作为改善TNBC患者愈后的有效治疗策略,本研究拟通过分析GEO数据库中TNBC患者m RNA转录组学数据,明确CCND1在TNBC组织中的转录水平及可能参与调控的信号通路,利用胞内抗体技术识别并结合TNBC细胞内Cyclin D1后,分别在细胞水平及裸鼠体内探究ER-ADκ的表达对三阴性乳腺癌生长、转移之间的关系及具体分子机制。主要研究结果如下:一、明确Cyclin D1在TNBC癌和癌旁组织中的表达特性。通过GEO数据库下载TNBC患者m RNA芯片数据并利用R语言进行生物学分析,研究结果表明,CCND1在TNBC组织中呈高表达,通过STRING网站行PPI网络构建、通过R语言行GO功能注释及KEGG富集通路分析发现,Cyclin D1在TNBC中参与调控细胞周期、细胞衰老、乳腺癌的发生以及在PI3K-AKT、Wnt等信号通路中发挥作用。乳腺癌组织芯片的免疫组织化学染色实验进一步证实:Cyclin D1在TNBC组织中的表达高于癌旁组织,预示Cyclin D1可能成为TNBC靶向治疗的分子靶点。二、证实抗Cyclin D1胞内抗体(ER-ADκ)能够有效抑制TNBC增殖和转移,促进TNBC凋亡。(1)在MDA-MB-231和BT-549两种TNBC细胞中转染ER-ADκ的质粒,进行Western blot、co-IP和间接免疫荧试验,结果表明,ER-ADκ在TNBC中成功表达并定位在细胞内质网;(2)流式细胞术分析结果表明:ER-ADκ能诱导MDA-MB-231细胞发生G1/S期细胞周期阻滞和细胞凋亡;(3)细胞划痕试验、Transwell小室等实验发现,ER-ADκ能抑制MDA-MB-231和BT-549细胞的迁移、侵袭和浸润能力。三、探究ER-ADκ抑制TNBC发生发展中的分子机制。结果表明:(1)TNBC细胞中,ER-ADκ抑制成视网膜细胞瘤抑癌蛋白(Retinoblastoma Protein,Rb)磷酸化水平,并上调抑制细胞周期相关因子p21(Cyclin inhibition protein 1)、p27(Kinase inhibition protein 1)的转录,进而抑制TNBC细胞周期进程;(2)ER-ADκ通过内质网应激途径,促进TNBC细胞发生凋亡;(3)ER-ADκ通过抑制β-catenin的核易位,下调TNBC细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程相关转录因子Slug、Snail的表达,抑制EMT相关蛋白N-钙黏着蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2、MMP9和MMP14的表达,并提高E-钙黏着蛋白(E-cadherin)的表达,从而抑制细胞上皮-间质转化,抑制TNBC的转移。四、ER-ADκ抑制TNBC生长及转移的体内效应及相关机制分析。结果表明:(1)通过裸鼠异种移植瘤实验发现,ER-ADκ可以在体内显着降低MBA-MB-231细胞的瘤重及瘤体积,有效抑制MDA-MB-231细胞的体内生长;ER-ADκ通过激活内质网应激的方式在体内诱导细胞凋亡的发生。(2)通过裸鼠异种移植瘤实验和尾静脉注射肺转移模型发现,ER-ADκ能够在体内有效抑制三阴性乳腺癌细胞肺转移的能力;ER-ADκ促进E-cadherin表达、抑制β-catenin表达降低癌细胞肺转移的能力。通过以上研究,我们发现Cyclin D1在TNBC组织中呈高表达,并对TNBC细胞增殖、凋亡、迁移及浸润等过程起着重要的作用。通过在MDA-MB-231和BT-549两种三阴性乳腺癌细胞系内表达抗Cyclin D1的胞内抗体ER-ADκ,能够在细胞内识别并结合Cyclin D1,抑制三阴性乳腺癌细胞在体内和体外的增殖及转移能力,其分子机制可能是通过ER-ADκ结合并抑制Cyclin D1活性,下调Rb磷酸化水平,诱导内质网应激介导细胞凋亡的发生,并减少β-catenin的核累积,进而使EMT过程受阻,从而抑制TNBC生长和转移。综上,本研究首次通过胞内抗体技术实现敲低TNBC中的Cyclin D1,发现抗Cyclin D1胞内抗体能够显着抑制TNBC细胞的生长和转移,并探讨了相应的机制,为Cyclin D1作为三阴性乳腺癌治疗靶点提供了实验依据,并为胞内抗体作为新型抗肿瘤药物的研发奠定基础。
王艳[4](2020)在《ZFP281相关蛋白复合物在小鼠胚胎干细胞中功能研究》文中研究指明基因组印记是一种特殊的表观遗传学调控,以亲本特异性方式影响基因表达。印记基因座内顺式调控元件与表观遗传调控机制和转录因子共同作用,严格以等位基因特异性表达模式调控印记基因的表达。已知,印记控制区(imprinting control regions,ICR)与增强子是两个主要的顺式作用元件来调控印记基因的亲本特异性表达。这些顺式调控元件在印记区域相互作用模式被破坏时,可导致印记基因表达缺陷,其表达紊乱可引发多种人类先天性疾病,例如天使综合征(Angelman Syndromes,AS)、普-威综合征(Prader-Willi Syndromes,PWS)和贝-威综合征(Beckwith–Wiedemann Syndromes,BWS),以及许多癌症。已有报道显示含有P-TEFb的超伸长复合物(Super elongation complex,SEC)和类超伸长复合物(Super elongation complex-like 2/3,SEC-L2和SEC-L3)可参与调控不同的基因表达,在发育和疾病中具有功能特异性。已经证明,AFF3是类超伸长复合物3(SEC-L3)的中心成分,可结合在Dlk1-Dio3印记基因座内的基因间差异甲基化区域(intergenicdifferentially methylated region,IG-DMR)和Meg3增强子处,以调节小鼠胚胎干(embryonic stem,ES)细胞中该基因簇中的等位基因特异性基因表达。AFF3富集在IGDMR依赖于ZFP57,但是,尚不清楚Meg3增强子处AFF3是如何调控等位基因特异性基因表达模式及其作用的分子机制。Krüppe1样锌指转录因子ZFP281是调控小鼠胚胎干细胞多能性的主要调节因子。我们通过从头基序分析小鼠ES细胞中AFF3富集的增强子区域鉴定了ZFP281的保守识别序列。随后,全基因组分析进一步确定了ZFP281作为关键性因子在许多增强子处与AFF3共定位,并介导了AFF3在染色质的定位,进而共同调控靶基因的表达。在印记控制区,如Dlk1-Dio3印记基因座,ZFP281与AFF3特异性地结合在其增强子上,而非IG-DMR处。随后的功能分析表明:ZFP281可以以等位基因特异性方式调节增强子活性,并募集AFF3到Meg3的上游增强子处,进而通过调控其转录延伸,以确保相关印记基因的单等位基因特异性表达。利用shRNA介导的RNAi将Zfp281敲除时,AFF3在Meg3上游增强子的募集受到影响,Meg3多顺反子的表达下调。因此,我们鉴定出AFF3被募集至增强子的调节子,并揭示AFF3在印记Dlk1-Dio3基因座中Meg3多顺反子转录表达调控的分子机制。我们的结果表明,不同的锌指蛋白,例如ZFP57和ZFP281,可以募集AFF3到不同的调节元件,并以特异位点差异性方式调节AFF3的不同功能。
任亭亭[5](2020)在《宿主蛋白ID1抑制O型口蹄疫病毒复制的作用机制》文中提出口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)是引起口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)的病原,该病是一种急性、热性、高度接触性传染病,其宿主主要是猪、牛、鹿、山羊、绵羊等偶蹄动物。该病传播途径多、传播速度快,曾多次在世界范围内暴发流行,造成巨大经济损失。口蹄疫病毒属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属,其基因组为单股正链RNA,长约8.5 kb,包含7种血清型,且各型间无交叉保护。DNA结合抑制因子1(Inhibitor of DNA binding 1,ID1)是转录调节因子,主要参与细胞分化、细胞周期进程、上皮-间质细胞转化、血管生成、细胞干性维持、化学耐药性、肿瘤发生和转移等生物学过程。但是ID1调控病毒复制及其调控机制的研究报道甚少。为了从分子水平揭示宿主抗病毒感染的作用机制,本研究利用LC-MS/MS检测了病毒感染后不同时间点宿主细胞中的蛋白表达谱,用Western blot实验对表达存在显着差异的蛋白进行验证,最终筛选ID1蛋白进行深入研究。首先,分别检测了口蹄疫病毒感染不同细胞后ID1在不同时间点的表达水平,发现ID1蛋白存在先上调再下调的动态表达变化过程。应用CRISPR-Cas9系统敲除宿主细胞中ID1基因后,与对照细胞系相比,ID1基因敲除后显着促进口蹄疫病毒复制。其次,为了验证这一结果与体内试验结果是否吻合,我们构建了ID1敲除的转基因小鼠,与对照组相比,ID1敲除小鼠存活率显着降低,存活时间明显缩短,心脏的病理切片显示其病变程度也更严重。然后,为了探究口蹄疫病毒下调ID1表达的机制,我们用泛素-蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,发现MG132处理会显着抑制口蹄疫病毒对ID1的下调作用,并且研究结果还表明口蹄疫病毒对ID1的下调是依赖于泛素-蛋白酶体系统的E3连接酶Cdh1,它能够靶向降解ID1蛋白。最后,为了进一步揭示ID1在抑制口蹄疫病毒复制过程中的分子机制,我们通过免疫共沉淀实验发现ID1能够调控转录因子FOXO1的活性,荧光素酶报告实验和ChIP实验结果证明FOXO1直接作用于IRF3,调节IFN的表达,最终实现对口蹄疫病毒复制的调控。此外,通过生物信息软件预测分析并筛选出ssc-miR-381-3p、ssc-miR-4331-5p、ssc-miR-7137-5p和ssc-miR-4334-5p能够结合ID1 mRNA的3’-UTR。本研究结果揭示了ID1调控口蹄疫病毒复制的分子机制,为阐明口蹄疫病毒的感染机理和免疫逃避策略奠定基础,为病毒免疫预防和抗病毒药物研制提供理论依据。
张丽萌[6](2020)在《FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究》文中研究说明FHL2(four and a half LIM domains protein 2)属于 LIM-Only 蛋白家族中的一员,其作为转录调节子参与基因表达、细胞增殖分化、细胞迁移和凋亡等诸多生理过程,当前研究多集中于人和小鼠。本课题组对连续产多羔和产单羔的绵羊卵巢组织转录组数据分析发现,FHL2在两组中的表达差异显着,推测FHL2对绵羊卵泡发育具有重要调控作用。为证实此推测,本文开展了绵羊不同组织中FHL2基因表达、绵羊卵巢中FHL2基因克隆及生物信息学分析、FHL2基因在绵羊卵巢及颗粒细胞中的表达及定位研究;通过构建FHL2过表达和siRNA干扰两种颗粒细胞模型,研究FHL2对绵羊颗粒细胞生长、类固醇激素分泌及相关基因表达的影响;通过构建绵羊卵巢组织的酵母双杂交CDNA文库,筛选与FHL2互作的宿主蛋白,并进行初步验证。旨在揭示FHL2调控绵羊卵泡发育的分子机制。本研究采用Real-time PCR(RT-PCR)方法检测FHL2基因在绵羊不同组织部位的表达水平;利用分子克隆技术获得绵羊FHL2基因的编码序列,生物信息学分析比较不同物种间序列同源性和进化关系;利用免疫组化技术检测FHL2蛋白在绵羊卵巢组织中的表达分布;采用细胞免疫荧光检测FHL2蛋白在卵巢颗粒细胞中的定位。结果表明:绵羊卵巢中FHL2表达水平高于其它组织,克隆得到的绵羊卵巢FHL2基因CDS为 837bp,编码 279 aa,与GenBank预测序列一致,未发生氨基酸突变,绵羊氨基酸序列与人、牛、猪、马、鸡、狗、猴同源性分别为86%、98.3%、91.7%、89.3%、76.5%、88.2%、86.2%;FHL2主要分布在绵羊卵巢的卵泡(有腔卵泡和无腔卵泡)中,亚细胞定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核中。利用分子克隆技术构建真核过表达载体pcDNA3.1-FHL2,设计合成siRNA 靶向siRNA的干扰序列,转染颗粒细胞后摸索干扰效率,在体外分离培养的绵羊卵巢颗粒细胞中建立超表达和干扰两种卵巢颗粒细胞模型。结果表明:(1)成功构建真核表达载体pcDNA3.1-FHL2,转染至绵羊颗粒细胞后24 h显着提高FHL2的表达;(2)成功合成3条FHL2基因的siRNA,通过RT-PCR和Western Blot检测摸索最佳转染时间和干扰效果,显示siFHL2-2在转染后72 h能够显着降低FHL2的表达。利用AlamarBlueTM HS检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期,ELISA方法检测颗粒细胞雌激素和孕酮分泌变化,RT-PCR检测细胞凋亡(Bcl-2,Bax,p53和Caspase3)、细胞周期(CyclinD1,CyclinB1和p21)以及激素分泌(StAR,3β-HSD,CYP11,CYP19)相关基因的mRNA表达水平。结果表明:通过FHL2过表达模型证实:细胞转染后24 h,与对照组相比,FHL2过表达抑制绵羊卵巢颗粒细胞生长(P<0.01);正常细胞比例显着降低(P<0.05),细胞晚期凋亡率升高(P<0.05),检测细胞凋亡相关基因表达水平,Bcl-2表达水平显着下调(P<0.05),Bax和Caspase3表达水平上调(P<0.05),Bcl-2/Bax的比值下调(P<0.01),促进细胞凋亡;细胞周期G0/G1期和S期细胞的比例降低(P<0.001),细胞周期因子Cyclin B1表达水平显着下调(P<0.05);检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2和P的分泌量显着降低(P<0.05),CYP19Al、3β-HSD基因表达水平下调(P<0.05)。通过siRNA干扰模型证实:细胞转染后72 h,与对照组相比,干扰FHL2的表达能够促进绵羊卵巢颗粒细胞生长(P<0.01),检测细胞凋亡和凋亡相关基因的表达水平,正常细胞比例升高(P<0.05),细胞晚期凋亡率降低(P<0.05),Caspase3表达水平下调(P<0.05),Bcl-2/Bax的比值上调(P<0.05),抑制细胞凋亡;细胞周期S期和G2/M期细胞的比例升高(P<0.05),细胞周期因子Cyclin D1和p21表达上调(P<0.05);检测生殖激素分泌量及相关基因表达水平,E2分泌量升高(P<0.05),CYP19A1、CYP11A1和StAR基因表达上调(P<0.05)。通过酵母双杂交技术构建绵羊卵巢组织细胞的酵母双杂交文库,构建酵母诱饵质粒pGBKT7-FHL2,利用酵母双杂交文库筛选与FHL2蛋白互作的宿主蛋白。结果表明:成功构建了含有3×108个重组子的绵羊卵巢组织cDNA的酵母双杂交文库,文库滴度为2×107 cfu/mL,以及诱饵载体pGBKT-FHL2,检测诱饵载体无毒性及自激活活性。利用pGBKT7-FHL2诱饵质粒,在酵母文库中筛选出与FHL2互作的蛋白共 1 1 个(RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD),Blast比对分析发现这些蛋白主要参与蛋白质合成、基因转录、细胞增殖分化、细胞凋亡及信号通路调控等过程。通过添加外源生长因子TGF-β1,研究在卵巢颗粒细胞中对FHL2的表达水平变化。利用TGF-β1蛋白及几个重要信号通路的抑制剂PI3K(Deguelin)、MEK(Combimetinib)、NF-κB(BAY11-7082)、JNK(SP600125)、MAPK(SB202190)处理体外培养的绵羊颗粒细胞,开展FHL2作用信号通路的试验验证。结果表明:外源添加TGF-β1蛋白使FHL2表达水平上调(P<0.05),在此基础上,分别添加上述的信号通路抑制剂,结果显示添加PI3K和MARK信号通路抑制剂,导致FHL2表达水平下调(P<0.05),证实PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的信号通路。综上所述,绵羊FHL2基因CDS序列全长837 bp,编码279个氨基酸,在卵巢组织中高表达,定位于卵泡颗粒细胞;FHL2影响颗粒细胞的增殖、凋亡、周期和类固醇激素(E2和P)分泌及相关基因表达;筛选获得与其互作蛋白有RPL31、RPS20、RPS12、COMMD1、AP-1、PLCD1、FOXO1、β-catenin、CREB、NF-κB、CYLD共计11个,在绵羊卵泡发育中可能通过互作参与细胞的增殖、凋亡等信号通路过程;PI3K和MAPK是TGF-β1调控FHL2表达的细胞信号通路。
成琳[7](2017)在《CtBP在转录调控和细胞代谢中的作用》文中认为CtBP(C-terminal binding protein)蛋白家族是一类非常经典的转录辅阻遏因子,在发育和疾病中发挥着重要的作用,它主要通过和序列特异且与DNA结合的转录阻遏因子相互作用,并募集染色质修饰相关的因子,改变染色质状态,行使转录辅阻遏因子的功能。CtBP在结构上与一类NAD依赖的D2-羟基酸脱氢酶(D2-HDH)具有高度的同源性,并被认为是有功能性的脱氢酶,此外,由于CtBP的活性受细胞内NADH/NAD+水平的影响,近年来不少研究都表明CtBP的转录调控功能与细胞代谢有着密切的联系。但是至今为止CtBP真正的生理学底物还未被鉴定出来,所以在这一领域仍有很多问题亟待解决,例如CtBP的真正底物是什么,底物是如何影响CtBP功能的?其脱氢酶活性是如何调控RNA转录及染色质构象的?CtBP的转录调控功能与细胞代谢状态之间的联系是通过哪些方式建立的?本文通过体外生化试验和细胞实验初步探究了 CtBP和代谢酶PHGDH之间的关系,寻找到了 CtBP的一个潜在底物3-磷酸甘油酸(3PG)。我们进一步发现CtBP与PHGDH存在物理相互作用,并且存在功能上的联系。此外我们还对3PG等代谢物对CtBP功能的影响进行了初步探讨,发现3PG和NADH可以协同促进CtBP二聚体的形成,同时NADH/NAD+水平的改变可能与CtBP的亚细胞定位有关。鉴于PHGDH在氨基酸合成、核酸合成及一碳单位来源中的重要作用,本文的结果提示CtBP可能通过与PHGDH的相互作用发挥其在转录调控和细胞增殖中的功能。以下是这篇论文的主要结果:1.CtBP蛋白与代谢酶PHGDH的关系以CtBP的脱氢酶结构域为线索,我们在NCBI上分别进行了果蝇和人的蛋白序列比对,发现果蝇的CG6287蛋白和人的PHGDH蛋白与CtBP有着较高的同源性,之后通过在果蝇数据库FlyBase中的检索,我们发现CG6287在人中的直系同源基因即为PHGDH,编码的蛋白为3-磷酸甘油酸脱氢酶,在进化上也属于D-2-羟基酸脱氢酶,其底物为3-磷酸甘油酸(3PG),为方便起见,我们将CG6287命名为dPHGDH。鉴于CtBP与PHGDH的同源性及各自特异的转录调控和代谢功能,我们提出一个设想:PHGDH和CtBP可能是同工酶,而且PHGDH可能是CtBP与细胞代谢环境建立联系的一种机制。由于PHGDH和CtBP可能是同工酶,我们以3-磷酸甘油酸为底物,将已报道的CtBP酶活检测底物丙酮酸作为对照,检测CtBP的酶活,结果表明在在相同浓度条件下(100μM),以3PG为底物时,CtBP的酶活远高于丙酮酸,说明3PG可能是CtBP的潜在生理学底物。为了探究CtBP蛋白与代谢酶PHGDH的功能关系,我们分别利用Co-IP和细胞免疫染色实验证明了 CtBP和PHGDH在细胞中共定位,并存在直接或间接的相互作用。此外,Wnt信号通路转录调控模型中的研究表明,在CtBP RNAi或CtBP和Gro双重RNAi的情况下,Wnt信号通路被激活后,CtBP靶基因nkd表达水平上升了 6-7倍,而在转染了 PHGDH后,nkd的表达又受到了抑制,说明PHGDH在一定程度上弥补了 CtBP的转录辅抑制功能,两者可能具有功能上的相互联系。2.代谢中间产物能够影响CtBP的功能为了检测3PG对CtBP功能的影响,我们以不同浓度3PG处理Kc细胞,同时以文献中报道的CtBP的另一个潜在底物MTOB作为对照,检测Wnt信号通路靶基因nkd的表达水平。结果显示在用3PG和MTOB处理细胞后,CtBP的靶基因nkd受到抑制,这与CtBP过表达的结果相似,说明3PG和MTOB能在一定程度上促进CtBP的功能。此外我们分别用带V5和Flag标签的CtBP质粒共同转染Kc细胞,免疫共沉淀(Co-IP)实验时分别用NADH、3PG及对照MTOB处理样品,检测它们对CtBP二聚体形成的影响。结果显示单独的3PG和MTOB处理不能促进CtBP二聚体的形成,而NADH和3PG(或MTOB)同时处理后能协同促进CtBP二聚体的形成,这可能是CtBP潜在底物能够增强其功能的一种机制。我们还研究了细胞内NADH/NAD+水平对CtBP功能的影响,结果表明在用糖酵解抑制剂2-DG处理细胞后3h,CtBP的抑制活性减弱。同时,我们还观察了 2-DG处理细胞3h后CtBP的胞质和核定位情况,结果表明在用10mM2-DG处理细胞3h后,CtBP在胞质中的积累增加,而核中减少。这一结果表明,细胞中NADH/NAD+比率的变化不仅能通过影响CtBP二聚体的形成及其与其他蛋白的相互作用来调控CtBP的功能,还能通过影响CtBP的亚细胞定位来调控其功能分布。综上所述,我们对于CtBP蛋白和代谢酶PHGDH关系的研究,3PG、NADH调控CtBP功能的研究,间接证明了代谢对转录调控和染色质修饰的影响,为我们进一步认识代谢、转录调控和疾病之间的关系提供了一定的借鉴。
陈巧林[8](2002)在《金属硫蛋白-3(MT-3)相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及性质研究 ——探索金属硫蛋白-3及其相互作用蛋白功能的分子机制》文中认为Alzheimer’s病(Alzheimer’s disease,AD)最显着的神经病理特征是神经突形成以淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)为核心的老年斑(senile plaque,SP),由双股螺旋微丝(paired helix filament,PHF)构成的神经元纤维缠结(neorofibrillary tangles,NFT)以及大量的神经元丧失。尽管目前还无法确定AD的病因,许多证据已经表明,MT-3(又叫神经生长抑制因子,GIF)含量下降是造成AD脑大量神经元丧失的主要因素。MT-3主要分布于脑部中枢神经系统,在Alzheimer’s症脑提取物的存在下,对培养的神经元细胞具有特异的生长抑制活性。值得注意的是,单独的MT-3或单独的脑提取物均不具有生长抑制活性,这表明,MT-3可能是与脑提取物中的其它因子协同作用而发挥其抑制功能的。迄今,对于MT-3发挥抑制功能的分子机制仍不为人知。为深入研究MT-3对AD的作用机理,首次利用酵母双杂交系统(yeast two hybridization,又称相互作用陷阱,interaction trap)在正常人脑cDNA文库中对GIF相互作用蛋白(growth inhibitory factor interacting protein,GIFIP)进行了快速筛选,并通过GST融合表达系统对筛选到的GIFIP基因进行了表达,再从蛋白质的水平上进一步分析,确证表达产物与MT-3的相互作用及细胞生物学协同活性。 酵母双杂交系统技术是近年来发展起来的一种用于检测蛋白与蛋白间相互作用的灵敏的分子生物学方法。以MT-3为诱饵,构建成诱饵质粒pHyblex-MT-3(bait1);采用基于LexA的酵母双杂交系统对正常人脑cDNA文库进行了大规模筛选,筛选了4.6×106个酵母文库转化子;得到12个较强的双阳性(His+、lacZ+)酵母克隆。分离阳性酵母中的文库质粒,经初步假阳性排除实验、DNA序列分析和网上DNA序列同源检索,表明其中1个阳性文库质粒的插入片段编码细胞核dUTPase的部分蛋白序列。 经初步分析认为,细胞核dUTPase可能具备与MT-3相互作用的条件。通过聚合酶链式反应(PCR),自AD病人脑cDNA文库中扩增得到了包含蛋白全编码区的细胞核dUTPasecDNA。双杂交系统实验表明,完整的细胞核dUTPase可与MT-3相互作用,但不与MT-1相互作用。此外,我们还将细胞核dUTPase cDNA克隆于原核融合表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21中进行了诱导表达、纯化及酶活性测定研究。 为了进一步证实dU叮pase与州叮.3相互作用的真实性和特异性,通过免疚共沉沈实脸来脸证它们在哺乳动物细胞293中的相互作用.将州叮.3克隆于带F吨标签的真核表达载体PPlag-CMv一中,获得能表达Flag-州叮.3的真核表达质粒MT.3/PFI吧.cMv.2.将细胞核dUTpase cDNA克隆于带HA标签的真核表达载体Psv一HA中,获得表达HA一LjTpase触合蛋白的真核重组表达质拉dUTpas‘Ps从HA.使用L咖介c切mine将MT.3/pFI昭-C Mv.2和dtJI,as以Psv-HA共同转染293细胞,并以州汀.llPrlag心Mv.2和dUTPaS帅sv-HA共同转染293细胞为对照,结果表明dU即ase可在哺乳动物细胞内与州叮.1不发生相互作用,可与州汀.3特异性结合. 实脸证明在研究神经营养因于(NGF)的功能及其作用机制、神经元的细胞凋亡等方面,啥格细胞瘤株PC12可充当神经元模型.因此选用PC12作为模型,运用基因转染手段将dL厅pase、G一蛋白Rab3a和MT.3基因以不同组合方式共转染PC12细胞,同时将表达的重组细胞核dU汗吸、Rab3a和州汀.3蛋白进行不同的组合培养PclZ,运用M仃方法研究dUTPase、Rab3a对M叮‘3抑制PC12生长作用的影响.结果显示重组dUTpase和凡由3a均可与重组MT.3共同抑制PC12的生长,且其抑制曲线与MT.3的神经元生长抑制曲线极为相似,但其中任何单个成分都不能对PcIZ产生抑制作用,说明dUTPase和Rab3a是BE中与MT-3相互作用的蛋白因子. dUTpas。具有催化水解脱氧尿替三磷嗽duTP)的特性,其作为细胞内dUTp浓度的重要调节子,很大程度上防止了d甘即通过DNA聚合酶错误掺入到DNA中而最终导致产生DNA碎片及细胞死亡.本文还就MT.3对d甘即ase保护由dUTp引起的正常细胞损伤的影响进行了研究与讨论. 为了将来研究MT.3及其相互作用蛋白性质和功能的需要,鉴于蛋白单抗制备的困难,以大耳家兔为免疫动物,对MT.3及其相互作用蛋白的多抗进行了制备,进一步利用硫酸盐沉淀法分离纯化多杭IgG,通过一定的测定方法和相关研究实验初步证明,制备的多杭符合蛋白性质研究的一般需要.
何军军[9](2020)在《马氏珠母贝免疫效应分子的克隆及功能研究》文中研究说明抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是机体先天免疫系统的重要组成部分,对细菌,真菌和病毒等病原体具有广泛的抑制作用。贝类是一种滤食性的水生生物,时刻面临着水体中大量微生物的侵袭,因此,贝类已进化出一套有效的先天免疫系统,特别是依靠其抗菌肽进行免疫防御。马氏珠母贝是一种具有重要经济价值的珍珠贝,但是目前在马氏珠母贝中尚未发现有代表性的抗菌肽分子,这意味着马氏珠母贝可能依靠其他的免疫效应分子来进行免疫防御。为了进一步探究马氏珠母贝抵抗环境病原体的分子机理,本研究基于马氏珠母贝基因组数据库,从基因层面出发,筛选马氏珠母贝免疫效应分子并进行克隆,分析免疫效应分子在病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMPs)刺激后的组织表达情况,构建原核表达载体,对重组蛋白开展抗菌机制研究。结果如下:(1)免疫效应分子的筛选与克隆:利用在线Antimicrobial peptide database(APD)的抗菌肽氨基酸序列构建本地数据库,与马氏珠母贝基因组比对,成功筛选出4种免疫效应分子并克隆获得c DNA全长,分别为马氏珠母贝胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(trypsin-like serine protease,PmTLS)c DNA全长778 bp,马氏珠母贝Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂(Kunitz-type serine protease inhibitor,PmKuPI)c DNA全长为1318 bp,马氏珠母贝鹅型溶菌酶(goose-type lysozyme,Pmlys G)c DNA全长为973 bp,马氏珠母贝鞘脂蛋白(saposin B,PmSap B)c DNA全长为1148 bp。同源性分析,PmTLS、PmKuPI和PmSap B的物种间相似性较低,而Pmlys G的物种相似性较高,与海湾扇贝的相似性达到60.5%。进化树分析发现PmTLS与长牡蛎的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶亲缘关系最近,PmKuPI与长牡蛎和美洲牡蛎的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂亲缘关系最近,Pmlys G与海湾扇贝、栉孔扇贝和虾夷扇贝的鹅型溶菌酶亲缘关系最近,PmSap B与美洲牡蛎的鞘脂蛋白亲缘关系最近。(2)组织表达及PAMPs刺激后特定组织表达分析:利用实时荧光定量PCR技术检测四种免疫效应分子在马氏珠母贝常规组织的表达模式,发现PmTLS在血细胞中表达量最高,PmKuPI在外套膜中高表达,Pmlys G和PmSap B在肝胰腺高表达,三种高表达组织均为免疫相关组织。相比对照组,在LPS、PGN和Poly I:C刺激马氏珠母贝后,PmTLS在血细胞的表达量有所上升,并都在48 h时达到最大值(P<0.05);LPS和Poly I:C刺激马氏珠母贝后,Pmlys G在肝胰腺的表达量都在72 h达到最大值(P<0.01),PGN刺激后,Pmlys G在肝胰腺的表达量在6 h就达到最大表达水平(P<0.01);同样,LPS和Poly I:C分别刺激后,PmSap B在肝胰腺的表达量都在72 h达到最大值(P<0.01),PGN刺激后,PmSap B在肝胰腺的表达量在24 h达到最大表达水平(P<0.05)。(3)四种免疫效应分子的原核表达:成功构建了pET28-PmTLS、pET28-PmKuPI、pET28-Pmlys G和pET28-PmSap B四个原核表达载体,优化表达条件,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组蛋白r PmTLS、r PmKuPI、r Pmlys G和r PmSap B。在0.5 m M的IPTG诱导下,pET28-PmTLS的最佳诱导温度是37℃,其余三个表达载体的最佳诱导温度是15℃。经纯化复性后,最终获得r PmTLS8.02 mg,r PmKuPI 11.27 mg,r Pmlys G 16.96 mg,r PmSap B 4.57 mg。(4)PmTLS和PmKuPI(rPmTLS和rPmKuPI)的抗菌功能研究:利用细菌生长曲线抑制法检测r PmTLS和r PmKuPI的抗菌活性,在所检测的8种细菌中,r PmTLS蛋白显着抑制了4种革兰氏阴性菌的生长(p<0.05),分别是铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌,r PmKuPI蛋白显着抑制了5种革兰氏阴性菌种的生长(p<0.05),分别是大肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和哈维氏弧菌。利用透射电子显微镜观察两个重组蛋白作用后细菌的形态学变化,发现r PmTLS作用于铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌和副溶血弧菌后,相比对照组,铜绿假单胞菌的菌体膨胀,出现质壁分离的现象;嗜水气单胞菌内含物质部分丢失,内部结构发生变化,细胞壁出现溶解;副溶血弧菌内含物缺失,菌体中间膨胀,出现质壁分离的现象。r PmKuPI作用于铜绿假单胞菌和副溶血弧菌后,与对照组相比,铜绿假单胞菌内含物质缺失,内部结构发生明显改变,菌体一端也有内含物质释放出来;副溶血弧菌内含物收缩,与细胞壁基本脱离,并且有明显的折皱和缺失。本研究为探讨马氏珠母贝免疫效应分子的作用机制提供初步参考,对贝类抵抗环境病原体的机制有进一步的认知,也为替代抗生素在水产养殖中的滥用提供可能。
王燕[10](2020)在《红螯螯虾胚胎发育组学分析及免疫基因功能研究》文中提出红螯螯虾(Cherax quadricanatus)俗称澳洲淡水龙虾,是一种重要的新兴经济水产动物,由于其本身的生物学特性可作为甲壳动物的模式生物进行研究。胚胎发育是个体发育的起点,胚胎发育的好坏是影响螯虾体质的重要因素之一。而病原是影响螯虾养殖的另一个重要因素,先天免疫系统是甲壳动物清除和杀死病原的天然防御系统。对螯虾胚胎发育和先天免疫开展研究对于丰富甲壳动物发育模式和抗病研究具有重要的意义,同时也为螯虾养殖的疾病防御提供了重要的指导作用。本研究以红螯螯虾为研究对象,利用转录组和microRNA(miRNA)组学技术对红螯螯虾不同胚胎发育时期进行了研究,同时基于转录组数据对参与先天免疫的C型凝集素和Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子进行了基因克隆和功能研究。主要研究结果如下:1、红螯螯虾胚胎发育转录组比较分析采用Illumina测序技术对红螯螯虾三个胚胎发育时期的转录组谱进行了研究,并进一步分析了与发育相关的基因。共拼接得到49,436个unigenes并进行了注释和聚类,其中13,727个在NR数据库得到了注释,5,087个根据GO注释进行了分类,2,735个与189个KEGG通路有关。通过对不同胚胎发育时期的基因表达进行差异分析,共鉴定出6,658个差异表达基因。共有3,300个unigenes被鉴定为复眼色素形成期(EP)与孵化准备期(PH)之间的差异表达基因,其中1,595个被注释到数据库中;5,211个unigenes被鉴定为EP与幼体时期(L)之间的差异表达基因,其中2,540个被注释;1,262个unigenes被鉴定为PH与L之间的差异表达基因,其中680个被注释。本研究关注点主要是与形态或性状特征、信号通路及免疫系统相关的差异表达基因。与神经发生相关的Ato、Slit和Robo基因,与体分节相关的Cnc和mlpt基因及与眼睛发育相关的Apontic、Ey、Pax6和So基因均在EP期大量表达,说明EP期是神经系统形成、身体分节和复眼形成的关键时期;与附肢形成相关的Projectin基因在EP期和PH期表达量都比较高,表明EP期和PH期是附肢发育的主要阶段。Hedgehog、MAPK、Wnt、TGF-β和Notch等信号通路相关的发育基因在EP期比另两个时期的表达量高,表明EP比后两个时期具有更活跃的生物学过程。在三个胚胎发育时期,与过氧化物酶体、吞噬体和溶酶体相关的免疫基因丰富,说明红螯螯虾在胚胎时期已经形成了相对完整的免疫系统,并且吞噬细胞发挥主要的作用。2、红螯螯虾胚胎发育过程中miRNA的鉴定与分析运用miRNA组学鉴定了红螯螯虾三个胚胎发育时期(EP、PH和L)的miRNA及其靶基因。共获得19个已知miRNA和331个新miRNA,这些miRNA属于50个miRNA家族。三个胚胎发育时期两两比较,共鉴定出113个差异表达miRNA,预测出2,575个靶基因,其中1,257个被注释到各数据库中。此外,有9个miRNA及其63个靶基因被发现与胚胎发育相关。其中,mi R-10及其靶基因可能调控神经系统发育和体分节。Mi R-2788可能通过调节细胞增殖影响胚胎发育。还有mi R-28(靶基因tutl)、mi R-50(靶基因fbx5)和mi R-1260b(靶基因sif)可能共同调控红螯螯虾胚胎眼睛的发育。分析了miRNA与其负调控的靶基因之间共同调控网络,这些miRNA及其靶基因构成的网络共同调控红螯螯虾胚胎组织和器官的发育。3、红螯螯虾C型凝集素(CqCTL)的基因克隆及表达根据组学部分结果研究克隆并鉴定了红螯螯虾第一个C型凝集素基因(CqCTL)。CqCTL的完整c DNA序列包含一个543 bp的开放阅读框,它编码的蛋白质含有180个氨基酸。对CqCTL的氨基酸序列分析表明,CqCTL中含有一个糖识别结构域(CRD),在CRD中含有4个保守半胱氨酸(Cys48、Cys59、Cys76和Cys177)以及决定结合特异性的EPD(Glu80-Pro81-Asn82)和QPD(Gln146-Pro147-Asn148)基序。CqCTL与之前报道的其它物种C型凝集素具有高度的相似性。CqCTL的mRNA在所有十个组织中均可被检测到,且在肝胰腺中表达量最高。将编码CqCTL的c DNA片段重组到p ET-32a(+)载体中,并在大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S中表达。CqCTL以可溶性融合蛋白的形式表达,在其N端还包括Trx-、His-和S-标签。镍柱亲和层析法纯化蛋白,获得了表观分子量约为37 k Da的可溶性CqCTL。4、红螯螯虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子(CqKPI)的基因克隆、表达及功能研究根据组学部分结果研究克隆并鉴定了红螯螯虾第一个Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子(CqKPI)。CqKPI的开放阅读框包含405 bp,编码的蛋白质含有134个氨基酸序列。CqKPI具有两个Kazal结构域,均由44个氨基酸残基组成,具有保守氨基酸序列C-X3-C-X5-PVCG-X5-Y-X3-C-X6-C-X12-C,即每个Kazal结构域含有6个保守半胱氨酸,可以形成三对二硫键稳定Kazal结构域的构象。两个Kazal结构域P1位点的氨基酸残基分别为Ser43和Lys91,表明CqKPI可能可以抑制胰蛋白酶和弹性蛋白酶的活性。CqKPI与之前报道的其它物种Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子具有高度的相似性。CqKPI的mRNA在十个组织中均可被检测到,且在血细胞中表达量最高。重组的CqKPI在大肠杆菌中成功表达,并利用镍柱亲和层析柱和分子筛层析柱纯化,以供进一步研究。重组CqKPI可以与花津滩芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和白色假丝酵母结合;还可抑制花津滩芽孢杆菌和白色假丝酵母的生长。这些结果表明CqKPI可能通过结合病原菌,与病原菌丝氨酸蛋白酶相互作用来参与红螯螯虾先天免疫系统,帮助红螯螯虾抵抗病原体的入侵。
二、神经生长抑制因子相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及其生物学特性(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、神经生长抑制因子相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及其生物学特性(论文提纲范文)
(1)Hc-SPI-I8抑制宿主凝血及炎症反应的功能及机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
前言 |
第一部分 文献综述 |
第一章 捻转血矛线虫与捻转血矛线虫病 |
1 捻转血矛线虫 |
1.1 形态特征 |
1.2 生活史 |
2 捻转血矛线虫病 |
2.1 流行病学 |
2.2 症状与危害 |
2.3 诊断 |
2.4 预防与控制 |
3 本章小结 |
第二章 寄生性线虫与宿主相互作用 |
1 寄生性线虫的致病性 |
1.1 病理损伤 |
1.2 营养掠夺 |
1.3 免疫调节与免疫逃避 |
2 宿主对GINs感染的应答 |
2.1 固有免疫应答 |
2.2 获得性免疫应答 |
2.3 免疫应答的结果 |
3 本章小结 |
第三章 胃肠道寄生线虫丝氨酸蛋白酶抑制因子 |
1 丝氨酸蛋白酶抑制因子 |
2 GINs中主要的SPIs |
2.1 Serpin型 SPIs |
2.2 Kazal型 SPIs |
2.3 Kunitz型 SPIs |
2.4 α-巨球蛋白 |
2.5 TIL型 SPIs |
3 SPIs在 GINs中的功能 |
3.1 调控自身丝氨酸蛋白酶活性 |
3.2 调控宿主丝氨酸蛋白酶 |
4 本章小结 |
第二部分 研究内容 |
第四章 捻转血矛线虫Hc-spi-i8 基因生物学特征分析 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 Hc-spi-i8 基因的扩增及序列分析 |
2.2 Hc-SPI-I8 的生物信息学分析 |
2.3 Hc-SPI-I8在293T细胞中的定位 |
2.4 原核表达与多克隆抗体制备 |
2.5 Hc-SPI-I8 的表达特性分析 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第五章 Hc-SPI-I8A抑制宿主凝血及其作用机制 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 Hc-SPI-I8A具有抗凝血功能 |
2.2 Hc-SPI-I8A抗凝血功能是TIL依赖的 |
2.3 Hc-SPI-I8A互作蛋白的筛选与验证 |
2.4 OaTSP1CP参与了绵羊血液凝固抑制过程 |
2.5 OaTSP1CP及内源性途径关键凝血因子的CDS扩增 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
第六章 Hc-SPI-I8 抑制宿主TNF-α型炎症反应及其分子机制 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 Hc-SPI-I8与Oa RACK1/Oa MKRN1 间的互作验证 |
2.2 RACK1/IKKs/NF-κB通路在物种间保守 |
2.3 Hc-SPI-I8和MKRN1 通过RACK1 影响NF-κB活性 |
2.4 Hc-SPI-I8和MKRN1 能影响RACK1 泛素化 |
2.5 RACK1 泛素化影响其功能 |
3 讨论 |
4 本章小结 |
全文总结 |
创新点 |
研究展望 |
附录 Ⅰ 常用溶液配制 |
附录 Ⅱ 引物序列 |
附录 Ⅲ 绵羊成纤维细胞OAR-L1 高效转染方法的探索 |
1 材料与方法 |
1.1 材料 |
1.2 方法 |
2 结果 |
2.1 荧光质粒表达鉴定 |
2.2 PEI、Lipo2000和CF2 转染OAR-L1 细胞的效果比较 |
2.3 慢病毒侵染OAR-L1 细胞的效果 |
2.4 储存条件和时间对慢病毒侵染效果的影响 |
2.5 不同方式包装慢病毒共侵染效果比较 |
2.6 融合Oa RACK1 对慢病毒共侵染OAR-L1 细胞的影响 |
3 讨论 |
参考文献 |
攻读博士学位期间的主要成果 |
致谢 |
(2)SIBSD1对番茄叶片衰老和果实糖度的调控(论文提纲范文)
致谢 |
摘要 |
abstract |
缩略词列表 |
第1章 引言 |
1.1 叶片衰老 |
1.1.1 叶片衰老概述 |
1.1.2 叶片衰老的分子调控网络 |
1.1.3 叶片衰老在农业改良中的应用 |
1.2 BSD结构域和BSD蛋白 |
1.2.1 BSD结构域 |
1.2.2 植物中BSD蛋白的研究进展 |
1.3 泛素-蛋白酶体途径 |
1.3.1 泛素与泛素化 |
1.3.2 26S蛋白酶体 |
1.3.3 E3泛素连接酶 |
1.3.4 SINA泛素连接酶 |
1.3.5 泛素化介导的叶片衰老调控 |
1.4 本研究的研究意义 |
第2章 材料与方法 |
2.1 实验材料与仪器 |
2.1.1 植物材料与生长条件 |
2.1.2 引物、载体与菌株 |
2.1.3 试剂与抗体 |
2.1.4 仪器与设备 |
2.1.5 常用储备液 |
2.1.6 常用培养基 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 分子克隆 |
2.2.2 重组蛋白的表达与纯化 |
2.2.3 植物DNA的提取 |
2.2.4 植物RNA的提取 |
2.2.5 植物蛋白的提取 |
2.2.6 反转录 |
2.2.7 Real-timeq PCR |
2.2.8 蛋白电泳和免疫印迹 |
2.2.9 农杆菌介导的烟草瞬时表达 |
2.2.10 PEG诱导的原生质体转化 |
2.2.11 酵母双杂交 |
2.2.12 免疫共沉淀 |
2.2.13 体外泛素化试验 |
2.2.14 农杆菌介导的番茄转化 |
2.2.15 叶绿素含量的测定 |
2.2.16 植物组织台盼蓝染色 |
2.2.17 转录组测序与分析 |
第3章 结果与分析 |
3.1 BSD蛋白的系统发育分析 |
3.1.1 BSD结构域的系统发育分析 |
3.1.2 SlBSD1的系统发育分析 |
3.2 SlBSD1的分子生物学特征 |
3.2.1 SlBSD1的克隆 |
3.2.2 SlBSD1的亚细胞定位 |
3.2.3 SlBSD1的转录激活活性 |
3.2.4 SlBSD1的组织表达模式 |
3.3 SlBSD1是番茄叶片衰老的负调控因子 |
3.3.1 SlBSD1基因的沉默与过表达 |
3.3.2 SlBSD1正向调控番茄的营养生长 |
3.3.3 SlBSD1负向调控番茄叶片的自然衰老 |
3.3.4 SlBSD1负向调控黑暗诱导的叶片衰老 |
3.4 SlBSD1-KD番茄叶片转录组测序与分析 |
3.4.1 表达量差异分析 |
3.4.2 GO富集分析 |
3.4.3 SlBSD1影响叶片衰老相关基因的表达 |
3.5 SlSINA1与SlBSD1相互作用并促进SlBSD1降解 |
3.5.1 SlSINA1基因的克隆 |
3.5.2 SlSINA1与SlBSD1相互作用 |
3.5.3 SlSINA1通过泛素-蛋白酶体途径促进SlBSD1的降解 |
3.6 SlSINA1是叶片衰老的正调控因子 |
3.6.1 SlSINA1基因的过表达 |
3.6.2 SlSINA1正向调控番茄叶片的自然衰老 |
3.6.3 SlSINA1正向调控黑暗诱导的叶片衰老 |
3.7 SlSINA1-OX番茄叶片转录组测序与分析 |
3.7.1 表达量差异分析 |
3.7.2 韦恩分析 |
3.7.3 GOBP富集分析 |
3.8 过表达SlBSD1基因可提高番茄果实的糖度 |
第4章 讨论与展望 |
4.1 SlBSD1是番茄叶片衰老的负调控因子 |
4.2 E3泛素连接酶SlSINA1调控SlBSD1的稳定性 |
4.3 SlSINA1参与调控番茄叶片衰老 |
4.4 延缓叶片衰老是提高果实糖度的有效策略 |
第5章 结论与创新点 |
5.1 结论 |
5.2 创新点 |
参考文献 |
攻读博士学位期间的学术活动及成果情况 |
附录1 原始和质控数据统计表 |
附录2 GOBP富集分析统计表 |
附录3 差异表达的衰老相关基因 |
(3)抗Cyclin D1胞内抗体对三阴性乳腺癌生长和转移的抑制作用及机制研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
英文缩略词 |
第1章 绪论 |
1.1 乳腺癌研究现状 |
1.1.1 乳腺癌发病率 |
1.1.2 乳腺癌病理分型 |
1.1.3 三阴性乳腺癌病理分型 |
1.1.4 三阴性乳腺癌治疗 |
1.2 细胞周期调控 |
1.3 Cyclin D1 蛋白 |
1.3.1 Cyclin D1 转录和翻译后调控 |
1.3.2 Cyclin D1 生物学功能 |
1.3.3 Cyclin D1 发挥促癌作用信号通路 |
1.3.4 靶向Cyclin D1 癌症治疗策略 |
1.4 胞内抗体 |
1.4.1 抗体基本结构组成 |
1.4.2 胞内抗体制备 |
1.4.3 胞内抗体应用 |
1.5 本论文立题目的及研究内容 |
第2章 Cyclin D1 在三阴性乳腺癌中的异常表达 |
2.1 前言 |
2.2 实验材料 |
2.2.1 细胞株及质粒 |
2.2.2 实验耗材 |
2.2.3 实验试剂 |
2.2.4 实验仪器 |
2.2.5 组织芯片 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 细胞培养 |
2.3.2 去内毒素质粒的提取 |
2.3.3 细胞转染 |
2.3.4 细胞稳定转染 |
2.3.5 细胞荧光共定位分析 |
2.3.6 细胞周期检测 |
2.3.7 细胞凋亡检测 |
2.3.8 划痕实验 |
2.3.9 细胞侵袭能力的测定 |
2.3.10 细胞迁移能力的测定 |
2.3.11 Western blot分析 |
2.3.12 免疫共沉淀(Co-IP)分析 |
2.3.13 组织芯片的免疫组化技术 |
2.3.14 免疫组化结果判定 |
2.4 数据库资源 |
2.4.1 GEO数据库资源 |
2.4.2 数据分析处理所用软件资源 |
2.4.3 统计学分析 |
2.5 实验结果 |
2.5.1 TBNC组织中Cyclin D1 异常转录 |
2.5.2 PPI网络构建 |
2.5.3 KEGG 富集分析Cyclin D1在TNBC中参与的信号通路 |
2.5.4 Cyclin D1在TNBC组织中高表达 |
2.5.5 ER-ADκ在 MDA-MB-231和BT-549 细胞中的表达 |
2.5.6 ER-ADκ在 MDA-MB-231和BT-549 细胞中的定位 |
2.5.7 细胞中表达的ER-ADκ能与Cyclin D1 相互作用 |
2.5.8 ER-ADκ抑制三阴性乳腺癌细胞周期进程 |
2.5.9 ER-ADκ促进三阴性乳腺癌细胞凋亡 |
2.5.10 ER-ADκ促进三阴性乳腺癌细胞迁移 |
2.5.11 ER-ADκ抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭和浸润 |
2.6 讨论 |
2.7 本章小结 |
第3章 ER-ADκ抑制三阴性乳腺癌生长和转移的分子机制 |
3.1 前言 |
3.2 实验材料 |
3.2.1 细胞株及转染试剂 |
3.2.2 实验所用主要仪器及试剂 |
3.2.3 实验所需抗体 |
3.2.4 Q-PCR 实验所需引物 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 细胞培养及转染 |
3.3.2 逆转录(RT)反应 |
3.3.3 Real Time PCR(Q-PCR) |
3.3.4 细胞透射电镜观察 |
3.3.5 统计学分析 |
3.4 实验结果 |
3.4.1 ER-ADκ 抑制三阴性乳腺癌细胞增殖相关通路的活化 |
3.4.2 ER-ADκ 促进三阴性乳腺癌细胞凋亡相关通路的活化 |
3.4.3 ER-ADκ 抑制三阴性乳腺癌转移相关通路的活化 |
3.5 讨论 |
3.6 本章小结 |
第4章 靶向Cyclin D1 胞内抗体抑制三阴性乳腺癌生长和转移机制的体内研究 |
4.1 前言 |
4.2 实验材料 |
4.2.1 实验细胞株 |
4.2.2 实验动物 |
4.2.3 本研究中用到的试剂 |
4.2.4 主要仪器 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 细胞培养 |
4.3.2 动物实验 |
4.3.3 组织H&E染色 |
4.3.4 免疫组化技术 |
4.3.5 TUNEL染色 |
4.3.6 统计分析 |
4.4 实验结果 |
4.4.1 ER-ADκ抑制体内MDA-MB-231 乳腺癌原位生长 |
4.4.2 ER-ADκ抑制三阴性乳腺癌细胞远端转移 |
4.5 讨论 |
4.6 本章小结 |
第5章 结论与展望 |
参考文献 |
作者简介 |
攻读博士期间发表论文 |
致谢 |
(4)ZFP281相关蛋白复合物在小鼠胚胎干细胞中功能研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
ABSTRACT |
主要缩略词表 |
前言 |
第一章 文献综述 |
1 基因组印记 |
1.1 印记基因的发现 |
1.2 印记基因的特点 |
1.3 印记的建立、维持和去除 |
1.4 印记基因在发育和疾病中作用 |
1.5 印记基因的调控机制 |
2 SEC家族与转录调控机制 |
2.1 SEC家族的鉴定 |
2.2 SEC家族与疾病 |
2.3 SEC家族与转录调控 |
2.4 AFF3 的结构特征 |
2.5 AFF3 调控印记基因的表达 |
3 ZFP281的研究进展 |
3.1 ZFP281的鉴定 |
3.2 ZFP281的结构特点 |
3.3 ZFP281的功能 |
4 本课题的科学问题 |
第二章 实验材料与方法 |
1 实验材料 |
2.1.1 细胞系 |
2.1.2 实验试剂 |
2.1.3 实验抗体 |
2 常用溶液配方 |
3 实验耗材 |
4 实验仪器 |
5 实验方法 |
5.1 细胞培养 |
5.2 构建Zfp281和Aff3 pLKO.1 shRNA重组质粒 |
5.3 慢病毒包装与靶细胞的感染 |
5.4 SDS-PAGE与蛋白免疫印迹 |
5.5 制备anti-ZFP281抗体 |
5.6 蛋白质免疫共沉淀 |
5.7 染色质免疫共沉淀与文库构建 |
5.8 亚硫酸氢盐测序分析 |
5.9 免疫荧光 |
5.10 RNA-seq结果分析 |
5.11 ChIP-seq结果分析 |
第三章 实验结果 |
1 AFF3结合的两类染色体特征 |
2 制备并鉴定anti-ZFP281特异性抗体 |
3 ZFP281与AFF3共定位在增强子上 |
4 ZFP281结合在未甲基化Meg3增强子上 |
5 ZFP281对募集AFF3 Dlk1-Dio3基因座增强子是必须的 |
6 ZFP281在转录水平上调节Meg3的表达 |
7 ZFP281募集AFF3在基因组多个增强子 |
8 ZFP281与AFF3共调节基因表达 |
9 小结 |
第四章 讨论与展望 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
作者简介 |
(5)宿主蛋白ID1抑制O型口蹄疫病毒复制的作用机制(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
英文缩略表 |
第一章 绪论 |
1.1 ID蛋白家族与ID1蛋白 |
1.2 Cdh1的生物学功能 |
1.3 FOXO1的生物学功能 |
1.4 FMDV与宿主免疫应答 |
1.4.1 口蹄疫病毒 |
1.4.2 FMDV感染引起的宿主免疫应答 |
第二章 ID1抑制口蹄疫病毒复制 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 生物材料 |
2.1.2 试剂耗材 |
2.1.3 仪器设备 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 口蹄疫病毒增殖与滴度测定 |
2.2.2 Western blot检测 |
2.2.3 RNA提取与q RT-PCR检测 |
2.2.4 构建ID1过表达质粒与细胞系 |
2.2.5 ID1敲除细胞系的构建与验证 |
2.2.6 ID1基因敲除小鼠的繁育 |
2.2.7 小鼠腹腔和骨髓巨噬细胞的制备 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 LC-MS/MS中显着下调的蛋白 |
2.3.2 口蹄疫病毒感染调控ID1蛋白表达 |
2.3.3 口蹄疫病毒感染不影响ID1的转录 |
2.3.4 ID1过表达抑制口蹄疫病毒复制 |
2.3.5 ID1敲除促进口蹄疫病毒复制 |
2.3.6 口蹄疫病毒在ID1基因敲除小鼠中致病性增强 |
2.3.7 ID1基因敲除抑制干扰素表达 |
2.4 分析讨论 |
第三章 口蹄疫病毒通过Cdh1调控ID1的泛素化降解 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 生物材料 |
3.1.2 试剂耗材 |
3.1.3 仪器设备 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 CHX和MG132处理细胞 |
3.2.2 Cdh1过表达和干扰质粒的构建 |
3.2.3 Si USP1、si Smurf2和sh Cdh1 的检测 |
3.2.4 口蹄疫病毒感染后检测Cdh1与ID1的表达 |
3.2.5 检测Cdh1与ID1的结合 |
3.3 实验结果 |
3.3.1 ID1在体内有较短的半衰期 |
3.3.2 成功构建Cdh1过表达和干扰质粒 |
3.3.3 Cdh1调控ID1蛋白的表达 |
3.3.4 口蹄疫病毒感染过程中Cdh1对ID1的调控 |
3.3.5 Cdh1结合ID1并使之泛素化降解 |
3.4 分析讨论 |
第四章 ID1 通过FOXO1 调控口蹄疫病毒复制 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 生物材料 |
4.1.2 试剂耗材 |
4.1.3 仪器设备 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 FOXO1敲除细胞系的构建与验证 |
4.2.2 ID1与FOXO1 相互作用的检测 |
4.2.3 ID1对FOXO1 活性影响的检测 |
4.2.4 ID1 影响FOXO1 抑制IFN-β活性的检测 |
4.2.5 FOXO1 调控IRF3 活性的检测 |
4.2.6 ID1 调节FOXO1 结合IRF3 启动子的检测 |
4.2.7 ID1 通过HDAC4 调控FOXO1 活性的检测 |
4.3 实验结果 |
4.3.1 FOXO1敲除抑制口蹄疫病毒复制 |
4.3.2 ID1 结合转录因子FOXO1 |
4.3.3 ID1 调控转录因子FOXO1 活性 |
4.3.4 ID1 过表达削弱FOXO1对IFN-β活性的抑制 |
4.3.5 过表达FOXO1 抑制IRF3 活性 |
4.3.6 ID1 抑制FOXO1与IRF3 启动子的结合 |
4.3.7 ID1 通过HDAC4 调控FOXO1 活性 |
4.4 分析讨论 |
第五章 调控ID1的micro RNA分子探索 |
5.1 实验材料 |
5.1.1 生物材料 |
5.1.2 试剂耗材 |
5.1.3 仪器设备 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 Micro RNA微阵列芯片分析 |
5.2.2 Micro RNA的提取与验证 |
5.2.3 生物信息学预测micro RNA的调控靶标 |
5.3 实验结果 |
5.3.1 Micro RNA微阵列芯片分析 |
5.3.2 口蹄疫病毒感染后差异表达的micro RNA |
5.3.3 生物信息学预测调控ID1的micro RNA |
5.4 分析讨论 |
第六章 全文结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历 |
(6)FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
1 引言 |
1.1 颗粒细胞在哺乳动物卵泡发育中的作用 |
1.1.1 哺乳动物卵泡发育的特点 |
1.1.2 卵泡发育的调控 |
1.1.3 颗粒细胞的功能 |
1.1.4 颗粒细胞对卵泡发育的影响 |
1.1.5 颗粒细胞对卵泡闭锁的影响 |
1.2 FHL2基因的研究进展 |
1.2.1 FHL2基因的结构 |
1.2.2 FHL2基因的表达与细胞定位 |
1.2.3 FHL2基因的主要生物学功能 |
1.2.4 FHL2影响卵巢颗粒细胞的功能研究 |
1.3 蛋白质互作研究进展 |
1.3.1 酵母双杂交技术 |
1.3.2 酵母双杂交技术的特点 |
1.3.3 酵母双杂交技术的应用 |
1.4 本研究的目的和意义 |
2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及表达和定位 |
2.1 材料 |
2.1.1 样品来源 |
2.1.2 主要试剂 |
2.1.3 主要仪器设备 |
2.1.4 实验主要溶液配制 |
2.1.5 主要生物信息学分析软件 |
2.2 方法 |
2.2.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
2.2.2 绵羊FHL2基因的克隆鉴定及生物信息学分析 |
2.2.3 免疫组化分析 |
2.2.4 绵羊卵巢颗粒细胞的原代培养及鉴定 |
2.2.5 FHL2在绵羊卵巢颗粒细胞中的表达分析 |
2.2.6 细胞定位 |
2.2.7 数据统计 |
2.3 结果 |
2.3.1 FHL2基因在绵羊不同组织中的表达量分析 |
2.3.2 绵羊FHL2基因CDS序列克隆及生物信息学分析 |
2.3.3 FHL2在绵羊卵巢组织中的表达定位 |
2.3.4 绵羊卵巢颗粒细胞体外培养的形态与特征 |
2.3.5 FHL2在体外培养的绵羊卵巢颗粒细胞中的表达定位 |
2.3.6 Western Blot检测绵羊卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
2.4 讨论 |
2.4.1 体外分离培养绵羊原代卵巢颗粒细胞 |
2.4.2 FHL2的表达及细胞定位研究 |
2.5 小结 |
3 绵羊FHL2基因过表达及siRNA干扰效果研究 |
3.1 材料 |
3.1.1 样品来源 |
3.1.2 主要试剂与耗材 |
3.1.3 试验主要仪器设备 |
3.1.4 主要溶液的配置 |
3.2 方法 |
3.2.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2载体的构建与鉴定 |
3.2.2 过表达载体pcDNA3.1-FHL2转染绵羊卵巢颗粒细胞 |
3.2.3 siRNA的设计合成和干扰效果检测 |
3.2.4 数据统计 |
3.3 结果 |
3.3.1 真核表达载体pcDNA3.1-FHL2重组质粒的构建与鉴定 |
3.3.2 过表达质粒转染对FHL2mRNA和蛋白表达水平的影响 |
3.3.3 mRNA水平上检测siFHL2的干扰效果 |
3.3.4 蛋白水平上检测siFHL2的干扰效果 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
4 FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响研究 |
4.1 材料 |
4.1.1 样品来源 |
4.1.2 主要试剂与耗材 |
4.1.3 试验主要仪器设备 |
4.2 方法 |
4.2.1 FHL2基因过表达对绵羊卵巢颗粒功能的影响 |
4.2.2 干扰FHL2基因对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响 |
4.2.3 数据统计 |
4.3 结果 |
4.3.1 过表达和干扰FHL2表达后对绵羊颗粒细胞形态变化的影响 |
4.3.2 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞增殖的影响 |
4.3.3 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞凋亡的影响 |
4.3.4 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞周期的影响 |
4.3.5 FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞激素分泌的影响 |
4.4 讨论 |
4.4.1 FHL2对细胞周期的影响 |
4.4.2 FHL2对细胞凋亡的影响 |
4.4.3 FHL2对激素分泌水平的影响 |
4.5 小结 |
5 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交CDNA文库的构建及FHL2互作蛋白的筛选 |
5.1 材料 |
5.1.1 试验材料 |
5.1.2 主要试剂 |
5.1.3 主要溶液配制 |
5.2 方法 |
5.2.1 绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定 |
5.2.2 绵羊FHL2基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定 |
5.2.3 利用所构建酵母双杂交系统筛选与FHL2互作的蛋白 |
5.2.4 FHL2与筛选宿主蛋白的一对一互作验证 |
5.3 结果 |
5.3.1 绵羊卵巢酵母双杂交文库的构建 |
5.3.2 pGBKT7-FHL2酵母诱饵质粒的构建 |
5.3.3 酵母双杂交互作蛋白对照实验 |
5.3.4 筛选与FHL2相互作用的蛋白 |
5.3.5 候选克隆质粒测序结果分析 |
5.3.6 FHL2与筛选宿主蛋白互作的验证 |
5.4 讨论 |
5.4.1 酵母双杂交cDNA文库的构建 |
5.4.2 酵母诱饵质粒的构建 |
5.4.3 利用酵母双杂交筛选互作蛋白研究 |
5.5 小结 |
6 FHL2在TGF-β信号通路中对绵羊卵巢颗粒细胞的调控作用 |
6.1 材料 |
6.1.1 样品来源 |
6.1.2 试验主要溶液配制 |
6.2 方法 |
6.2.1 绵羊TGF-β1蛋白的构建和表达 |
6.2.2 添加外源蛋白TGF-β1 |
6.2.3 FHL2表达对TGF-β1及TGF-βR基因的影响 |
6.2.4 TGF-β1抑制剂处理颗粒细胞 |
6.2.5 TGF-β1调控FHL2在不同信号通路中的作用研究 |
6.2.6 数据统计 |
6.3 结果 |
6.3.1 真核表达载体pFUSERTL1-TGF-β1重组质粒的构建与鉴定 |
6.3.2 Western Blot鉴定TGF-β1蛋白的表达 |
6.3.3 TGF-β1促进卵巢颗粒细胞中FHL2的表达 |
6.3.4 FHL2对TGF-β1、TGF-βR基因表达的影响 |
6.3.5 TGF-β信号通路对FHL2、TGF-β1和TGF-βR表达的影响 |
6.3.6 TGF-β1参与调控FHL2基因表达的信号通路研究 |
6.4 讨论 |
6.4.1 TGF-β1调控颗粒细胞中FHL2的表达 |
6.4.2 TGF-β1调控FHL2基因的信号通路研究 |
6.5 小结 |
7 结论 |
8 本研究创新点 |
参考文献 |
在读期间发表的学术论文 |
作者简介 |
致谢 |
附件 |
(7)CtBP在转录调控和细胞代谢中的作用(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
主要英文缩略词 |
绪言 |
第1章 文献综述 |
1.1 代谢、表观遗传学及疾病的关系 |
1.1.1 代谢中间产物驱动的染色质动态变化 |
1.1.2 代谢中间产物、染色质动态变化及疾病的关系 |
1.2 CtBP蛋白家族的研究进展 |
1.2.1 CtBP蛋白的功能结构域 |
1.2.2 CtBP蛋白的表观遗传调控功能及其在胞质中的功能 |
1.3 CtBP蛋白与细胞代谢的关系 |
1.3.1 CtBP蛋白的氧化还原感受器功能 |
1.3.2 CtBP蛋白在乳腺癌转录调控和代谢中的作用 |
第2章 实验材料与方法 |
2.1 实验材料及试剂 |
2.1.1 宿主菌及细胞系 |
2.1.2 质粒 |
2.1.3 培养基(本实验室标准配方) |
2.1.4 细胞RNAi、转染相关试剂 |
2.1.5 质粒提取所需缓冲液 |
2.1.6 分子克隆试剂和试剂盒 |
2.1.7 CO-IP相关试剂 |
2.1.8 Western Blot免疫印迹所需缓冲液 |
2.1.9 GST、MBP融合蛋白诱导表达、提取纯化相关试剂 |
2.1.10 CtBP蛋白多克隆抗体的制备及ELISA检测所需材料试剂 |
2.1.11 免疫染色抗体 |
2.1.12 酶活检测所需试剂 |
2.1.13 主要仪器设备 |
2.1.14 本文所使用的引物序列 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 重组质粒的构建 |
2.2.2 果蝇Kc细胞的培养和瞬时转染 |
2.2.3 细胞的免疫染色 |
2.2.4 细胞RNAi实验 |
2.2.5 免疫共沉淀(CO-IP)方法 |
2.2.6 GST、MBP融合蛋白的诱导表达、提取纯化 |
2.2.7 CtBP抗血清的制备及ELISA、Westen Blot检测 |
2.2.8 酶活检测实验 |
第3章 实验结果与讨论 |
3.1 引言 |
3.2 CtBP蛋白与代谢酶PHGDH的关系 |
3.2.1 前言 |
3.2.2 CtBP蛋白与PHGDH蛋白的序列结构同源性分析 |
3.2.3 3-磷酸甘油酸可能是CtBP的潜在底物 |
3.2.4 CtBP蛋白与PHGDH蛋白的功能关系 |
3.2.5 讨论 |
3.3 代谢中间产物对CtBP蛋白功能的影响 |
3.3.1 前言 |
3.3.2 3-磷酸甘油酸能够增强CtBP的转录辅抑制活性 |
3.3.3 细胞内NADH/NAD+水平影响CtBP的亚细胞定位 |
3.3.4 讨论 |
3.4 工作总结与展望 |
3.4.1 工作总结 |
3.4.2 对今后工作的考虑和建议 |
参考文献 |
作者简介 |
致谢 |
(8)金属硫蛋白-3(MT-3)相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及性质研究 ——探索金属硫蛋白-3及其相互作用蛋白功能的分子机制(论文提纲范文)
缩略词表 |
中文摘要 |
英文摘要 |
第一部分 文献综述 |
第一节 金属硫蛋白概述 |
第二节 金属硫蛋白-3的研究进展 |
第三节 金属硫蛋白-3与Alzheimer’s症(AD)的关系 |
第四节 本研究的目的、意义及主要的技术路线 |
第二部分 与MT-3相互作用蛋白的筛选 |
第一节 诱饵质粒的构建及特性分析 |
第二节 筛选人脑cDNA文库 |
第三节 从双阳性克隆中分离AD质粒及其性质鉴定 |
第四节 阳性AD质粒测序并作序列同源性查询与分析以确定侯选蛋白 |
第三部分 细胞核dUTPase与MT-3在酵母中的相互作用及其的表达纯化和酶活性测定研究 |
第一节 全长细胞核dUTPase cDNA的克隆 |
第二节 细胞核dUTPase与金属硫蛋白-3在酵母中的相互作用 |
第三节 细胞核dUTPase在E.coli中的表达、纯化和酶活性测定 |
第四部分 dUTPase与MT-3相互作用的确证 |
第一节 dUTPase、MT-3及MT-1真核标签表达质粒的构建 |
第二节 dUTPase与MT-3在293细胞中的相互作用(in vivo) |
第三节 dUTPase与MT-3相互作用的可能生物学意义讨论 |
第五部分 细胞核dUTPase、G-蛋白Rab3a与MT-3相互作用的生物学活性研究 |
第一节 dUTPase、Rab3a对MT-3抑制PC12生长作用的影响 |
第二节 MT-3对dUTPase保护细胞作用的影响 |
第六部分 MT-3及其相互作用蛋白的多抗血清的制备以及在蛋白研究中的初步应用 |
第一节 MT-3及其相互作用蛋白的多克隆抗体制备 |
第二节 制备多抗在MT-3受体以及相互作用的体外免疫共沉淀验证实验中的应用 |
总结 |
研究设想 |
硕士研究生期间发表与待发表的文章 |
参加会议及相关会议论文 |
附一: 酵母双杂交实验的培养基 |
附二: DNA序列分析结果图谱 |
参考文献 |
致谢 |
(9)马氏珠母贝免疫效应分子的克隆及功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
1 文献综述 |
1.1 海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展 |
1.2 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶研究进展 |
1.3 Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制因子研究进展 |
1.4 g型溶菌酶研究进展 |
1.5 鞘脂蛋白研究进展 |
1.6 研究目的和意义 |
2 马氏珠母贝TLS蛋白酶基因与KuPI蛋白酶抑制剂的基因克隆与功能研究 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验样本 |
2.1.2 实验试剂 |
2.1.3 实验仪器 |
2.1.4 实验主要溶液与试剂 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 马氏珠母贝免疫效应分子筛选 |
2.2.2 PmTLS与 PmKuPI基因相关引物设计 |
2.2.3 总RNA提取 |
2.2.4 cDNA第一链的合成 |
2.2.5 中间片段克隆 |
2.2.6 3'和5'端RACE扩增 |
2.2.7 生物信息学分析 |
2.2.8 组织表达及PAMPs刺激后时序表达分析 |
2.2.9 重组蛋白制备 |
2.2.10 纯化蛋白抗菌活性检测 |
2.2.11 透射电镜观察纯化蛋白作用细菌后的形态变化 |
2.3 结果与分析 |
2.3.1 PmTLS与 PmKuPI的基因克隆 |
2.3.2 PmTLS与 PmKuPI理化性质分析 |
2.3.3 PmTLS与 PmKuPI同源性分析 |
2.3.4 PmTLS与 PmKuPI基因mRNA的组织定量分析 |
2.3.5 PAMPs刺激后PmTLS基因mRNA在血细胞的时序表达分析 |
2.3.6 PmTLS与 PmKuPI重组蛋白的表达 |
2.3.7 rPmTLS与 rPmKuPI的抗菌活性测定 |
2.3.8 rPmTLS与 rPmKuPI抗菌作用机制 |
2.4 讨论 |
2.4.1 PmTLS蛋白酶与PmKuPI蛋白酶抑制剂基因的分子特征 |
2.4.2 PmTLS蛋白酶与PmKuPI蛋白酶抑制剂基因mRNA差异分析 |
2.4.3 PmTLS蛋白酶与PmKuPI蛋白酶抑制剂的原核表达 |
2.4.4 rPmTLS的功能验证 |
2.4.5 rPmKuPI的功能验证 |
3 马氏珠母贝g型溶菌酶与鞘脂蛋白Saposin-B的基因克隆与功能研究 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 实验样本 |
3.1.2 实验试剂 |
3.1.3 实验仪器 |
3.1.4 实验主要溶液与试剂 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 马氏珠母贝免疫效应分子筛选 |
3.2.2 PmlysG与 PmSapB基因相关引物设计 |
3.2.3 基因克隆及生物信息学分析 |
3.2.4 组织差异性及PAMPs刺激后时序表达分析 |
3.2.5 重组蛋白制备 |
3.3 结果与分析 |
3.3.1 PmlysG与 PmSapB的基因克隆 |
3.3.2 PmlysG与 PmSapB理化性质分析 |
3.3.3 PmlysG与 PmSapB同源性分析 |
3.3.4 PmlysG与 PmSapB基因mRNA的组织表达分析 |
3.3.5 PAMPs刺激后PmlysG与 PmSapB基因mRNA在肝胰腺的时序表达分析 |
3.3.6 PmlysG与 PmSapB重组蛋白的表达 |
3.4 讨论 |
3.4.1 马氏珠母贝g型溶菌酶与鞘脂蛋白Saposin-B基因的分子特征 |
3.4.2 马氏珠母贝g型溶菌酶与鞘脂蛋白Saposin-B基因mRNA差异分析 |
3.4.3 马氏珠母贝g型溶菌酶与鞘脂蛋白Saposin-B的原核表达 |
4 结论 |
参考文献 |
致谢 |
作者简介 |
导师简介 |
(10)红螯螯虾胚胎发育组学分析及免疫基因功能研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
第1章 绪论 |
1.1 红螯螯虾胚胎发育及组学应用 |
1.1.1 红螯螯虾胚胎发育研究进展 |
1.1.1.1 形态学研究 |
1.1.1.2 生化组成研究 |
1.1.1.3 酶学研究 |
1.1.1.4 环境影响 |
1.1.1.5 分子生物学研究 |
1.1.2 组学技术及其在甲壳动物胚胎发育研究中的应用前景 |
1.1.2.1 组学技术的发展 |
1.1.2.2 组学技术在甲壳动物胚胎研究中的应用 |
1.2 甲壳动物先天免疫 |
1.2.1 C型凝集素的研究进展 |
1.2.1.1 模式识别受体 |
1.2.1.2 C型凝集素的结构特点 |
1.2.1.3 C型凝集素的生物学功能 |
1.2.2 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子的研究进展 |
1.2.2.1 丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制因子 |
1.2.2.2 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子的作用机理和抑制特异性 |
1.2.2.3 Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子的生物学功能 |
1.3 本研究的目的和意义 |
第2章 红螯螯虾胚胎发育转录组比较分析 |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.2.1 胚胎取样 |
2.2.2 总RNA提取 |
2.2.3 文库构建和Illuminate测序 |
2.2.4 Reads质量控制、转录组组装与功能注释 |
2.2.5 差异表达基因的鉴定 |
2.2.6 荧光定量PCR验证 |
2.3 结果 |
2.3.1 胚胎发育时期的鉴定 |
2.3.2 测序拼接与聚类 |
2.3.3 功能基因注释与分类 |
2.3.4 差异表达基因分析 |
2.3.5 差异表达基因功能富集分析 |
2.3.6 荧光定量PCR验证 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第3章 红螯螯虾胚胎发育过程中microRNA的鉴定与分析 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.2.1 胚胎取样与总RNA的提取 |
3.2.2 小RNA文库构建与测序 |
3.2.3 红螯螯虾miRNA的鉴定 |
3.2.4 miRNA的差异表达分析 |
3.2.5 miRNA靶基因的预测 |
3.2.6 miRNA及靶基因共表达分析 |
3.2.7 荧光定量PCR验证miRNA |
3.3 结果 |
3.3.1 小RNA高通量测序 |
3.3.2 miRNA的鉴定 |
3.3.3 差异表达miRNA的鉴定 |
3.3.4 差异表达miRNA靶基因的预测及注释 |
3.3.5 差异表达miRNA关联靶基因共表达分析 |
3.3.6 荧光定量PCR验证miRNA |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第4章 红螯螯虾C型凝集素(CqCTL)的基因克隆及表达 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.1.1 实验动物、菌株和质粒 |
4.2.1.2 实验仪器和设备 |
4.2.1.3 实验试剂和耗材 |
4.2.1.4 实验试剂配制 |
4.2.2 实验方法 |
4.2.2.1 总RNA提取和c DNA合成 |
4.2.2.2 CqCTL的克隆 |
4.2.2.3 CqCTL的生物信息学分析 |
4.2.2.4 CqCTL mRNA表达的定量分析 |
4.2.2.5 CqCTL的重组表达及纯化 |
4.3 结果 |
4.3.1 CqCTL cDNA克隆与鉴定 |
4.3.2 CqCTL的序列比对与进化树分析 |
4.3.3 CqCTL mRNA的组织分布 |
4.3.4 重组CqCTL的表达和纯化 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
第5章 红螯螯虾Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子(CqKPI)的基因克隆、表达及功能研究 |
5.1 引言 |
5.2 材料与方法 |
5.2.1 实验材料 |
5.2.2 实验方法 |
5.2.2.1 总RNA提取和c DNA合成 |
5.2.2.2 CqKPI的克隆 |
5.2.2.3 CqKPI的生物信息学分析 |
5.2.2.4 CqKPI mRNA表达的定量分析 |
5.2.2.5 CqKPI的重组表达及纯化 |
5.2.2.6 重组CqKPI微生物结合实验 |
5.2.2.7 Western blot法检测蛋白 |
5.2.2.8 微生物生长抑制实验 |
5.3 结果 |
5.3.1 CqKPI cDNA克隆与鉴定 |
5.3.2 CqKPI的序列比对与进化树分析 |
5.3.3 CqKPI mRNA的组织分布 |
5.3.4 重组CqKPI的表达和纯化 |
5.3.5 重组CqKPI微生物结合活性 |
5.3.6 重组CqKPI微生物生长抑制活性 |
5.4 讨论 |
5.5 小结 |
第6章 结论、创新点与展望 |
6.1 主要结论 |
6.2 创新点 |
6.3 展望 |
参考文献 |
致谢 |
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
四、神经生长抑制因子相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及其生物学特性(论文参考文献)
- [1]Hc-SPI-I8抑制宿主凝血及炎症反应的功能及机制研究[D]. 吴飞. 浙江大学, 2021
- [2]SIBSD1对番茄叶片衰老和果实糖度的调控[D]. 樊友宏. 合肥工业大学, 2021(02)
- [3]抗Cyclin D1胞内抗体对三阴性乳腺癌生长和转移的抑制作用及机制研究[D]. 张影. 吉林大学, 2020(03)
- [4]ZFP281相关蛋白复合物在小鼠胚胎干细胞中功能研究[D]. 王艳. 东南大学, 2020
- [5]宿主蛋白ID1抑制O型口蹄疫病毒复制的作用机制[D]. 任亭亭. 中国农业科学院, 2020(01)
- [6]FHL2对绵羊卵巢颗粒细胞功能的影响及机制研究[D]. 张丽萌. 河北农业大学, 2020(01)
- [7]CtBP在转录调控和细胞代谢中的作用[D]. 成琳. 东南大学, 2017(05)
- [8]金属硫蛋白-3(MT-3)相互作用蛋白的分子克隆、鉴定及性质研究 ——探索金属硫蛋白-3及其相互作用蛋白功能的分子机制[D]. 陈巧林. 扬州大学, 2002(01)
- [9]马氏珠母贝免疫效应分子的克隆及功能研究[D]. 何军军. 广东海洋大学, 2020(02)
- [10]红螯螯虾胚胎发育组学分析及免疫基因功能研究[D]. 王燕. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所), 2020(01)