一、去信号肽的木质素过氧化物酶基因在甲醇毕赤酵母中的表达（论文文献综述）
孙书田[1]（2021）在《条锈菌效应子Pst13662抑制小麦抗条锈病的分子机理初探》文中提出小麦条锈病严重威胁着全球小麦生产。其病原菌条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f.sp.tritici,Pst）依赖其侵染结构“吸器”分泌效应子抑制植物防卫反应并建立寄生关系。因此,鉴定条锈菌致病过程中的关键效应子、探究效应子的功能,对开发持久抗病种质资源有着重要意义。课题组前期鉴定到两个多糖去乙酰化酶基因Pst＿13661和Pst＿13662,二者相似度为80%,发现Pst＿13661通过发挥几丁质去乙酰化酶作用影响病菌致病性,但Pst＿13662不具有酶活性。那么Pst＿13662是否以及如何影响条锈菌的致病性?本论文围绕条锈菌效应子Pst＿13662在条锈菌致病性中的功能及分子作用机制展开研究,主要结果如下:1.Pst＿13662对条锈菌致病性的功能分析Signal P预测Pst＿13662 N端1-24位氨基酸为信号肽,利用酵母分泌系统验证其具有分泌功能,表明Pst＿13662编码分泌蛋白;利用农杆菌侵染本氏烟瞬时表达Pst＿13662能够抑制由促细胞凋亡蛋白Bax（BCL2-associated X）诱导的细胞坏死。在烟草细胞中瞬时表达Pst＿13662:GFP,发现Pst＿13662定位于植物细胞质及线粒体。为进一步解析Pst＿13662在小麦条锈菌致病性中的功能,利用RNAi技术靶向沉默Pst＿13662,创制了稳定的小麦转基因材料。对T2代Pst＿13662-RNAi植株接种条锈菌毒性生理小种CYR32进行抗病性鉴定,发现野生型植株高度感病,而Pst＿13662-RNAi植株抗性增强。组织学观察表明,条锈菌侵染24 hpi和48 hpi,Pst＿13662 RNAi#L6与L7植株中条锈菌菌丝变短,侵染面积减小,且120 hpi条锈菌生物量显着降低,表明沉默Pst＿13662削弱了条锈菌的致病能力,增强了植株对条锈菌的抗性。2.Pst＿13662互作靶标的筛选及验证为解析Pst＿13662促进条锈菌致病性的分子作用机制,利用酵母双杂交（Yeast Two-hybrid,Y2H）技术在小麦与条锈菌亲和互作的c DNA文库中筛选其在植物细胞内的互作靶标,共获得59个候选互作蛋白,Y2H发现小麦苯丙氨酸解氨酶TaPAL能够与Pst＿13662互作。利用农杆菌介导的瞬时表达技术在本氏烟中表达TaPAL:GFP,显示TaPAL定位于植物细胞质及叶绿体,为与Pst＿13662互作提供了空间依据。进一步利用双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation,Bi FC）和免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）技术明确了Pst＿13662与TaPAL相互作用。3.Pst＿13662与TaPAL互作的分子机理初探TaPAL是水杨酸（salicylic acid,SA）合成的关键酶,在小麦抗病反应中发挥重要作用。瞬时过表达TaPAL的烟草叶片中,较对照组叶片SA含量显着增加;共表达Pst＿13662和TaPAL后,SA含量下降,说明Pst＿13662与TaPAL作用能够抑制SA的合成。进一步研究发现,共表达Pst＿13662和TaPAL时,Pst＿13662影响TaPAL蛋白量的积累。加入蛋白酶抑制剂MG132后,减弱了TaPAL蛋白量降低的趋势。综上,26S泛素-蛋白酶体介导TaPAL降解,推测Pst＿13662可能通过与TaPAL互作促进其降解,抑制SA合成,从而参与抑制小麦抗性反应。
张璐[2]（2020）在《玉米大斑病菌LysM效应因子的筛选及分析》文中研究指明玉米大斑病是世界玉米产区主要的真菌性病害之一,严重影响玉米的品质和产量。本研究利用生物信息学方法在全基因组水平上鉴定了玉米大斑病菌LysM家族基因,并进行了序列特征、系统发育分析;基于转录组数据分析了该家族成员在侵染玉米过程中的表达;通过酵母分泌系统以及农杆菌瞬时转化烟草技术筛选验证LysM效应因子,并利用毕赤酵母对筛选得到的效应因子进行了诱导表达,验证了该蛋白与几丁质类似物的结合,通过酵母双杂交技术筛选效应因子在玉米中可能的靶标蛋白质;主要研究结果如下:1.通过生物信息学分析发现,在玉米大斑病菌中共有8个LysM家族基因,除了StLYSM1以外,该家族成员编码蛋白都为弱酸性,且大部分为不稳定蛋白质;基因结构分析显示,除2个基因外其他均为断裂基因。2.通过转录组数据分析发现,StLYSM1基因在侵染初期被高度诱导表达,可能在病菌与寄主互作过程中发挥重要作用。3.通过酵母分泌系统发现,StLysM1蛋白的信号肽具有分泌功能。4.通过农杆菌瞬时转化烟草试验发现,StLysM1不能够诱发植物的PCD反应,但能够有效抑制ETI激发子BAX和PTI激发子INF1引起的植物的PCD反应。5.通过毕赤酵母表达系统表达StLysM1蛋白,该蛋白能够与chitin beads、蟹壳甲壳质、壳聚糖、纤维素结合,且与chitin beads的结合能力最强。6.通过筛选玉米cDNA文库初步获得,4个与StLysM1互作的玉米蛋白。
孙佳楠[3]（2020）在《深绿木霉T23对敌敌畏的降解特性及机制》文中研究指明敌敌畏（2,2-二氯乙烯基二甲基磷酸酯,C4H7Cl2O4P）是一种重要的速效广谱性有机磷杀虫剂,被广泛应用于农作物生产、食品储藏害虫防治及畜禽的寄生虫感染治疗。然而生产或使用过程中的滥用及不当处理,对水体、农田土壤、作物、水产品和畜禽产品等造成污染,严重威胁农产品生产安全和人类健康。真菌可以通过化学修饰或影响化合物的生物利用度来降解环境中的有机污染物,因其菌丝网络的快速形成和对复杂环境中多污染物的同步修复能力而越来越受到关注。木霉菌（Trichoderma）生态适应性强,在自然界不同生态系统均有广泛分布,是典型的多功能微生物,具有降解多种环境污染物的能力。本研究以敌敌畏为降解对象,开展深绿木霉（Trichoderma atroviride）T23菌株对敌敌畏的微生物降解机制研究,明确了深绿木霉T23对敌敌畏的降解特性、鉴定了敌敌畏的降解产物、揭示了敌敌畏降解相关酶和基因,为真菌降解有机磷农药积累了基础理论。具体研究结果如下:（1）深绿木霉T23对敌敌畏的良好耐受性在300μg/mL敌敌畏胁迫下分析其对深绿木霉T23代谢产物的影响。结果表明:差异代谢产物主要富集在与初级代谢相关的氨基酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、三羧酸循环以及与次级代谢相关的核黄素代谢、甲烷代谢、泛酸和Co A的生物合成途径。24 h时与耐受性相关的甜菜碱及其前体吲哚类化合物的相对含量均显着上调,随着敌敌畏含量的降低耐受性相关化合物的相对含量开始下降,证实深绿木霉T23降解敌敌畏的过程可以通过调整耐受性相关代谢途径的化合物含量来适应敌敌畏的胁迫。（2）深绿木霉T23降解敌敌畏的酶促作用通过SEM-EDS的方法检测了深绿木霉T23菌丝对敌敌畏的吸附,未检测到敌敌畏的特征元素Cl;又通过GC-FPD的方法检测了灭活与非灭活菌丝对敌敌畏的降解能力,发现菌丝灭活后对敌敌畏的降解能力与敌敌畏水解的降解能力变化趋势一致,均显着低于非灭活菌丝,说明木霉菌对敌敌畏的吸附微弱。通过胞内、胞外酶活性测定明确了深绿木霉T23降解敌敌畏的酶系属于诱导酶,当敌敌畏的诱导浓度达到500μg/mL时,胞内酶、胞外酶对敌敌畏的降解率分别为54.88%和14.48%,且胞内酶活性始终高于胞外酶活性。经敌敌畏诱导后,深绿木霉T23胞内的内酯酶（lactonase）、芳香酯酶（arylesterase）、过氧化物酶（POD）活性呈现先上升、后下降的变化趋势,对氧磷酶1（paraoxonase 1）的含量也因敌敌畏的诱导而升高。上述蛋白酶活性变化均与敌敌畏降解量呈正相关,为敌敌畏的降解产物的鉴定和敌敌畏降解酶的筛选提供了线索。（3）深绿木霉T23降解敌敌畏的产物与降解途径明确了深绿木霉T23降解敌敌畏的主要代谢产物并推测了深绿木霉T23降解敌敌畏的途径。深绿木霉T23降解敌敌畏产物包括乙醇、乙酸、二氯乙醛、2,2-二氯乙醇、2,2,2-三氯乙醇、二氯乙酸、二氯乙酸乙酯、2,2-二氯乙醇醋酸酯、磷酸二甲酯、磷酸三甲酯、（Z,E）-2-氯乙烯基磷酸二甲酯、PO43-和Cl-。由此推测其降解途径主要有2条:途径I,首先通过P—O键水解使敌敌畏转化为磷酸二甲酯和二氯乙醛,磷酸二甲酯逐步被代谢成PO43-、二氧化碳和水,二氯乙醛被氧化为二氯乙酸或还原为2,2-二氯乙醇。部分2,2-二氯乙醇进一步转化为2,2,2-三氯乙醇,其余的脱氯生成乙醇。途径II,敌敌畏发生脱氯反应后生成（Z）-2-氯乙烯基磷酸二甲酯或（E）-2-氯乙烯基磷酸二甲酯,该中间产物脱2-氯乙醛后生成磷酸三甲酯并逐步转化为PO43-。此外,深绿木霉T23对自然水样中敌敌畏降解的产物与实验室条件下降解产物一致;深绿木霉T23处理后灭菌自然水样中敌敌畏的半衰期为54.6 h,略低于未灭菌自然水样处理组的61.7 h。（4）深绿木霉T23细胞色素P450基因的表达及其对敌敌畏中间产物的转化在深绿木霉T23基因组中克隆到39个具有完整开放阅读框的细胞色素P450基因,这些基因编码的细胞色素P450蛋白分布于21个集团下的29个家族,其中与初级代谢相关的细胞色素P450基因有4个,与次级代谢相关的细胞色素P450基因有14个,与外源性物质代谢相关的P450基因有21个。通过荧光定量PCR的方法分析了与外源性物质代谢相关的P450基因在敌敌畏诱导0 h、2 h、6 h、24 h和48 h后,21个基因的表达变化呈7种表达模式;在100μg/mL、300μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL敌敌畏诱导24 h后,TaCyp548、TaCyp620、TaCyp52、TaCyp528和TaCyp504家族下的8个细胞色素P450基因的相对表达量较对照组至少上调表达1倍以上。同源克隆TaCyp548-2,该基因全长1 911 bp,含有4个长为125、75、61和57 bp的内含子,编码530个氨基酸,属于诱导酶。TaCyp548-2的敲除会显着降低敌敌畏降解中间产物2,2-二氯乙醇进一步转化为终产物2,2-二氯乙醇醋酸酯。以敌敌畏诱导后的深绿木霉T23野生株、ΔTaCyp548-2敲除株和co-TaCyp548-2回补株的微粒体进行脂肪酸氧化体外试验,发现TaCyp548-2属于脂肪酸代谢的ω-羟化酶,正调控乙酸、丙酸、异丁酸和二丁酸等低分子有机酸的形成,证明了这些小分子有机酸可促进敌敌畏降解中间产物2,2-二氯乙醇的进一步转化。（5）有机磷水解酶TaPon1-like的鉴定及功能从深绿木霉T23中克隆获得有机磷水解酶基因TaPon1-like。该基因全长为1384 bp,编码438个氨基酸,具有典型6 Propeller水解酶亚家族的特征序列,受敌敌畏诱导后持续上调表达。通过ATMT的方法构建了TaPon1-like敲除株KO1和回补株CO1。24 h时,经KO1处理的敌敌畏残留量较野生株T23与回补株CO1分别高124.88μg/mL和130.30μg/mL,说明缺失TaPon1-like会削弱深绿木霉降解敌敌畏的能力。将TaPon1-like在E.coli Origami B（DE3）中表达,经GST亲和层析柱纯化后获得重组蛋白酶reTaPon1-like,该酶蛋白可将敌敌畏转化为磷酸二甲酯和二氯乙酸,证明TaPon1-like是编码P—O键水解的相关酶基因。重组酶reTaPon1-like降解敌敌畏的最佳反应温度范围为20～35°C,最适p H 7.5～9.0。Ca2+和Zn2+可分别显着增加酶活性489.7%和134.4%,Mg2+、Na+、Ba2+和Mn2+可增加酶活性19.9%～76.5%,而Cu2+显着抑制酶活性。reTaPon1-like具有广泛的水解底物谱,不仅对对氧磷类化合物（对氧毒死蜱、速灭磷、马拉氧磷和氧化乐果）具有水解活性,还对芳香酯类（乙酸苯酯、对硝基苯基乙酸酯和对硝基苯基丁酸酯）和内酯类化合物3,4-二氢香豆素具有水解活性,对各底物的米氏常数Km范围为0.23～1.58 mmol/L,kcat为6.1～3261.1 s-1。其中该酶蛋白酶对敌敌畏亲和性最佳,米氏常数Km为0.23 mmol/L,kcat为204.3 s-1,kcat/Km s-1为8.88×105 s-1 M-1。本文系统研究了深绿木霉T23降解敌敌畏的主要酶促作用和分子机理。揭示了深绿木霉T23酶促降解敌敌畏的作用特点,推测了敌敌畏降解途径;首次发现深绿木霉T23中存在有机磷水解酶基因TaPon1-like,该基因编码的蛋白酶负责敌敌畏P—O键的水解;分析了敌敌畏胁迫下细胞色素P450多样表达模式,明确细胞色素P450基因TaCyp548-2正调控胞外小分子有机酸的产生,促进对敌敌畏中间产物的转化;综合提出了深绿木霉T23促使敌敌畏P—O键水解到中间产物进一步分解转化的主要酶促降解过程。
黄佩[4]（2020）在《哈茨木霉TH33疏水蛋白的异源表达及诱导烟草防御反应》文中提出疏水蛋白是高等丝状真菌中特有的一类小分子蛋白质,它们能在两相界面自动形成两亲性单层膜,降低表面张力,协助真菌形成气生结构,并利于孢子分化与扩散。近年来的研究发现,疏水蛋白与真菌-病原菌、真菌-植物的互作密切相关,如参与病原真菌的致病性以及有益真菌诱导植物抗病性等多种功能。为进一步开发利用木霉菌的有益基因资源,本文开展了哈茨木霉TH33疏水蛋白的研究,从TH33中克隆获得6个注释为疏水蛋白的基因片段,采用基因敲除、蛋白异源表达、全代谢组测序和转录组测序等技术,初步研究了部分疏水蛋白的功能。结果如下:1、根据哈茨木霉TH33全基因组序列信息,TH33基因组中共含有6个疏水蛋白编码基因,序列编号分别为Tha00773（thhyd1）、Tha02696（thhyd2）、Tha03110（thhyd3）、Tha04012（thhyd4）、Tha04345（thhyd5）、Tha09745（thhyd6）。以TH33基因组cDNA为模板,扩增获得这6个基因的cDNA片段,测序验证序列信息。2、利用同源打靶敲除的方法,获得thhyd4敲除突变株?thhyd4和thhyd6敲除突变株?thhyd6,分析显示,野生菌与敲除突变株?thhyd4、?thhyd6在PDA培养基中的菌落形态、生长速率、产孢量、疏水性以及对病原菌的拮抗性能方面无显着差异。3、利用pET-28a载体,构建thhyd2、thhyd3、thhyd4、thhyd5及thhyd6的原核表达载体,在E.coli BL21（DE3）中诱导表达并纯化,获得重组蛋白THhyd4和THhyd6。优化的诱导表达条件为:IPTG浓度0.5 mM、28℃、200 rpm诱导4 h。利用pPICZαA载体构建thhyd2、thhyd3、thhyd5的真核表达载体,在KM71H毕赤酵母表达系统诱导表达,获得重组蛋白THhyd3。4、用纯化的重组蛋白THhyd3、THhyd4和THhyd6处理烟草叶片,显示THhyd4和THhyd6能够引起烟草叶片发生HR反应,诱导烟草产生活性氧、胼胝质和酚类物质累积等,表明疏水蛋白THhyd4和THhyd6能够引起烟草发生早期防御反应,可能为蛋白类激发子。5、对THhyd6处理后的烟草叶片,进行全代谢组和转录组测序和分析。结果显示,THhyd6诱导烟草α-亚麻酸、亚油酸代谢、谷胱甘肽代谢、氨基酸代谢等途径相关基因差异表达及代谢产物的积累。其中,THhyd6诱导烟草中茉莉酸（JA）途径信号物质积累、JA信号转导途径中关键基因上调表达,以及多种防御相关基因发生差异表达,确定THhyd6具有激发子的功能,推测通过激活JA信号途径诱导烟草的系统抗病性（ISR）。
张甜甜[5]（2018）在《多功能纳米材料用于活性氧及光热肿瘤治疗及人LOX家族蛋白的异源表达》文中提出本论文的研究分两部分。第一部分为多功能纳米材料用于活性氧及光热的肿瘤治疗,第二部分为人LOX家族蛋白的异源表达。本文第一部分主要为多功能纳米材料用于活性氧及光热肿瘤治疗。癌症是影响人类健康的主要疾病之一,近年来,纳米材料和纳米技术应用于肿瘤治疗与诊断成为研究的热点。肿瘤细胞具有一些内在属性,如葡萄糖依赖性、外源性活性氧敏感性及不耐高热。根据肿瘤细胞这些弱点,我们设计了利用葡萄糖氧化酶（GOx）和聚多巴胺（PDA）修饰氧化铁的纳米铁/聚多巴胺/葡萄糖氧化酶纳米材料（Fe3O4@PDA/GOx NPs）。该系统中,多巴胺单体通过自聚形成聚多巴胺,沉积在纳米氧化铁表面,并提供多种活泼基团,作为接枝反应的平台,可共价交联GOx。GOx可以竞争性消耗肿瘤细胞的主要能源物质—葡萄糖,并通过生物化学反应自发地生成活性氧过氧化氢（H2O2）。PDA与纳米氧化铁同为光热转换剂,将近红外光（NIR）的光能转换为热能。此外,该系统利用纳米铁释放的亚铁离子通过芬顿反应（Fenton reaction）催化H2O2转化为毒性更强的羟基自由基（·OH）,产生协同效应治疗肿瘤。我们成功合成了具有近红外吸收和光热转换能力的两种尺寸（200 nm和20 nm）的Fe3O4@PDA/GOx NPs,同时该材料可通过消耗葡萄糖产生H2O2。体外结果表明,两种尺寸的Fe3O4@PDA/GOx NPs都可显着抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231生长,但对正常细胞MCF-10A影响较小。其中,200 nm的Fe3O4@PDA/GOx NPs在不施加或者施加近红外光照条件下,对肿瘤细胞的抑制的 IC50 分别为 25.82±1.17 μg/mL 和 20.98±1.06μg/mL,而 20 nm 的Fe3O4@PDA/GOx NPs 在相应条件下分别为 70.56±1.83 μg/mL 和 64.77±1.40μg/mL,分别是200 nm材料的2.7和3倍。使用铁分析试剂盒和普鲁士蓝染色法对与Fe3O4@PDA/GOx NPs孵育后的肿瘤细胞和正常细胞内铁含量进行检测。正常细胞与Fe3O4@PDA/GOx NPs孵育细胞内铁含量基本不变,相比之下,随着Fe3O4@PDA/GOx NPs（200 nm）浓度的升高,肿瘤细胞内的铁的含量依次增加。类似的,对材料处理后的细胞内活性氧含量的研究中发现:当与Fe3O4@PDA/GOx NPs孵育后,肿瘤细胞细胞内及细胞外的H2O2和·OH含量均高于正常细胞,且200 nm较20 nm直径的材料对细胞内外活性氧含量的诱导能力更高。以上实验结果显示,200 nm的Fe3O4@PDA/GOx NPs较20nm的材料,具有更强的肿瘤细胞杀伤能力,这种杀伤能力可能源于其更高的肿瘤细胞亲和能力和更多的细胞外、胞质内的活性氧诱导能力。采用200 nm的Fe3O4@PDA/GOx NPs的材料处理肿瘤细胞,TUNEL染色显示,该材料能够诱导肿瘤细胞的染色体断裂。AnnexinV-FITC/PI双染结果显示,该材料以剂量依赖型和时间依赖型的模式,诱导细胞凋亡。小鼠体内检测结果进一步证实,200 nm的Fe3O4@PDA/GOx NPs在施加近红外光照的条件下,可显着抑制或完全消融小鼠肿瘤,实验组中8只小鼠有5只肿瘤完全消融。此外,Fe3O4@PDA/GOx NPs生物相容性良好,在尾静脉注射条件下,不会对小鼠的主要器官,包括心脏、肝脏、脾脏、肺及肾脏造成明显的损伤。施加材料组的小鼠与注射等体积PBS的对照组小鼠血常规结果无显着差异,体重也没有明显差异。我们的研究可以为发展肿瘤治疗提供一种新思路和新手段。本文第二部分主要为异源表达人赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase,LOX,EC 1.4.3.13）家族蛋白。LOX是一种分泌型铜依赖性氧化酶,能氧化伯胺生成活性醛基。LOX蛋白的基本生物学功能是在细胞基质中催化胶原蛋白及弹性蛋白的共价交联,对促进细胞外基质的成熟以及维持其稳定起重要作用。人赖氨酰氧化酶（human lysyl oxidase,hLOX）家族蛋白共有五个成员,包括hLOX和hLOXL1-4。hLOX和hLOXL2是赖氨酰氧化酶家族蛋白的两种典型蛋白结构,他们的C端都含有高度保守的催化活性中心,包括铜离子结合位点、LTQ辅因子、细胞因子受体区域。他们之间的主要差异在于hLOXL2蛋白的N端为4个SRCR域,而hLOX蛋白的N端为前导肽。此外这两种蛋白都有三个预测的N糖基化位点。近年来研究证明hLOX和hLOXL2都参与多种肿瘤细胞的增殖、运动、黏附性、恶性转移、侵袭性及血管生成。在LOX家族蛋白的结构-功能研究中,最大障碍是缺少有效的表达和纯化可溶且有活性的重组蛋白的体系。目前尚未有通过原核表达系统获得大量的重组人赖氨酰氧化酶的报道。为了获得大量可溶的有活性的重组人源LOX家族蛋白,本部分主要利用原核和真核系统表达来源于人的赖氨酰氧化酶家族蛋白hLOX和hLOXL2。本论文尝试将来人源赖氨酰氧化酶（LOX）基因hlox、hloxl2基因分别与助溶标签Trx-tag、GST-tag和亲和标签His-tag、Strep-tag融合表达,并借助DnaK、DnaJ和GrpE、GroEL、GroES两套分子伴侣系统,最终使用融合标签GST-tag在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达并纯化得到可溶的截去信号肽及两个SRCR结构域的hLOXL2的重组蛋白GST-D1-2hLOXL2,并检测到重组蛋白具有LOX活性。此外,本论文也尝试将hlox、hloxl2基因分别在三种毕赤酵母宿主细胞GS115、SMD1168、KM71和两种分泌型表达载体pPIC9K和pPICZαA的组合下分泌表达重组蛋白。其中选用KM71宿主与pPIC9K和pPICZαA载体组合检测到胞内可溶重组蛋白,但表达量较低,无法大量获得。通过原核表达系统表达可溶且有活性的重组人赖氨酰氧化酶,这将对未来进一步研究该家族蛋白的生化性质,以及其在癌症增殖与转移中的作用奠定基础,也可以用于解析其结构,用于开发相关治疗方法和药物。
朱艳芬[6]（2017）在《籼粳稻杂种不育系统S5的蛋白互作及转录组研究》文中研究表明水稻既是重要的粮食作物,也是单子叶植物基因组研究的模式植物,是生殖隔离研究的模式系统。亚洲栽培稻包括籼稻和粳稻两个亚种,其杂种通常高度不育,阻碍了对亚种间杂种强大杂种优势的利用。S5是控制籼粳杂种胚囊育性的主要位点,包括ORF3,ORF4和ORF5三个连锁基因。典型籼稻的基因型为ORF3+/ORF4-/ORF5+,典型粳稻的基因型为ORF3-/ORF4+/ORF5-。细胞壁蛋白ORF5+与跨膜蛋白ORF4+共同诱导内质网胁迫进而引起细胞程序性死亡从而导致雌配子败育,内质网蛋白ORF3+则能够阻止或者缓解内质网胁迫阻止雌配子被杀死从而恢复正常育性。本研究从分子细胞学和转录组角度对S5作用机理进行了研究。我们构建了粳稻Balilla穗组织的酵母双杂交文库。利用ORF3,ORF4和ORF5的各种全长以及截短的蛋白作为诱饵筛选文库,并利用ORF5-得到了两个候选基因,但是经过进一步验证之后发现是假阳性。根据对S5作用模式的设想,我们研究ORF4+与膜受体蛋白如S1L4、LYP4和LYP6的互作关系,但是发现也不互作。我们构建了ORF5+-GFP与ORF4+-GFP转烟草BY-2悬浮细胞的稳定细胞系,对ORF5+和ORF4+的蛋白性质进行了初步研究。为了研究位于细胞壁的ORF5+是否通过破坏细胞壁释放寡糖信号分子,我们用三种寡糖对ORF4+-GFP的细胞系进行处理,发现这些寡糖不能诱导细胞的死亡。另外我们也对ORF4+是否为ORF5+的底物进行了初步探究,将ORF5+与N端或者C端带荧光蛋白的ORF4+共同转入烟草叶片,观察ORF4+的定位变化,但是并未观测到有改变。在BY-2细胞系和烟草瞬时转化过程中,我们发现融合了荧光蛋白的ORF5+并不定位在细胞壁上,推测融合的标签可能会影响ORF5+的功能。但是,我们发现ORF5+或者ORF5-融合GFP标签的拟南芥稳定转化植株能够降低叶片中PR基因表达量。ORF5+编码天冬氨酸蛋白酶,转基因植株BalillaORF5+不育。为了探究ORF5+酶活功能是否为必需,我们将其两个酶活位点的天冬氨酸D132和D337分别和同时诱变为天冬氨酰并转入Balilla,发现不管是分别诱变还是同时诱变类型都正常可育。因此,我们认为ORF5+的酶活是其发挥功能所必需的。ORF4+编码一个N端在细胞外,C端在细胞内的单次跨膜蛋白。ORF4+-GFP与内吞marker部分重合,暗示其可能参与内吞。我们对ORF4+预测的内吞位点进行诱变,发现这些位点与ORF4+的内吞现象无关。ORF4+超表达植株BalillaORF4+OX株高变矮,分蘖数减少,其叶片会产生假病斑并积累胼胝质,植株对白叶枯病菌PXO341的抗性增强,Balilla ORF4-OX则不会出现这些表型,这说明ORF4+和ORF4-的功能差异很大。另外,我们利用基因敲除技术CRISPR在Balilla中成功敲除了ORF4+,获得了一个S5位点为ORF3-/ORF4-/ORF5-的植株。通过比较Balilla,败育的BalillaORF5+和育性恢复的BalillaORF3+ORF5+胚囊发育过程,我们将胚囊败育过程划分为三个时期（MMC,MEI和AME）并研究了这些时期的转录组数据。通过比较BalillaORF5+和Balilla,发现ORF5+在MMC时期引起大量细胞壁重构基因如EXP,XTH,GH9,PAE,PME,PGase和AGP的上调表达,这些基因可能导致细胞壁完整性的破坏,并诱导了下游的生物和非生物胁迫反应以及内质网胁迫。MEI时期,持续的胁迫反应激活了由TIP2,TDR,OsAP25和OsAP37介导PCD过程。此外胚囊细胞通过上调表达OsSWN1,OsMYB46,OsCesA4,OsCesA7和OsCesA9等控制次生细胞壁合成的基因大量合成纤维素并通过调控胼胝质代谢大量积累胼胝质以稳固细胞壁。AME时期,败育的胚囊中积累了大量的纤维素和胼胝质。通过比较BalillaORF3+ORF5+和Balilla,我们发现MMC时期ORF5+在BalillaORF3+ORF5+依然能够引起部分细胞壁重构基因的上调表达进而引起胁迫反应。由于ORF3+的存在,这些反应没有BalillaORF5+强烈,并且在MEI时期被抑制,胚囊正常发育。ORF3+是一个分子伴侣蛋白,我们推测ORF3+可能通过修饰ORF4+的互作蛋白或者下游的信号分子抑制胁迫信号。通过BalillaORF3+ORF5+与BalillaORF5+的对比发现ORF3+使BalillaORF3+ORF5+中与抗病抗逆相关的基因,如OsMTs,OsLEAs和OsPR10a等的表达量都大幅度上调。本研究对S5位点的三个基因功能做了进一步的研究,揭示了ORF5+的酶活对其功能的重要性,ORF4+与抗病的相关性。结合Balilla,BalillaORF5+和BalillaORF3+ORF5+的转录组分析结果,认为ORF5+可能破坏细胞壁的完整性,被细胞膜上的ORF4+感知,向细胞内传递信号引起生物和非生物胁迫以及内质网胁迫和PCD。ORF3+存在时,内质网胁迫被抑制且抗逆能力增强从而抑制了ORF5+引起的胁迫反应,故胚囊正常发育。本研究有助于我们进一步理解S5的作用机理,为更好在生产上利用S5提供理论依据。
韦琴,吴士筠,梅辉,叶斌[7]（2014）在《鸡α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒功能初探》文中认为为了研究鸡α干扰素（ChIFNα）基因的特性和功能,将鸡α干扰素的DNA序列克隆到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）分泌表达载体pPIC9K中,并转化入巴斯德毕赤酵母GS115菌株,用PCR技术鉴定阳性转化子。重组菌株GS115/pPIC9K-IFNα用1%甲醇诱导后,分泌表达重组蛋白,斑点杂交（dot-blot）检测IFNα具有免疫原性。细胞病变抑制法表明,表达产物有明显的抗鸡H9N2亚型禽流感病毒活性。
陈亮[8]（2012）在《新孢子虫tNcSRS2基因在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达及其应用研究》文中研究说明新孢子虫病（Neosporosis）是由犬新孢子虫（Neospora caninum）引起的一种全球性的原虫病,该病对牛的危害最为严重,是世界范围内造成奶牛流产、产弱胎、死胎、木乃伊胎的主要原因之一。该病的危害程度存在着明显的地区差异,目前仍没防治新孢子虫病的有效药物和疫苗,“淘汰患畜”成为控制该病的唯一途径,因此,研发新型检测试剂盒及亚单位疫苗就显得尤为重要。（1）含有原核重组表达质粒pGEX-4T-tNcSRS2的宿主菌BL21在IPTG诱导下,以包涵体的形式表达重组蛋白GST-tNcSRS2,该蛋白经过包涵体洗涤液洗涤、透析后,采用GST亲和层析法过柱纯化,用改良型BCA蛋白质定量检测试剂盒测得纯化后的蛋白浓度为232.9μg/mL,以此重组蛋白作为包被抗原,组装了新孢子虫rELISA抗体检测试剂盒,对组装的试剂盒进行了特异性检测试验、敏感性试验和重复性试验,发现与弓形虫、布氏杆菌不发生任何交叉反应,其阳性血清稀释至1:1600时,仍可检测为新孢子虫阳性,批内和批间重复性试验的变异系数均在10%以下。该试剂盒在-20℃至少可以保存6个月以上,与美国IDEXX商品试剂盒和比利时Bio-X商品试剂盒的符合率分别为90.45%和93.46%。应用该试剂盒检测了疑似区被检样品（n=1329）,查出了新疆境内新孢子虫病感染情况,平均感染率为11.8%,检测结果均用商品化检测试剂盒验证。（Ⅱ）根据已发表的新孢子虫NcSRS2基因序列设计引物,通过PCR方法从牛新孢子虫地方阳性全血DNA中扩增得到目的基因,将其克隆至真核表达载体PPIC9K构建重组质粒pPIC9K-tNcSRS2,PCR和双酶切鉴定后测序,结果与GenBank中已发表的犬新孢子虫Nc-1株的核苷酸序列同源性为99.90%。重组质粒pPIC9K-tNcSRS2经Sal I线性化后,电转化整合到毕赤酵母GS115上,设置G418浓度梯度进行筛选,对筛选的高抗性阳性转化子进行PCR鉴定,得到重组酵母菌株。在甲醇的诱导条件下,表达大小约37kDa的重组蛋白。对得到的重组酵母转化子表达条件的优化结果为：诱导温度为29℃,磷酸钾缓冲液的pH值为7.0,甲醇终浓度为0.25%,诱导时间为72h。Western blot结果表明,利用毕赤酵母表达的新孢子虫NcSRS2蛋白能与新孢子虫阳性血清发生反应,产生特异性条带,得到的目的蛋白具有反应原性,为新孢子虫病亚单位疫苗的研制奠定了基础。
王俐琼[9]（2011）在《透明颤菌血红蛋白基因在β-甘露聚糖酶工程菌中的表达》文中研究指明β-甘露聚糖酶（β-mannanase）是一类重要的半纤维素酶类,在食品加工、动物饲料、环境改造、传统的纺织业以及石油开发生产和生物技术等众多科研和工农业领域上得到多方面广泛的应用。本实验室郑甲等已设计构建了一株毕赤酵母β-甘露聚糖酶工程菌,但其在高密度发酵中对氧的需求成为其工业化应用的瓶颈。而有研究表明,细菌属的透明颤菌在缺氧的条件下能大量的合成血红蛋白以供自己生长所需。在应用于重组蛋白和抗生素工业化生产的工程菌中,转入的透明颤菌血红蛋白（Vitreoscilla hemoglobin, VHb）能起到促进细胞增长和提高产量的目的,特别是在供氧不足的条件下。因此,本文将优化的透明颤菌血红蛋白基因分别转入野生型毕赤酵母和产β-甘露聚糖酶的工程菌中进行表达,并研究外源血红蛋白的表达对菌体发酵产p-甘露聚糖酶的影响。主要实验流程、结果及结论简介如下：首先,对透明颤菌血红蛋白基因序列进行优化分析,分割成合适的引物序列后,探索基因拼接的最适浓度与最佳PCR程序,最终扩增得到所需的VHb基因序列。设计引物Y0和X10,其中Y0用于去除质粒pPICZa B的信号肽,X10用于在目的基因末端添加组氨酸标签。其次,将正确合成的透明颤菌血红蛋白基因优化序列电导入野生毕赤酵母中进行表达,发现在供氧不足的情况下,原始野生菌菌浓只能达到5.6×108/mL,而表达透明颤菌血红蛋白的毕赤酵母工程菌菌浓达到6.0×108/mL,证明透明颤菌血红蛋白在限氧条件下对毕赤酵母生长有延长其稳定期的作用。在氧充足的情况下,对菌株的生长基本没有影响。将透明颤菌血红蛋白大量表达后对其进行SDS-PAGE验证与镍离子亲和纯化。最后,将已合成的优化后透明颤菌血红蛋白基因导入毕赤酵母β-甘露聚糖酶工程菌。分别用PCR、SDS-PAGE以及Western Blot对透明颤菌血红蛋白的表达进行验证。筛选出七株表达透明颤菌血红蛋白的β-甘露聚糖酶工程菌。与原始β-甘露聚糖酶工程菌进行比较,发现在供氧不足的条件下,前者菌浓能达到5.2×108/mL,而后者最高菌浓只有2.7×108/mL,表明透明颤菌血红蛋白的导入提高了菌体生长率,然而对其酶活影响不大。
龚婷[10]（2008）在《鸡IL-2cDNA及其去信号肽cDNA的原核和酵母表达研究》文中研究表明白细胞介素2（Interleukin-2,IL-2）主要是由T细胞和NK细胞等产生一种的糖蛋白,在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥着重要的作用。鸡IL-2（ChIL-2） mRNA全长747bp,阅读框cDNA 429bp,编码142个氨基酸残基,N端含有22个氨基酸残基的信号肽序列。本文为探讨ChIL-2全基因和去除信号肽的基因序列在原核和真核表达系统中的表达行为,分别构建含有信号肽序列和不含信号肽序列的原核和酵母表达载体,并在大肠杆菌和酵母中进行表达,以期为IL-2基因在不同表达系统中的高效表达和表达调控的研究奠定基础。根据GenBank中发表的ChIL-2基因cDNA序列设计三条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429bp的ChIL-2基因全长编码区cDNA和363bp的成熟的ChIL-2的cDNA,分别将两段cDNA克隆到原核表达载体pET28a（+）和酵母表达载体pPICZαA中,获得原核重组质粒pET28a-IL-2、pET28a-△SIL-2和酵母重组质粒pPICZαA-IL-2、pPICZαA-△SIL-2。SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物,RNA Structure软件分析mRNA5′端的二级结构。pET28a-IL-2、pET28a-△SIL-2转化的BL21（DE3）菌在IPTG浓度为1.0mmoL/L、诱导4h表达水平最高,表达出的22kD和18kD蛋白经Western blotting鉴定为鸡IL-2和△SIL-2。在相同条件下,IL-2的表达水平明显低于△SIL-2,经RNA Structure软件分析发现,在IL-2 mRNA的5′端形成了比较复杂的二级结构,“茎环”比为1.034,而△SIL-2 mRNA的5′端的“茎环”比仅为0.571。推测可能是由于IL-2 mRNA5′端复杂的二级结构阻碍了mRNA与核糖体30S亚基的结合,从而影响了翻译的起始效率的缘故。pPICZαA-IL-2和pPICZαA-△SIL-2转化的巴斯德毕赤酵母X-33在30℃、甲醇浓度为1%、诱导72h和96h表达明显,表达出28kD和24kD的融合蛋白经Wester-blotting鉴定为鸡IL-2和△SIL-2。在相同条件下,IL-2的表达水平略低于△SIL-2,经RNA Structure软件分析发现,前者的mRNA也形成了比较复杂的二级结构,“茎环”比为1,而后者的mRNA的“茎环”比为0.4706。推测mRNA复杂的二级结构也可能是影响酵母表达水平的原因之一。
二、去信号肽的木质素过氧化物酶基因在甲醇毕赤酵母中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、去信号肽的木质素过氧化物酶基因在甲醇毕赤酵母中的表达（论文提纲范文）
（1）条锈菌效应子Pst13662抑制小麦抗条锈病的分子机理初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 小麦条锈病与小麦条锈菌 |
| 1.1.1 小麦条锈病具有严重危害 |
| 1.1.2 小麦条锈菌的侵染过程 |
| 1.1.3 小麦条锈菌致病性频繁变异 |
| 1.2 持久抗病性研究进展 |
| 1.3 植物病原互作研究进展 |
| 1.4 病原体效应子研究进展 |
| 1.4.1 细菌效应子研究进展 |
| 1.4.2 卵菌效应子研究进展 |
| 1.4.3 真菌效应子研究进展 |
| 1.5 SA研究进展和PAL的重要作用 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 效应子Pst_13662 对条锈菌致病性的功能分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料、试剂、仪器 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 仪器 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 重组载体的构建 |
| 2.3.2 Pst_13662 的信号肽分泌功能验证 |
| 2.3.3 Pst_13662 在本氏烟中抑制BAX诱导的PCD |
| 2.3.4 Pst_13662 在本氏烟中的亚细胞定位 |
| 2.3.5 转基因材料的创制 |
| 2.3.6 组织细胞学观察与统计 |
| 2.3.7 表型观察与鉴定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 Pst_13662 的信号肽具有分泌功能 |
| 2.4.2 Pst_13662 抑制Bax诱导的细胞坏死 |
| 2.4.3 Pst_13662 定位植物细胞质及线粒体 |
| 2.4.4 Pst_13662 在条锈菌致病过程中发挥作用 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 效应子Pst_13662 靶向TaPAL抑制植物免疫 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料、试剂 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 Pst_13662 互作靶标的筛选 |
| 3.3.2 Pst_13662与TaPAL互作验证 |
| 3.3.3 TaPAL在小麦与条锈菌互作中的表达分析 |
| 3.3.4 Pst_13662与TaPAL在本氏烟中共定位 |
| 3.3.5 Pst_13662 抑制PAL通路SA的产生 |
| 3.3.6 Pst_13662 影响TaPAL的分子机理探究 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 Pst_13662 候选靶标筛选 |
| 3.4.2 BIFC验证Pst_13662与TaPAL互作 |
| 3.4.3 TaPAL定位在植物细胞质及叶绿体 |
| 3.4.4 Co-IP验证Pst_13662与TaPAL互作 |
| 3.4.5 TaPAL在小麦与条锈菌互作中的表达分析 |
| 3.4.6 Pst_13662 不会改变TaPAL的空间定位 |
| 3.4.7 Pst_13662 影响PAL通路SA的产生 |
| 3.4.8 Pst_13662 可能促进TaPAL的降解 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）玉米大斑病菌LysM效应因子的筛选及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 玉米大斑病菌及其危害 |
| 1.2 植物与病原真菌互作机制 |
| 1.3 效应因子 |
| 1.4 LysM结构域 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 质粒载体 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.1.5 试验所用引物 |
| 2.2 试剂的配制 |
| 2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 农杆菌转染烟草 |
| 2.2.3 SDS-PAGE |
| 2.2.4 酵母感受态的制备及转化 |
| 2.2.5 TTC显色鉴定 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 玉米大斑病菌LysM家族基因的全基因组鉴定 |
| 2.3.2 LysM家族基因的系统发育分析 |
| 2.3.3 LysM结构域的多序列比对及保守基序分析 |
| 2.3.4 LysM家族基因结构的分析 |
| 2.3.5 玉米大斑病菌总RNA的提取及cDNA的合成 |
| 2.3.6 玉米大斑病菌StLYSM1基因的克隆 |
| 2.3.7 效应蛋白信号肽分泌功能的验证 |
| 2.3.8 玉米大斑病菌pgR107-LysMl载体的构建 |
| 2.3.9 农杆菌GV3101感受态的制备 |
| 2.3.10 农杆菌转化 |
| 2.3.11 农杆菌接种烟草 |
| 2.3.12 效应蛋白靶标的筛选 |
| 2.3.13 StLysM1在真核体系中的表达与检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 玉米大斑病菌LysM家族基因的全基因组鉴定及理化性质分析 |
| 3.2 玉米大斑病菌LysM家族基因的系统发育分析 |
| 3.3 玉米大斑病菌LysM结构域的多序列比对及保守基序分析 |
| 3.4 玉米大斑病菌LysM家族基因结构分析 |
| 3.5 玉米大斑病菌LysM家族成员在侵染过程中的表达模式分析 |
| 3.6 玉米大斑病菌StLYSM1基因的克隆 |
| 3.7 玉米大斑病菌StLysM1信号肽分泌功能验证 |
| 3.8 玉米大斑病菌效应因子StLysM1抑制植物免疫反应验证 |
| 3.9 玉米大斑病菌StLysM1蛋白的真核诱导表达与几丁质结合活性鉴定 |
| 3.10 玉米大斑病菌效应因子StLysM1互作靶标筛选 |
| 4 讨论 |
| 4.1 病原真菌中LysM蛋白的多样性 |
| 4.2 病原真菌中LysM效应因子的作用机制 |
| 4.3 StLysM1效应因子的其他功能 |
| 4.4 展望 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）深绿木霉T23对敌敌畏的降解特性及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 List of abbreviations |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 有机磷农药污染与生物降解 |
| 1.1.1 有机磷农药污染现状及危害 |
| 1.1.2 有机磷农药的生物降解 |
| 1.2 木霉菌对环境污染物的生物修复 |
| 1.2.1 木霉菌资源与功能 |
| 1.2.2 木霉菌对环境污染物的生物修复作用 |
| 1.2.3 木霉菌对有机磷农药的耐受性 |
| 1.3 真菌细胞色素P450 对环境污染物的降解 |
| 1.4 对氧磷酶对有机磷农药的降解作用 |
| 1.5 研究的意义、内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 技术路线 |
| 第二章 深绿木霉T23 对敌敌畏的吸附与降解 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 试剂、培养基及仪器 |
| 2.1.3 深绿木霉T23 的活化与菌丝培养物制备 |
| 2.1.4 深绿木霉T23 对有机磷农药敌敌畏的吸附试验 |
| 2.1.5 胞外和胞内酶的提取 |
| 2.1.6 菌丝体形态观察和表面元素定性分析 |
| 2.1.7 灭活与非灭活菌丝体对敌敌畏的降解 |
| 2.1.8 胞内酶活性和过氧化氢含量的测定 |
| 2.1.9 胞内代谢产物的鉴定和分析 |
| 2.1.10 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 深绿木霉T23 对敌敌畏胁迫的耐受性分析 |
| 2.2.2 深绿木霉T23 对敌敌畏的吸附 |
| 2.2.3 深绿木霉T23 对敌敌畏的降解 |
| 2.2.4 深绿木霉T23 胞内酶活性与降解效应相关性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 深绿木霉T23 对敌敌畏的降解途径 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 试剂、培养基及仪器 |
| 3.1.3 菌株的培养 |
| 3.1.4 深绿木霉T23 降解敌敌畏的产物鉴定 |
| 3.1.5 水样的采集与处理 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 敌敌畏浓度变化对深绿木霉T23 生长的影响 |
| 3.2.2 敌敌畏浓度变化对深绿木霉T23 产无机盐离子的影响 |
| 3.2.3 深绿木霉T23 降解敌敌畏中间产物的鉴定和分析 |
| 3.2.4 自然环境中深绿木霉T23 降解敌敌畏产物与代谢途径预测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 深绿木霉T23 细胞色素P450 基因的克隆及其在降解敌敌畏中的作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试菌株 |
| 4.1.2 主要试剂、培养基与仪器 |
| 4.1.3 总RNA提取和反转录反应 |
| 4.1.4 细胞色素P450 相关基因的注释 |
| 4.1.5 细胞色素P450 基因片段的扩增 |
| 4.1.6 细胞色素P450 基因编码蛋白的生物信息学分析 |
| 4.1.7 敌敌畏胁迫下细胞色素P450s相关基因荧光定量PCR |
| 4.1.8 细胞色素P450 微粒体的诱导及分离 |
| 4.1.9 脂肪酸及其代谢产物的测定 |
| 4.1.10 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 细胞色素P450 基因cDNA的克隆 |
| 4.2.2 细胞色素P450 基因编码蛋白的生物信息学分析 |
| 4.2.3 敌敌畏胁迫下细胞色素P450 基因表达差异 |
| 4.2.4 TaCyp548-2 突变株的筛选和验证 |
| 4.2.5 TaCyp548-2 的功能分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 敌敌畏水解酶基因TaPon1-like的克隆与功能 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试菌株和质粒 |
| 5.1.2 主要试剂、培养基与仪器 |
| 5.1.3 基因组DNA提取 |
| 5.1.4 总RNA提取和反转录反应 |
| 5.1.5 半定量 PCR和荧光定量 PCR |
| 5.1.6 同源克隆 |
| 5.1.7 序列分析与预测 |
| 5.1.8 构建TaPon1-like敲除和互补突变体 |
| 5.1.9 原核表达及纯化 |
| 5.1.10 纯化的reTaPon1-like酶对敌敌畏的降解 |
| 5.1.11 reTaPon1-like的酶特性分析 |
| 5.1.12 本章研究中使用的引物 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 TaPon1-like的克隆与序列分析 |
| 5.2.2 TaPon1-like基因表达水平的分析 |
| 5.2.3 TaPon1-like敲除子的筛选和验证 |
| 5.2.4 TaPon1-like互补子及荧光定位突变株的筛选和验证 |
| 5.2.5 TaPon1-like突变株形态观察 |
| 5.2.6 TaPon1-like突变株降解敌敌畏的功能 |
| 5.2.7 TaPon1-like的原核表达及功能分析 |
| 5.2.8 纯化的reTaPon1-like的底物特异性和酶动力学 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.1.1 深绿木霉T23 可高效降解敌敌畏 |
| 6.1.2 深绿木霉T23 对敌敌畏的降解途径 |
| 6.1.3 敌敌畏胁迫下深绿木霉T23 细胞色素P450 表达模式及其在降解敌敌畏中的作用 |
| 6.1.4 木霉菌源类对氧磷酶基因及其在降解敌敌畏中的作用 |
| 6.2 创新点 |
| 6.2.1 明确了深绿木霉T23 降解敌敌畏的产物并预测了降解途径 |
| 6.2.2 阐明深绿木霉T23 细胞色素P450 调节敌敌畏降解中间产物的转化 |
| 6.2.3 发现深绿木霉T23 中水解敌敌畏的类对氧磷酶基因TaPon1-like |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文和申请的专利 |
| 致谢 |
（4）哈茨木霉TH33疏水蛋白的异源表达及诱导烟草防御反应（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 木霉菌及其生防特性 |
| 1.1.1 木霉菌 |
| 1.1.2 木霉菌的生防特性 |
| 1.2 疏水蛋白概述 |
| 1.2.1 疏水蛋白的性质及分类 |
| 1.2.2 疏水蛋白的结构 |
| 1.2.3 疏水蛋白的功能 |
| 1.3 植物免疫机制 |
| 1.3.1 植物免疫系统 |
| 1.3.2 植物免疫信号传导 |
| 1.3.3 激发子 |
| 1.4 本研究目的意义及技术路线 |
| 1.4.1 目的意义 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 第二章 哈茨木霉TH33疏水蛋白基因克隆及分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 试剂及培养基 |
| 2.1.3 引物及其序列信息 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 疏水蛋白基因克隆 |
| 2.2.2 疏水蛋白生物信息学分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 疏水蛋白基因克隆 |
| 2.3.2 疏水蛋白生物信息学分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 疏水蛋白基因thhyd4和thhyd6 的敲除及突变株分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 试剂及培养基 |
| 3.1.3 引物及其序列信息 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 基因敲除同源片段的扩增 |
| 3.2.2 原生质体转化 |
| 3.2.3 转化子验证 |
| 3.2.4 转化子Southern Blot验证 |
| 3.2.5 野生型菌株TH33 与敲除突变株?thhyd4 和?thhyd6 表型比较 |
| 3.2.6 野生菌与突变株生长率和产孢比较 |
| 3.2.7 野生菌与突变株菌丝疏水性的比较 |
| 3.2.8 野生菌与突变株拮抗性能比较 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 基因敲除所需同源片段的扩增 |
| 3.3.2 原生质体转化及敲除突变株验证 |
| 3.3.3 转化子Southern Blot验证 |
| 3.3.4 哈茨木霉TH33野生菌与突变株表型比较 |
| 3.3.5 野生菌与突变株生长速率和产孢比较 |
| 3.3.6 野生菌与突变株疏水性比较 |
| 3.3.7 野生菌与突变株对病原菌拮抗性能比较 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 哈茨木霉TH33疏水蛋白异源表达及诱导烟草早期防御反应 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 试剂、培养基及仪器 |
| 4.1.3 培养基及试剂配方 |
| 4.1.4 引物及其序列信息 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 原核表达载体构建 |
| 4.2.2 疏水蛋白原核表达 |
| 4.2.3 疏水蛋白真核表达 |
| 4.2.4 疏水蛋白诱导的烟草早期防御反应 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 疏水蛋白原核表达 |
| 4.3.2 疏水蛋白真核表达 |
| 4.3.3 疏水蛋白诱导烟草早期防御反应 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 疏水蛋白处理烟草的代谢组测序分析 |
| 5.1 材料及仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 样品处理 |
| 5.2.2 GC-MS和 LC-MS |
| 5.2.3 GC-MS及 LC-MS数据分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 样品处理 |
| 5.3.2 代谢组测序结果分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 疏水蛋白处理烟草的转录组测序分析 |
| 6.1 材料及仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 样品处理 |
| 6.2.2 转录组测序 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 样品处理 |
| 6.3.2 测序质量评估 |
| 6.3.3 基因表达水平及差异表达分析 |
| 6.3.4 差异基因GO富集分析 |
| 6.3.5 差异基因KEGG富集分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 疏水蛋白处理烟草的代谢组和转录组联合分析 |
| 7.1 材料 |
| 7.2 方法 |
| 7.3 结果与分析 |
| 7.3.1 差异代谢物与差异基因的相关性分析 |
| 7.3.2 差异基因与差异代谢物的pathway和 KGML网络分析 |
| 7.4 讨论 |
| 第八章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）多功能纳米材料用于活性氧及光热肿瘤治疗及人LOX家族蛋白的异源表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写词表 |
| 第一部分 多功能纳米材料用于活性氧及光热肿瘤治疗 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 纳米材料在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.1.1 纳米材料在活性氧肿瘤治疗中的应用 |
| 1.1.2 纳米材料在光热肿瘤治疗中的应用 |
| 1.1.3 纳米材料在其他肿瘤治疗中的应用 |
| 1.2 纳米材料在体内分布及安全性研究 |
| 1.3 本部分研究工作及意义 |
| 第二章 多功能纳米材料的合成及表征 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试剂与药品 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 多功能纳米材料的合成 |
| 2.1.4 多功能材料表征 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Fe_3O_4@PDA/GOx NPs的葡萄糖氧化酶活性检测 |
| 2.2.2 材料形态观察 |
| 2.2.3 粒径分布 |
| 2.2.4 Fe_3O_4@PDA/GO_x的UV-vis的检测 |
| 2.2.5 Fe_3O_4@PDA/GO_xNPs的光热转换能力的体外检测 |
| 2.3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 多功能纳米材料的体外活性氧及光热肿瘤治疗检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂与药品 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 细胞 |
| 3.1.4 细胞培养 |
| 3.1.5 细胞毒性实验 |
| 3.1.6 细胞对铁摄取实验 |
| 3.1.7 细胞环境中过氧化氢(H_2O_2)检测 |
| 3.1.8 细胞环境中及细胞内羟自由基(·OH)检测 |
| 3.1.9 激光共聚焦检测细胞内活性氧ROS |
| 3.1.10 激光共聚焦检测细胞凋亡(TUNEL法) |
| 3.1.11 激光共聚焦检测细胞凋亡(线粒体膜电位检测) |
| 3.1.12 流式细胞仪检测细胞凋亡(Annexin V-FITC法) |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 细胞毒性实验 |
| 3.2.2 细胞对铁摄取实验 |
| 3.2.3 细胞活性氧检测 |
| 3.2.4 细胞凋亡检测 |
| 3.3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第四章 多功能纳米材料的体内活性氧及光热肿瘤治疗检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试剂与药品 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 细胞与动物 |
| 4.1.4 构建小鼠肿瘤模型 |
| 4.1.5 肿瘤小鼠的光热治疗 |
| 4.1.6 血清葡萄糖含量变化 |
| 4.1.7 材料毒性实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 体内抑制肿瘤生长实验 |
| 4.2.2 材料毒性实验 |
| 4.3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第二部分 人LOX家族蛋白的异源表达 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 人LOX家族蛋白的研究进展 |
| 1.1.1 赖氨酰氧化酶概述 |
| 1.1.2 赖氨酰氧化酶的结构 |
| 1.1.3 赖氨酰氧化酶的功能 |
| 1.1.4 赖氨酰氧化酶与癌症 |
| 1.2 人LOX家族蛋白的异源表达 |
| 1.3 蛋白质的异源表达系统 |
| 1.3.1 大肠杆菌表达系统 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统 |
| 1.4 本部分研究工作及意义 |
| 第二章 人LOX家族蛋白的大肠杆菌系统表达 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 菌株、质粒和培养基 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.1.3 重组表达载体的构建 |
| 2.1.4 重组酶的诱导表达 |
| 2.1.5 重组酶的纯化 |
| 2.1.6 重组酶的活性检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 人源LOX蛋白的重组表达及纯化 |
| 2.2.2 重组酶的活性检测 |
| 2.3 讨论 |
| 本章小结 |
| 第三章 人LOX家族蛋白的毕赤酵母系统表达 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 菌株、质粒和培养基 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 重组表达载体的构建 |
| 3.1.4 重组酶的诱导表达与纯化 |
| 3.1.5 重组蛋白检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 LOX的重组表达 |
| 3.3 讨论 |
| 本章小结 |
| 参考文献 |
| 论文发表与专利申请 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）籼粳稻杂种不育系统S5的蛋白互作及转录组研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 研究问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 水稻籼粳亚种间的生殖隔离 |
| 1.2.2 籼粳杂种不育基因的定位 |
| 1.2.3 籼粳杂种不育基因的克隆 |
| 1.2.4 杂种不育的分子演化机制 |
| 1.2.5 籼粳杂种不育位点S5的研究进展 |
| 1.2.6 植物天冬氨酸蛋白酶研究进展 |
| 1.2.7 植物细胞壁研究进展 |
| 1.2.8 植物内质网胁迫 |
| 1.2.9 水稻花粉绒毡层程序性死亡 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料和细胞系 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因蛋白信息查询相关网站 |
| 2.2.2 酵母双杂交文库的筛选 |
| 2.2.3 烟草BY-2 稳定表达细胞系的构建 |
| 2.2.4 植物细胞瞬时表达 |
| 2.2.5 组织切片染色 |
| 2.2.6 水稻DNA抽提和转基因植株阳性检测 |
| 2.2.7 水稻蛋白抽提和Western Blot |
| 2.2.8 利用原生质体确定膜拓扑结构 |
| 2.2.9 病菌接种和病斑测量 |
| 2.2.10 表达量以及OsbZIP50的检测 |
| 2.2.11 取样和转录组文库构建 |
| 2.2.12 数据分析 |
| 2.3 载体 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ORF3-5 互作蛋白的寻找 |
| 3.1.1 穗组织酵母双杂交文库的构建 |
| 3.1.2 酵母双杂交文库的筛选 |
| 3.1.3 ORF4+互作蛋白推测与验证 |
| 3.2 ORF4和ORF5稳定悬浮细胞系的构建与处理 |
| 3.3 ORF4和ORF5的共定位研究 |
| 3.4 ORF5在拟南芥中影响PR基因的表达 |
| 3.5 ORF5+的天冬氨酸蛋白酶活性位点诱变 |
| 3.6 Balilla，BalillaORF5+和BalillaORF3+ORF5+胚囊发育过程 |
| 3.7 败育胚囊MAPK6含量分析 |
| 3.8 ORF3+的功能研究 |
| 3.9 转录组数据分析 |
| 3.9.1 RNAseq文库的构建与测序 |
| 3.9.2 BL5+/BL差异表达基因分析 |
| 3.9.3 BL5+/BL中内质网胁迫和PCD相关基因分析 |
| 3.9.4 BL5+/BL中细胞壁重构相关基因分析 |
| 3.9.5 BL5+中纤维素的积累 |
| 3.9.6 BL5+中胼胝质的积累 |
| 3.9.7 BL5+/BL中驱动蛋白表达量变化分析 |
| 3.9.8 BL3+5+/BL差异表达基因分析 |
| 3.9.9 BL3+5+/BL5+差异表达基因分析 |
| 3.9.10 基于转录组分析推测的S5位点作用模式 |
| 3.10 ORF4功能研究 |
| 3.10.1 ORF4+的跨膜拓扑结构 |
| 3.10.2 ORF4+内吞位点分析 |
| 3.10.3 ORF4+影响株高和分蘖数 |
| 3.10.4 假病斑与胼胝质的积累 |
| 3.10.5 ORF4+的抗病性 |
| 3.10.6 ORF4+的敲除 |
| 4 讨论 |
| 4.1 S5位点控制的胚囊败育是一个复杂的过程 |
| 4.2 ORF4和ORF5的表达模式与胚囊败育 |
| 4.3 S5诱导的PCD |
| 4.4 细胞壁相关基因与S5介导的胚囊败育 |
| 4.5 ORF5功能探讨 |
| 4.6 ORF4功能探讨 |
| 4.7 ORF3功能探讨 |
| 4.8 不同系统对S5筛选互作蛋白的影响 |
| 4.9 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录I 附表 |
| 附表 1 细胞壁相关基因的log2表达量变化 |
| 附表 2 Real-time PCR引物 |
| 附录II 部分实验的详细步骤 |
| Protocol 1 水稻原生质体瞬时表达 |
| Protocol 2 利用拟南芥悬浮细胞系做原生质体瞬时表达 |
| Protocol 3 苯酚-氯仿纯化获取高纯度质粒 |
| Protocol 4 转基因BY-2 悬浮细胞系的构建 |
| Protocol 5 植物组织石蜡切片 |
| Protocol 6 大肠杆菌感受态的制备 |
| Protocol 7 农杆菌感受态制备 |
| Protocol 8 酵母试剂配方 |
| Protocol 9 RNA抽提和反转录 |
| Protocol 10 SDs-PAGE和Western Blot配方 |
| 附录III 作者简介 |
| 致谢 |
（7）鸡α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒功能初探（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒和菌株 |
| 1.1.2 试剂和培养基 |
| 1.1.3 血清和酶标抗体 |
| 1.1.4 鸡胚和病毒 |
| 1.2 重组质粒p PIC9K-IFNα的构建 |
| 1.3 重组质粒p PIC9K-IFNα的转化及鉴定 |
| 1.3.1 p PIC9K-IFNα的转化 |
| 1.3.2 重组酵母阳性克隆子的PCR鉴定 |
| 1.4 重组酵母菌的表达纯化和斑点杂交分析 |
| 1.5 重组鸡α干扰素抗病毒活性的初步检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组质粒p PIC9K-IFNα的构建 |
| 2.2 重组酵母染色体阳性克隆子p PIC9K-IFNα的PCR鉴定 |
| 2.3 重组酵母菌的表达和dot-blot分析 |
| 2.4 重组鸡α干扰素表达产物抗病毒活性初步检测 |
| 3 讨论与结论 |
（8）新孢子虫tNcSRS2基因在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达及其应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 新孢子虫病的研究概况 |
| 1.2 大肠杆菌表达系统及应用 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第2章 新孢子虫tNcSRS2基因在大肠杆菌中的表达及应用 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 新孢子虫tNcSRS2基因在毕赤酵母中的表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）透明颤菌血红蛋白基因在β-甘露聚糖酶工程菌中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 β-甘露聚糖酶简介 |
| 1.1.1 β-甘露聚糖酶的来源 |
| 1.1.2 β-甘露聚糖酶的酶学特性 |
| 1.1.3 甘露聚糖酶的应用 |
| 1.2 透明颤菌血红蛋白概述 |
| 1.2.1 透明颤菌简述 |
| 1.2.2 透明颤菌血红蛋白 |
| 1.2.3 透明颤菌血红蛋白的结构与特征 |
| 1.2.4 透明颤菌血红蛋白的功能 |
| 1.2.5 透明颤菌血红蛋白的克隆、表达与调控 |
| 1.2.6 VHb的作用机制 |
| 1.3 VHb的分子生物学研究进展 |
| 1.4 透明颤菌血红蛋白在工业生产中的应用 |
| 1.4.1 在抗生素生产中的应用 |
| 1.4.2 提高酶活及蛋白产量 |
| 1.4.3 VHb在其它代谢产物的生产中的应用 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 主要实验思路 |
| 1.7 课题来源 |
| 第二章 优化合成后的透明颤菌血红蛋白基因(VHB)及其在毕赤酵母中的表达 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的优化设计与合成原理与方法 |
| 2.2.6 TA克隆方法 |
| 2.2.7 重组去信号肽表达载体(pGAPZ B)的构建原理与方法 |
| 2.2.8 毕赤酵母电转方法 |
| 2.2.9 毕赤酵母菌落PCR方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的优化设计与合成 |
| 2.3.2 透明颤菌血红蛋白基因(VHB)的克隆与鉴定 |
| 2.3.3 重组表达载体(pGAPZ B-VHB)的构建与鉴定 |
| 2.3.4 毕赤酵母电转与重组子筛选 |
| 2.3.5 重组酵母的PCR鉴定 |
| 2.3.6 透明颤菌血红蛋白表达对毕赤酵母生长的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 透明颤菌血红蛋白性质研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验主要试剂 |
| 3.2.2 实验菌种与抗体 |
| 3.2.3 溶液配制 |
| 3.2.4 主要仪器和设备 |
| 3.2.5 SDS-PAGE方法 |
| 3.2.6 蛋白分离纯化方法 |
| 3.2.7 免疫杂交分析方法 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 重组酵母的蛋白表达与SDS-PAGE检测 |
| 3.3.2 透明颤菌血红蛋白分离纯化 |
| 3.3.3 透明颤菌血红蛋白单抗筛选 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母β-甘露聚糖酶工程菌的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 菌种、质粒来源 |
| 4.2.4 生长曲线测定方法 |
| 4.2.5 β-甘露聚糖酶酶活测定方法 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 电转毕赤酵母β-甘露聚糖酶工程菌与重组子筛选 |
| 4.3.2 重组酵母表达产物分析与SDS-PAGE检测 |
| 4.3.3 重组毕赤酵母透明颤菌血红蛋白的免疫杂交鉴定 |
| 4.3.4 透明颤菌血红蛋白(VHB)表达对工程菌生长的影响 |
| 4.3.5 透明颤菌血红蛋白(VHB)表达对工程菌酶活的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果 |
（10）鸡IL-2cDNA及其去信号肽cDNA的原核和酵母表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 白细胞介素2 概况 |
| 1 IL-2 的分类、结构与功能 |
| 2 IL-2 受体（IL-2R） |
| 3 IL-2 的纯化和突变分析 |
| 4 白细胞介素2 的生物学功能 |
| 5 白介素2 基因克隆与表达 |
| 6 IL-2 在畜禽业中的应用前景 |
| 6.1 传染性法氏囊病(IBD)是目前危害世界养禽业的两大传染病之一 |
| 6.2 马立克病(MD)由 B 疱疹病毒引起的、具有高度接触传染性的肿瘤性疾病 |
| 6.3 IL-2 在其他抗感染免疫中也发挥同样作用 |
| 第二章 大肠杆菌表达系统 |
| 1 大肠杆菌表达系统的特点 |
| 2 表达载体 |
| 3 外源基因在大肠杆菌中表达效率的影响因素 |
| 3.1 密码子的选用 |
| 3.2 外源基因mRNA 的稳定性 |
| 3.3 翻译起始效率 |
| 第三章 巴斯德毕赤酵母（ P.pastoris）研究进展 |
| 1 巴斯德毕赤酵母表达系统概述 |
| 2 巴斯德毕赤酵母菌株 |
| 3 巴斯德毕赤酵母表达载体 |
| 4 基因整合 |
| 5 影响外源基因表达的因素 |
| 5.1 启动子的影响 |
| 5.2 外源基因自身的影响 |
| 5.3 信号肽 |
| 5.4 基因剂量 |
| 5.5 发酵条件 |
| 第二篇 研究报告 |
| 第一章 鸡 IL-2 cDNA 及其去信号肽 cDNA的克隆与原核表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 鸡胚和新城疫疫苗 |
| 1.2 菌株和载体 |
| 1.3 工具酶和主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 目的基因的扩增 |
| 2.2 目的基因的克隆 |
| 2.3 重组克隆质粒的提取与鉴定 |
| 2.4 重组表达质粒的构建 |
| 2.5 重组表达质粒的提取与鉴定 |
| 2.6 重组质粒的诱导表达与鉴定 |
| 2.7 ChIL-2 全基因和去除信号肽基因mRNA 二级结构的预测 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 RT-PCR 产物的鉴定 |
| 3.2 重组克隆质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 重组原核表达质粒的酶切鉴定与测序 |
| 3.4 表达产物SDS-PAGE 电泳 |
| 3.5 表达产物的Western-bloting 鉴定 |
| 3.6 ChIL-2 全基因和去除信号肽基因mRNA 二级结构的分析 |
| 4 讨论 |
| 第二章 鸡 IL-2 cDNA 及其去信号肽cDNA 酵母表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株和载体 |
| 1.2 工具酶和主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 酵母重组表达质粒的构建 |
| 2.2 酵母重组表达质粒提取与鉴定 |
| 2.3 毕赤酵母菌的转化 |
| 2.4 重组菌株的筛选与鉴定 |
| 2.5 重组酵母菌的诱导表达与鉴定 |
| 2.6 ChIL-2 全基因和去除信号肽基因mRNA 二级结构的预测 |
| 3 结果和分析 |
| 3.1 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2 重组表达质粒线性化 |
| 3.3 高抗性重组酵母菌株的筛选 |
| 3.4 重组酵母菌株基因组的PCR 鉴定 |
| 3.5 重组酵母菌株的诱导表达 |
| 3.6 Western-blotting 鉴别表达产物 |
| 3.7 预测ChIL-2 全基因和去除信号肽基因mRNA 二级结构 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩写词英汉对照表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
四、去信号肽的木质素过氧化物酶基因在甲醇毕赤酵母中的表达（论文参考文献）
- [1]条锈菌效应子Pst13662抑制小麦抗条锈病的分子机理初探[D]. 孙书田. 西北农林科技大学, 2021
- [2]玉米大斑病菌LysM效应因子的筛选及分析[D]. 张璐. 河北农业大学, 2020(06)
- [3]深绿木霉T23对敌敌畏的降解特性及机制[D]. 孙佳楠. 上海交通大学, 2020
- [4]哈茨木霉TH33疏水蛋白的异源表达及诱导烟草防御反应[D]. 黄佩. 中国农业科学院, 2020(01)
- [5]多功能纳米材料用于活性氧及光热肿瘤治疗及人LOX家族蛋白的异源表达[D]. 张甜甜. 山东大学, 2018(02)
- [6]籼粳稻杂种不育系统S5的蛋白互作及转录组研究[D]. 朱艳芬. 华中农业大学, 2017(12)
- [7]鸡α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒功能初探[J]. 韦琴,吴士筠,梅辉,叶斌. 江苏农业科学, 2014(10)
- [8]新孢子虫tNcSRS2基因在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达及其应用研究[D]. 陈亮. 新疆农业大学, 2012(06)
- [9]透明颤菌血红蛋白基因在β-甘露聚糖酶工程菌中的表达[D]. 王俐琼. 中南大学, 2011(12)
- [10]鸡IL-2cDNA及其去信号肽cDNA的原核和酵母表达研究[D]. 龚婷. 甘肃农业大学, 2008(04)