一、新疆出血热病毒反向被动血凝和血凝抑制试验的改进研究（论文文献综述）
闫芳域[1]（2018）在《出血热相关病毒核酸检测技术研究》文中研究指明病毒性出血热（Viral hemorrhagic fevers,VHFs）是一组病毒性疾病,主要以出血、突起发热和休克为特征。出血热相关的病毒性疾病起病急,随着全球经济一体化及现代交通运输方式的快速发展,传染病跨境传播的风险不断加大,对相应病毒性传染病的组合检测技术提出了更高的要求。目前,实验室主要是通过病毒分离,检测病毒核酸、抗原以及特异性抗体等方法进行实验室诊断。病毒分离被认为是诊断病毒感染的金标准,但是由于耗费时间长,需要标本量大,无法进行多元的检测。本科室已建立了按照症候群和科属分组的多重实时荧光定量RT-PCR检测方法,在分地区组合的检测方法上还有待完善。本实验的主要内容是针对按地区分组的出血热及其相关病毒病分组的核酸检测方法,包括实时荧光定量PCR法和液相芯片法。实时荧光定量PCR技术是一种定量分析的方法,这种方法在PCR反应体系中加入荧光基团,并同时利用荧光积累,实时监测整个PCR进程,最后通过绘制标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术的灵敏度高且特异性强,特点是省时、便利和快捷,并可以进行绝对或相对定量分析,是实验室常用的检测方法。液相芯片技术是1995年美国Lutminex公司开发的一种高通量检测平台,它可以定性或定量的在一个反应体系中检测100种不同分析物,其优点是节省时间、节省标本,高通量。目前较多应用于蛋白质和核酸的检测研究,如细胞因子的活动水平检测、肿瘤标记物、激素水平和PCR产物的检测等。为了满足出血热相关病毒性疾病跨境传播检出的需要,本研究拟建立按照地区分组的病毒核酸检测方法。首先将纳入病毒按照高发地区进行分组后,分别设计病毒的引物和探针。针对实时荧光定量PCR方法使用的探针为TaqMan探针,针对液相芯片技术的探针5’端添加12C连接臂后进行氨基修饰。使用体外转录得到的各个病毒RNA参考品对两种方法进行灵敏度的评价。1.利用RNA参考品进行分组的多重实时荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,评价各个检测的灵敏度,检出限在101～103拷贝/μl。利用50份未感染人血清和所有纳入病毒的模拟标本进行特异性评价,未见有扩增,表明此方法具有良好的特异性。最后通过重复性实验验证各组检测方法的稳定性,显示组内变异系数小于6.84%,组间变异系数小于8.33%。2.将探针偶联到羧基荧光微球后对RNA参考品分组进行的Tem-PCR扩增产物进行检测,评价检测方法的灵敏度和稳定性。利用50份健康人血清标本和30份未感染纳入疾病的病人血清进行特异度检测。结果显示所建立的基于荧光微球的核酸检测方法可特异性检出相应病原体核酸,检测限可达102～106拷贝/μl,特异性为100%,组内变异系数均在18%以下,组间变异系数在25%以下,稳定性尚可。本研究建立了出血热及其相关病毒病的快速组合核酸检测技术,并对其进行了初步评价,对纳入病毒病的出入境检测和临床诊断具有积极意义。
李茂中[2]（2012）在《人工感染兔出血症病毒兔肝脏的蛋白质组学分析》文中研究指明兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic diseasevirus, RHDV）引起的兔的一种急性、败血性、高度接触性传染病，本病毒属嵌杯状病毒科（Caliciviridae）。自从上世纪八十年代首次在中国报道后，现已成为兔的一种世界流行的毁灭性传染病，给国内外养兔业带来了巨大的经济损失。病毒主要侵害兔的肝脏、肺脏和脾脏等器官，尤其以肝脏病变最为严重，是RHDV增殖的主要场所。因此，通过对肝脏群体蛋白质组学的研究对提示RHDV的感染机制和致病作用具有重大意义。本研究首次应用双向凝胶电泳比较感染后肝脏表达蛋白的差异,旨在从蛋白质群体水平上分析RHDV感染后兔肝脏蛋白表达的差异，并对筛选蛋白进行了相关功能验证，为进一步从蛋白质水平研究和揭示RHDV感染机制奠定基础。本研究利用双向凝胶电泳（2-DE）结合质谱技术对人工感染RHDV成年兔和未感染对照组兔肝脏组织的群体蛋白质表达情况进行分析。获得49个具有统计学意义的表达差异蛋白点,其中15个在感染中表达上调,34个表达下调。生物信息学分析表明这些蛋白质主要与能量代谢、物质运输有关，同时有部分属于细胞结构蛋白和其他蛋白，其中有些在病毒感染过程中起到了作用；筛选出了6种可能在病毒感染过程中起作用的差异蛋白：α1抗胰蛋白酶（Α1AT）、血清白蛋白前体（PA）、细胞色素P-450（CYP450）、纤维蛋白原（Fg）、层粘连蛋白受体（LR）和核不均一性核糖核蛋白（hnRNP）。应用荧光定量PCR技术对其中的A1AT、PA、hnRNP的转录水平进行了分析，结果表明A1AT、PA和hnRNP在RHDV感染组肝脏组织中的mRNA水平与未感染对照组的比值分别是0.217,0.299和0.829，变化趋势和其在相应蛋白质下调表达的变化是一致的。基于2-DE分析、荧光定量PCR检测和生物信息学分析，提示A1AT可能在病毒感染中挥发作用。从兔肝脏中提取总RNA，反转录成cDNA, PCR扩增，获得长度为1171bp的A1AT基因片段，分别与pET-30a和pEGFP-N1载体相连，分别构建A1AT的原核表达载体pET-30a-A1AT和A1AT的真核表达载体pEGFP-N1-A1AT。通过IPTG诱导原核表达，得到了可溶性A1AT蛋白。通过免疫共沉淀试验、血凝试验以及GST-pulldown试验，验证A1AT与VP60的相互作用，结果表明：免疫共沉淀试验和GST-polldown试验均表明A1AT与VP60之间存在相互作用；用A1AT中和RHDV后，血凝试验显示可抑制RHDV的血凝活性。将构建的pEGFP-N1-A1AT与pcDNA3.1-VP60重组表达载体共转染HEK293T细胞，进行激光共聚焦试验，表明A1AT能够与VP60在细胞内产生共定位。本研究通过2-DE分析结合质谱技术，获得了人工感染RHDV兔肝脏组织的差异表达蛋白质数据；生物信息学分析和转录水平分析，确定A1AT与VP60之间可能存在相互作用；通过免疫共沉淀试验、血凝试验、GST-pulldown试验和激光共聚焦技术证明了VP60可以与A1AT蛋白发生相互作用，并存在共定位，为进一步深入研究RHDV致病机理提供了参考。
相大鹏,师永霞,李小波[3]（2009）在《新疆出血热的研究进展》文中研究表明克里米亚-刚果出血热（Crimean Congo hemorrhagic fever,CCHF）于1944年发现于俄国的克果米亚,它是由克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV）引起的,是一种流行于中国新疆南部、俄国北部、中东、南部欧亚大陆及非洲撒哈拉地区的烈性传
罗渊[4]（2008）在《五种虫媒病毒悬浮芯片检测方法的建立》文中研究指明虫媒病毒又称节肢动物病毒,是指能在敏感的节肢动物,如蚊、蜱、白蛉、蠓等吸血昆虫体内繁殖但不致病,通过吸血昆虫叮咬而在人畜间传播的一组病毒。国际上已发现的虫媒病毒约537种,其中130余种可引起人畜疾病,表现为发热、皮疹、出血热甚至病毒性脑炎等。在人类历史上虫媒病毒曾经使成千上万的人畜患病或死亡,造成巨大的经济损失。目前,虫媒病毒仍然在各国甚至在世界范围造成严重传染病的流行。我国幅员辽阔,地理景观复杂,媒介生物众多,存在多种虫媒病毒。目前已证实乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、新疆出血热病毒、登革热病毒等四种虫媒病毒在我国存在与流行。此外,随着国际交往的日益频繁,境外虫媒病毒病传入我国的可能性也显着增加,因此,早期、快速、准确地检测虫媒病毒的感染具有重要的意义。悬浮芯片是近年来新兴的一种可对多指标同时进行定性、定量分析的新型芯片技术,它创新性地将细胞大小的微球作为检测探针的载体,并悬浮于液相之中,为生物反应提供了极佳的反应环境,有利于核酸和蛋白质保持天然构象,具有高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、信噪比好、灵活性大等优点。本研究以登革热病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒、黄热病病毒等5种黄病毒属的虫媒病毒为研究对象,设计针对以上病毒的通用扩增引物和特异检测探针,再结合悬浮芯片技术,以建立能快速甄别以上5种病毒并对登革热病毒进行基因分型的悬浮芯片检测方法,为虫媒病毒的检测与鉴定提供一种新的方法。首先,从Genebank中收集以上五种虫媒病毒的全部基因组序列。接着,利用Clustal X 1.83和DNAMAN 6.0软件对病毒基因组序列进行属间、种间和型间比对,并参考相关文献,在黄病毒属NS5区设计一对通用扩增引物,用于5种病毒的RT-PCR扩增。进而,在靶核酸扩增区内设计八条特异性检测探针,用于五种虫媒病毒的检测和登革热病毒的基因分型。引物和探针均适当进行简并设计,以尽量覆盖病毒所有的分离株。通用引物扩增的目的序列为266 bp;寡核苷酸探针的长度均为20 nt,Tm值介于52±5℃。将设计好的引物和探针进行Blast分析,验证其种属特异性,然后将探针共价交联到不同的色标微球上,以制备悬浮芯片。进而,在对悬浮芯片的检测条件进行优化的基础上,进一步对所建立方法的检测重复性、特异性和灵敏度进行验证。最后,对模拟混合标本及本实验室以往采集和保存的55份标本进行检测,并和特异RT-PCR检测方法进行平行比较。八种（型）黄病毒经敏感细胞增殖培养后,用所设计的通用引物进行逆转录扩增,琼脂糖凝胶电泳显示不但均扩增出了目的条带,而且条带清晰、明亮、单一,表明所设计的通用引物能对以上病毒进行有效扩增。通过一系列的预实验,对悬浮芯片的检测条件进行了摸索和优化,将其杂交条件确定为52℃反应1530min。在此条件下,利用本方法对该八种（型）病毒进行多批次的检测,不但能够准确鉴定病毒种类并对登革热病毒准确分型,而且批次间的检测荧光强度值的变异系数（CV）均在8%以内,表明本方法具有很好的可重复性和稳定性。通过同时检测流感病毒、狂犬病毒、基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒和圣路易斯脑炎病毒等无关病毒和乙型脑炎病毒、西尼罗病毒和登革热病毒等可检病毒,对其检测特异性进行验证。结果显示,本方法能对目的病毒进行有效甄别,没有任何的假阳性结果和明显的非特异信号,表明本方法有着很好的检测特异性。最后,以JEV、WNV和YF为例,在空斑滴定病毒的基础上,对本方法的检测灵敏度进行了确证,结果显示本法对JEV和YF的检测灵敏度可达1.4个PFU,而WNV的可达14个PFU,表明本方法的检测灵敏度较高,有应用于临床检测的良好前景。将登革热病毒14型的RNA分别两两混合,模拟混合感染标本,用所建立的方法均可对这六种组合进行准确鉴定,而且没有明显的非特异信号,表明它可用于混合标本的检测。另外,对本室以前采集并保存的多种标本共55份,用本法进行检测,和特异RT-PCR检测方法的结果相比,本法的检测准确度可达98.2%,而特异度为100%。通过Kappa检验（即一致性检验）,得出χ2= 0 <χ2（1）0.05 =3.841,所以P>0.05,表明悬浮芯片方法和特异RT-PCR的检测结果之间的差别无统计学意义,可以认为悬浮芯片方法的检测结果是可信的。将通用引物RT-PCR扩增技术、核酸分子杂交技术和悬浮芯片技术有机结合在一起,建立了能同时检测登革热病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒和黄热病病毒等5种虫媒病毒,并能对登革热病毒14型进行分型的悬浮芯片检测方法。经实验验证,本方法有着良好的检测重复性、特异性和灵敏度,不但可以用于单一病毒样本的检测,而且还可应用于混合样本的检测。经统计学分析,本法和种特异的RT-PCR检测方法相比,有着很好的一致性,但是它在未知标本的快速、高通量检测中有着巨大的优势。本研究在国内外率先将悬浮芯片技术应用于以上虫媒病毒核酸的检测,不但能够早期检测虫媒病毒感染,而且整个实验操作过程简便、快速。为在媒介及人和动物标本中进行以上八种（型）病原体筛查和流行病学本底调查提供技术手段,在传染病的流行病学调查、临床诊断、疾病预防控制及防生反恐中病原体检测等方面都具有重要意义。
赵晓冬[5]（2005）在《新疆出血热病毒感染乳鼠的实验病理学研究》文中指出新疆出血热（Xinjiang hemorrhagic fever,XHF）是由新疆出血热病毒引起的、硬蜱传播的自然疫源性传染病。本研究从不同感染途径和攻毒后不同时间点两个方面,通过光镜、电镜、免疫组化、原位杂交和RT-PCR等多种技术手段,观察新疆出血热病毒感染乳鼠后引起的病理学变化,建立病理学诊断方法,初步探讨新疆出血热的发病机理。 结果:1、乳鼠经皮下和腹腔两种途径接种XHF病毒后均出现肝细胞的变性、坏死等病理学改变,肝细胞的感染与损伤不伴有明显的炎性反应;部分乳鼠的脑组织亦出现出血改变。2、免疫组化可在肝细胞胞浆查见病毒抗原,原位杂交可在肝细胞胞浆查见病毒核酸,透射电子显微镜下可在肝细胞胞浆内查见病毒粒子,RT-PCR可在心、肝、脾、肾以及脑组织内检测到病毒核酸。3、通过感染后不同时间的动态病理学观察发现,肝细胞的损伤于攻毒后4到7天逐渐加重,以第6、7两天病变最为典型;肝组织内病毒抗原或核酸的阳性信号多与肝细胞的变性、坏死改变同时出现。 结论:1、乳鼠对新疆出血热病毒敏感,经皮下与腹腔接种病毒均可发病。2、肝脏是新疆出血热病毒感染乳鼠的主要靶器官,主要病变为肝实质细胞的变性、坏死。3、免疫组化、原位杂交、透射电子显微镜技术与RT-PCR技术相结合可对组织中的新疆出血热病毒进行检测。4、经皮下与腹腔注射病毒悬液所引起的组织病理学变化、病变进展、转归以及病毒分布大致相同,二者均可作为临床新疆出血热病毒感染的模拟途径。5、感染后不同时间的动态病理学观察结果提示,肝细胞的损伤可能是病毒的致细胞病变效应所直接介导的。
冯崇慧[6]（2004）在《新疆出血热病毒的实验室诊断方法》文中进行了进一步梳理
冯崇慧,高琦,王冬莉[7]（2004）在《新疆出血热病毒反向被动血凝和血凝抑制试验的改进研究》文中提出本文报道采用戊二醛、丙酮醛和戊二醛-甲醛双醛化绵羊红细胞;不同株新疆出血热病毒和不同方法免疫家兔;不同方法纯化IgG和用不同方法以抗体致敏血球进行反向血凝和血凝抑制试验。结果表明采用本文报道的方法,以戊二醛处理的绵羊红细胞经鞣酸化后优于丙酮醛或戊二醛-甲醛双醛化的血球。用病毒悬液（感染鼠脑悬液）加福氏完全佐剂,经淋巴结注射免疫的方法所获免疫血清的抗体效价最高（补体结合抗体滴度达1∶1024）。用50%饱和硫酸铵沉淀一次和33%沉淀3次后,再经DEAE纤维素提取的IgG效果优于低温酒精法和SephadexG100及SephadexG200分筛提取法。鞣酸化后用这种IgG致敏的血球效果最好,冻干后在4℃下可保持原效价至少一年以上。作者讨论了本试验方法应用中需注意的各种细节问题,并推荐用反向被动血凝试验检测病毒抗原,用反向被动血凝抑制试验检测抗体具有稳定可靠,操作方便和可以直接检测各种动物标本的优点。可广泛用于临床诊断和流行病学调查研究。
冯崇慧,王冬莉,刘宏斌,顾媛,白旭华[8]（2004）在《新疆出血热病毒单克隆抗体的应用研究:反向被动血凝和血凝抑制试验》文中认为使用6株抗新疆出血热病毒单克隆抗体（单抗）致敏醛化绵羊红血球,以反向被动血凝试验（RPHA）检测病毒抗原;以反向血凝抑制试验（RPHI）检测人和各种动物血清抗体。结果6株单抗致敏血球在检测病毒抗原中以IgM型的14B7单抗的灵敏度最高。比其他5个单抗高1632倍,而且与正常对照抗原完全没有非特异性凝集,远超过多克隆抗体致敏的血球。用RPHI检测血清抗体中,以13C6和43E5两个单抗的灵敏度高。测定抗体滴度的终点远高于多克隆抗体致敏的血球。RPHA可用于急性期病人血液中病毒抗原的检测,有很好的早期诊断价值,还可用于新分离病毒的血清学鉴定。RPHI可用于人和动物血清抗体的检测。已制出冻干的制剂,可保存1年以上,对于基层和现场防治调查工作非常方便。
冯崇慧,王冬莉,刘银[9]（2004）在《新疆出血热病毒分类地位的血清学鉴定》文中指出1983年通过病毒形态学的鉴定,证明了新疆出血热病毒是布尼安病毒科（Bunyaviridae）的成员。本次通过血清学方法与布尼安病毒属的西姆波组SMB-48株和内罗病毒属的刚果病毒K2/61株的免疫腹水进行比较。采用补体结合试验、反向被动血凝抑制试验和双抗体夹心抑制ELISA试验进行鉴定的结果,发现新疆出血热病毒与布尼安病毒属的代表毒株SMB-48株没有血清学联系,而与内罗病毒属的刚果病毒有显着的抗原关系。从而证明新疆出血热病毒与布尼安病毒属无关。其抗原性与内罗病毒属克里米亚-刚果出血热病毒一致。
吉杏生,李文惠,刘雄飞,穆金端[10]（2004）在《1979年新疆出血热野生动物宿主调查》文中进行了进一步梳理1979年春、秋两季在巴楚县马扎胡江地区（农三师50团）进行了野生动物宿主调查。共捕获了野生动物7种140只,包括子午沙鼠、短耳沙鼠、长耳跳鼠、三趾跳鼠、大耳猬、白尾地鸦和塔里木兔。其中长耳跳鼠和子午沙鼠为当地优势种。用反向被动血凝抑制试验检测新疆出血热病毒特异性抗体的阳性率为30.8%88.9%,平均46.8%。补体结合抗体阳性率25.0%40.0%,平均22.7%。用反向血凝试验在长耳跳鼠、三趾跳鼠和短耳跳鼠的肝、脾标本中检出病毒抗原,阳性率各为6.3%,5.0%和16.7%。从31只长耳跳鼠的肝、脾标本中分离出1株病毒,经检定为新疆出血热病毒,并编号为M79121株。
二、新疆出血热病毒反向被动血凝和血凝抑制试验的改进研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新疆出血热病毒反向被动血凝和血凝抑制试验的改进研究（论文提纲范文）
（1）出血热相关病毒核酸检测技术研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 登革病毒 |
| 1.2 基孔肯雅病毒 |
| 1.3 寨卡病毒 |
| 1.4 黄热病毒 |
| 1.5 汉坦病毒 |
| 1.6 发热伴血小板减少综合征病毒 |
| 1.7 沙粒病毒 |
| 1.8 克里米亚刚果出血热病毒 |
| 1.9 裂谷热病毒 |
| 1.10 马尔堡病毒 |
| 1.11 埃博拉病毒 |
| 1.12 鄂木斯克出血热病毒和科萨努尔森林病病毒 |
| 1.13 中东呼吸道综合征冠状病毒 |
| 1.14 蜱传脑炎病毒 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 病毒基因 |
| 2.2 主要试剂与耗材 |
| 2.3 主要仪器设备 |
| 2.4 缓冲液配方 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 技术路线 |
| 3.2 引物探针的设计 |
| 3.3 标准品的制备和稀释 |
| 3.4 荧光定量RT-PCR实验及标准曲线的绘制 |
| 3.5 Tem-PCR |
| 3.6 微球与捕获探针的偶联 |
| 3.7 Luminex TM 200仪器的校准 |
| 3.8 Tem-PCR产物的检测 |
| 4. 结果 |
| 4.1 按地区分组实时荧光定量PCR结果 |
| 4.2 按地区分组液相芯片方法检测结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 实时荧光定量PCR |
| 5.2 液相芯片检测技术 |
| 6. 小结 |
| 参考文献 |
| 附录1: DENV-CHIKV病毒样颗粒的制备及免疫原性研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 病毒毒株、细胞株 |
| 2.3. 抗体和抗原 |
| 2.4. 主要试剂及耗材 |
| 2.5. 溶液配方 |
| 2.6 实验仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 3.1 重组杆状病毒适宜扩增条件的选取及扩增 |
| 3.2. 病毒样颗粒的制备 |
| 3.3. 抗原的鉴定 |
| 3.4 动物实验 |
| 3.5 免疫实验及滴度的确定 |
| 4. 结果 |
| 4.1 DENV-CHIK VLPs重组杆状病毒的制备与核酸鉴定 |
| 4.2 DENV-CHIK VLPs重组杆状病毒制备条件与鉴定 |
| 4.3 DENV-CHIK VLPs的制备与鉴定 |
| 4.4 IgG抗体水平 |
| 5. 讨论 |
| 6. 小结 |
| 参考文献 |
| 附录2: 建立检测方法的检测限和特异性汇总 |
| 结论 |
| 致谢 |
（2）人工感染兔出血症病毒兔肝脏的蛋白质组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 病毒历史 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 病毒学分类和结构特性 |
| 1.2.2 理化特性 |
| 1.2.3 基因组结构 |
| 1.3 临床症状和病理变化 |
| 1.3.1 临床症状 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.4 流行病学特点 |
| 1.5 病毒生活周期 |
| 1.6 诊断方法 |
| 1.6.1 电镜法 |
| 1.6.2 血凝和血凝抑制试验 |
| 1.6.3 酶联免疫吸附试验 |
| 1.6.4 核酸诊断技术 |
| 1.7 防控和疫苗 |
| 1.8 蛋白质组学 |
| 1.8.1 蛋白质组学概述 |
| 1.8.2 蛋白质组学研究的主要技术平台 |
| 1.9 蛋白之间相互作用的研究技术 |
| 1.9.1 酵母双杂交系统 |
| 1.9.2 免疫共沉淀技术 |
| 1.9.3 GST-pulldown 技术 |
| 1.10 α_1抗胰蛋白酶的研究进展 |
| 1.11 本研究的目的及意义 |
| 第二章 人工感染兔出血症病毒兔肝脏的蛋白质组学分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病毒和实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.1.5 动物实验 |
| 2.1.6 双向凝胶电泳分离 |
| 2.1.7 质谱分析 |
| 2.1.8 荧光定量 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 动物实验结果 |
| 2.2.2 肝脏脏组织双向凝胶电泳结果 |
| 2.2.3 差异表达蛋白的质谱鉴定结果 |
| 2.2.4 部分差异表达蛋白筛选结果 |
| 2.2.5 部分差异表达蛋白转录水平分析结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 VP60 与α1抗胰蛋白酶相互作用的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 主要试剂和材料 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 A1AT部分片段基因的克隆与表达 |
| 3.1.4 A1AT和RHDV相互作用的的血凝抑制试验 |
| 3.1.5 A1AT与RHDV相互作用的免疫共沉淀验证 |
| 3.1.6 VP60与A1AT相互作用的GST-polldown验证 |
| 3.1.7 VP60与A1AT相互作用的细胞内共定位验证 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 A1AT部分片段基因的克隆 |
| 3.2.2 A1AT蛋白的表达纯化 |
| 3.2.3 血凝抑制试验验证结果 |
| 3.2.4 免疫共沉淀的验证结果 |
| 3.2.5 GST-polldown试验的验证的结果 |
| 3.2.6 VP60与A1AT的细胞内共定位结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 A1AT部分片段基因的克隆与表达 |
| 3.3.2 VP60和A1AT的相互作用的验证 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）新疆出血热的研究进展（论文提纲范文）
| 1 生物学性状 |
| 1.1 病毒形态和结构 |
| 1.2 抵抗力 |
| 1.3 基因组成和抗原组成 |
| 2 临床特征 |
| 3 流行病学 |
| 4 实验室检测技术 |
| 4.1 病毒的分离与鉴定 |
| 4.2 血清学检查 |
| 4.3 分子生物学检测 |
| 5 诊断标准 |
| 6 治疗 |
| 7 预防 |
| 8 生物安全要求 |
（4）五种虫媒病毒悬浮芯片检测方法的建立（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 五种虫媒病毒悬浮芯片检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株及细胞株 |
| 1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 1.2.1 病毒的增殖培养所需试剂和仪器设备 |
| 1.2.2 特异RT-PCR所需试剂和仪器设备 |
| 1.2.3 芯片检测所需试剂和仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 通用引物的设计 |
| 2.2 种特异检测探针的设计 |
| 2.3 探针与色标微球的共价交联 |
| 2.4 病毒的增殖培养 |
| 2.5 病毒培养上清中RNA的提取 |
| 2.6 病毒的通用RT-PCR扩增 |
| 2.6.1 逆转录合成cDNA |
| 2.6.2 PCR合成靶核酸，并引入生物素标记 |
| 2.7 悬浮芯片杂交条件的摸索与优化 |
| 2.7.1 杂交温度的优化 |
| 2.7.2 杂交时间的优化 |
| 2.8 悬浮芯片的杂交 |
| 2.8.1 直接核酸杂交 |
| 2.8.2 洗涤及显色 |
| 2.8.3 结果判定 |
| 2.9 悬浮芯片检测结果的特异PCR验证 |
| 2.9.1 五种病毒特异PCR检测引物的设计 |
| 2.9.2 特异RT-PCR检测 |
| 2.10 悬浮芯片检测方法的评价 |
| 2.10.1 检测方法的重复性验证 |
| 2.10.2 检测方法的特异性验证 |
| 2.10.3 检测方法的灵敏度确定 |
| 2.11 检测方法的初步应用 |
| 2.11.1 模拟混合标本的检测 |
| 2.11.2 初步应用于多种标本的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 引物和探针的设计 |
| 3.2 病毒的增殖培养 |
| 3.3 病毒的通用RT-PCR扩增结果 |
| 3.4 悬浮芯片杂交条件的优化结果 |
| 3.4.1 杂交温度的优化 |
| 3.4.2 杂交时间的优化 |
| 3.5 悬浮芯片的初步检测结果 |
| 3.5.1 色标微球上交联探针的确证 |
| 3.5.2 病毒RT-PCR产物的检测结果 |
| 3.5.3 检测结果的特异PCR验证 |
| 3.6 悬浮芯片检测方法的评价 |
| 3.6.1 检测方法的重复性验证 |
| 3.6.2 检测方法的特异性验证 |
| 3.6.3 检测方法的灵敏度确定 |
| 3.7 悬浮芯片检测方法的初步应用 |
| 3.7.1 模拟混合病毒样本的检测 |
| 3.7.2 应用于临床标本的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 引物和探针的设计是基因芯片的关键 |
| 4.1.1 探针长度的选择 |
| 4.1.2 引物和探针的设计 |
| 4.1.3 引物和探针的生物信息学验证 |
| 4.1.4 靶核酸的扩增 |
| 4.2 探针和微球的有效交联是核酸杂交的前提 |
| 4.3 芯片制备的质量控制是悬浮芯片技术的主要保证 |
| 4.4 芯片杂交条件的摸索与优化 |
| 4.5 芯片检测结果的判定 |
| 4.6 悬浮芯片技术的重复性、特异性和灵敏度 |
| 4.7 悬浮芯片检测技术的前景展望 |
| 5 总结 |
| 5.1 成功设计了针对五种虫媒病毒的通用引物和特异性检测探针 |
| 5.2 确立了悬浮芯片检测方法的最佳条件 |
| 5.3 成功建立了能对五种虫媒病毒进行检测和分型的悬浮芯片方法 |
| 5.4 成功应用本方法对模拟标本和临床标本进行检测 |
| 6 参考文献 |
| 文献综述 |
| 硕士期间发表的学术论文 |
| 悬浮芯片在核酸和蛋白质检测中的应用 |
| 五种虫媒病毒悬浮芯片检测方法的建立 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）新疆出血热病毒感染乳鼠的实验病理学研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附图 |
（6）新疆出血热病毒的实验室诊断方法（论文提纲范文）
| 1 病毒的分离和初步鉴定 |
| 1.1 标本的采集: |
| 1.1.1 血液: |
| 1.1.2 尸检的脏器: |
| 1.1.3 节肢动物: |
| 1.2 标本的保存和运送: |
| 1.2.1 标本的保存: |
| 1.2.2 标本的包装和运送: |
| 1.3 标本的处理: |
| 1.3.1 稀释液: |
| 1.3.2 血液标本: |
| 1.3.3 脏器: |
| 1.3.4 节肢动物: |
| 1.4 动物和细胞的接种和观察: |
| 1.4.1 接种方法: |
| 1.4.2 发病动物的观察: |
| 1.4.3 细胞: |
| 1.5 病毒的传代与保存: |
| 1.5.1 传代: |
| 1.5.2 保存: |
| 1.5.3 真空干燥保存法: |
| 1.6 病毒的初步鉴定: |
| 2 血清学检查 |
| 2.1 血清学检查使用范围: |
| 2.1.1 临床方面: |
| 2.1.2 流行病学调查: |
| 2.1.3 免疫学方面: |
| 2.2 血清标本的采集、运送和保存: |
| 2.2.1 采血: |
| 2.2.2 运送: |
| 2.2.3 血清的分离: |
| 2.2.4 保存: |
| 2.3 血清采集的次数: |
| 2.4 中和试验(Neutralization test, NT): |
| 2.4.1 基本原理: |
| 2.4.2 影响反应的各种因素: |
| (1)血清: |
| (2)动物及接种途径: |
| 2.4.3 正式中和试验: |
| (1) 病毒滴度的测定: |
| (2)正式中和试验 : |
| 2.5 补体结合试验(Complement fixation test ,CFT): |
| 2.5.1 基本原理: |
| 2.5.2 参加反应的各个成分: |
| (1)抗原: |
| (2)血清: |
| (3)补体: |
| (4)绵羊红血球: |
| (5)溶血素: |
| (6)稀释液: |
| 2.5.3 正式试验方法: |
| 2.6 反向被动血凝(RPHA)和反向被动血凝抑制试验(RPHI): |
| 2.6.1 原理: |
| 2.6.2 材料: |
| 2.6.3 致敏血球的制备: |
| (1)绵羊血球的制备: |
| (2)绵羊红血球的醛化: |
| (3)醛化血球的鞣酸化处理: |
| (4) 鞣酸化血球的致敏: |
| (5)致敏血球的保存: |
| (6)注意事项: |
| 2.6.4 反向被动血凝试验(RPHA): |
| 2.6.5 反向被动血凝抑制试验RPHI: |
| 2.7 酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA): |
| 2.7.1 包被用的抗体: |
| 2.7.2 酶结合物的标记: |
| 2.7.3 酶结合物工作浓度的测定: |
| 2.7.4 试验用的稀释液: |
| 2.7.5 几种常用的酶联免疫吸附试验: |
| (1)抗体捕获ELISA法检测急性期病人特异性IgM抗体: |
| (2)双抗体夹心间接ELISA法检测人血清中IgG抗体: |
| (3)双抗体夹心抑制法: |
| (4)ELISA试验中必须注意的事项: |
| 2.8 免疫荧光试验( Immuno fluorescence assay,IFA): |
| 2.8.1 直接法: |
| 2.8.2 间接法: |
| 2.9 免疫扩散试验( immunodiffusion test): |
| 2.10 免疫印迹试验(Western blot) |
| 2.11 分泌抗新疆出血热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立: |
| 2.11.1 基本原理: |
| 2.11.2 毒株和免疫方案: |
| 2.11.3 融合技术: |
| 2.11.4 特异性单克隆抗体的检测: |
| (1)间接混合夹心ELISA: |
| (2)间接免疫荧光试验(IFA): |
| 2.11.5 McAb免疫球蛋白亚类的检定: |
| 2.11.6 杂交瘤细胞株染色体检查: |
| 2.11.7 杂交瘤细胞的融合和克隆化: |
| 2.11.8 必须注意的几个问题: |
| 2.12 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术(唐青等): |
| 2.12.1 原理: |
| 2.12.2 材料: |
| 2.12.3 试验步骤: |
| 2.12.5 意义: |
| 2.12.5 S基因表达产物-核蛋白的应用: |
| 3 几种血清学方法的应用 |
| 3.1 早期快速检出病毒抗原: |
| 3.2 病毒特异性抗体的检测: |
| 3.3 毒株的鉴定和抗原性的分析: |
| 3.4 分子生物学技术: |
| 4 临床化验检查 |
| 4.1 血、尿、粪常规:主要有以下几项: |
| (1)白血球计数及分类: |
| (2)红血球计数及血红蛋白: |
| (3)血小板计数: |
| (4)出、凝血时间: |
| (5)尿液检查: |
| (6)粪便: |
| 4.2 临床生化检查: |
| 5 附录 |
| 5.1 病毒分离常用液: |
| 5.1.1 1/15M PBS配制: |
| 5.2 补体结合试验用液(巴比妥缓冲液): |
| 5.3 反向血凝试验用液(RPHA和RPHI): |
| 5.3.1 0.15M磷酸缓冲盐水的配制: |
| 5.3.2 0.1%鞣酸水溶液: |
| 5.3.3 1%兔血清盐水: |
| 5.3.4 10%碳酸纳盐水: |
| 5.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)常用液: |
| 5.4.1 包被液: |
| 5.4.2 稀释液: |
| 5.4.3 底物显色溶液: |
| 5.4.4 终止液: |
| 5.5 免疫荧光试验(IFA)用液: |
| 5.5.1 稀释液:0.01mol/L pH7.4 PBS |
| 5.5.2 荧光片封片液: |
| 5.5.3 |
| 5.6 细胞培养常用液: |
| 5.6.1 PBS的配制: |
| 5.6.2 l%胰酶配制: |
| 5.6.3 Versene液: |
| 5.6.4 0.4%酚红液配制: |
| 5.6.5 结晶紫染色液: |
| 5.6.6 Giemsa 染色液: |
| 5.6.7 Hepes 缓冲液 |
| 5.6.8 L-谷氨酰胺 |
| 5.6.9 细胞冻存液: |
| 5.6.10 8.8%NaHCO3: |
| 5.7 福氏佐剂配制: |
| 5.8 其他: |
| 5.8.1 新疆出血热病毒滤过试验: |
| 5.8.2 对脂溶剂的敏感性试验: |
（7）新疆出血热病毒反向被动血凝和血凝抑制试验的改进研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂: |
| 1.1.1 0.15M pH7.2, pH6.4磷酸缓冲盐水 (以下简称PBS) : |
| 1.1.2 1%兔血清生理盐水 (简称1%兔盐水) : |
| 1.1.3 0.1%鞣酸溶液: |
| 1.1.4 福氏完全佐剂: |
| 1.1.5 0.01M pH7.4 PB和0.005M pH8.0PB液: |
| (1) 0.01M pH7.4 PB液: |
| (2) 0.005M pH8.0 PB液: |
| 1.2 免疫血清的制备: |
| 1.2.1 免疫原: |
| 1.2.2 免疫方法: |
| 1.3 免疫球蛋白IgG的提取[2]: |
| 1.4 醛化血球的致敏和冻干: |
| 1.4.1 醛化血球的方法: |
| (1) 戊二醛化血球的方法: |
| (2) 丙酮醛 (上海试剂一厂) 化血球: |
| (3) 戊二醛—甲醛化血球: |
| 1.4.2 醛化血球致敏的方法: |
| (1) 醛化血球直接致敏: |
| (2) 鞣酸化血球的致敏[1]:从略。 |
| 1.4.3 致敏血球的冻干: |
| 2 结果 |
| 2.1 不同方法醛化及致敏的血球灵敏度: |
| 2.2 不同免疫方法的比较: |
| 2.3 免疫球蛋白IgG的不同提取方法的比较: |
| 2.4 冻干血球: |
| 3 讨论 |
（8）新疆出血热病毒单克隆抗体的应用研究:反向被动血凝和血凝抑制试验（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 单克隆抗体免疫腹水: |
| 1.2 致敏血球: |
| 1.3 RPHA和 |
| 2 结果 |
| 2.1 反向被动血凝试验: |
| 2.1.1 各株单克隆抗体致敏效果的比较: |
| 2.1.2 单克隆抗体和多克隆抗体致敏效果的比较: |
| 2.1.3 应用单克隆抗体致敏血球进行早期诊断: |
| 2.2 反向被动血凝抑制试验: |
| 3 讨论 |
（9）新疆出血热病毒分类地位的血清学鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒抗原: |
| 1.2 免疫血清和免疫腹水: |
| 1.3 补体结合试验: |
| 1.4 反向被动血凝抑制试验: |
| 1.5 酶联免疫吸附试验: |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（10）1979年新疆出血热野生动物宿主调查（论文提纲范文）
| 1 调查方法 |
| 1.1 鼠类及刺猬: |
| 1.2 野兔类: |
| 2 结果 |
| 2.1 动物相及数量组成: |
| 2.2 野生动物病毒分离和血清学调查: |
| 2.2.1 材料及方法: |
| (1) 病毒稀释液: |
| (2) 野生动物脏器的病毒分离: |
| (3) 补体结合试验 (CF) : |
| (4) 反向血凝及反向血凝抑制试验: |
| 2.2.2 调查结果: |
| 2.3 M79121株的理化、生物学、血清学鉴定: |
| 2.3.1 材料及方法: |
| 2.3.2 实验结果: |
| 3 讨论 |
四、新疆出血热病毒反向被动血凝和血凝抑制试验的改进研究（论文参考文献）
- [1]出血热相关病毒核酸检测技术研究[D]. 闫芳域. 中国疾病预防控制中心, 2018(05)
- [2]人工感染兔出血症病毒兔肝脏的蛋白质组学分析[D]. 李茂中. 中国农业科学院, 2012(10)
- [3]新疆出血热的研究进展[J]. 相大鹏,师永霞,李小波. 中国医药生物技术, 2009(01)
- [4]五种虫媒病毒悬浮芯片检测方法的建立[D]. 罗渊. 中国人民解放军军事医学科学院, 2008(11)
- [5]新疆出血热病毒感染乳鼠的实验病理学研究[D]. 赵晓冬. 中国人民解放军军事医学科学院, 2005(07)
- [6]新疆出血热病毒的实验室诊断方法[J]. 冯崇慧. 地方病通报, 2004(S1)
- [7]新疆出血热病毒反向被动血凝和血凝抑制试验的改进研究[J]. 冯崇慧,高琦,王冬莉. 地方病通报, 2004(S1)
- [8]新疆出血热病毒单克隆抗体的应用研究:反向被动血凝和血凝抑制试验[J]. 冯崇慧,王冬莉,刘宏斌,顾媛,白旭华. 地方病通报, 2004(S1)
- [9]新疆出血热病毒分类地位的血清学鉴定[J]. 冯崇慧,王冬莉,刘银. 地方病通报, 2004(S1)
- [10]1979年新疆出血热野生动物宿主调查[J]. 吉杏生,李文惠,刘雄飞,穆金端. 地方病通报, 2004(S1)