一、鸡马立克氏病CV1988/Rispens冷冻活疫苗和HVT冻干苗效力比较试验（论文文献综述）
白雪雁[1]（2019）在《表达基因Ⅶ型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株构建及其免疫效力试验》文中研究说明新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus）引起的禽类急性、烈性、高度接触性传染病。近年来,在我国流行的NDV强毒株主要是基因VII型,而广泛使用的La Sota疫苗毒株是基因II型。虽然La Sota疫苗对基因VII型NDV毒株可提供良好的临床保护,但是并不能有效阻止感染禽的排毒。因此,研制与NDV流行毒株基因型相匹配的疫苗对于ND的防控具有重要意义。火鸡疱疹病毒（HVT）FC126株在抗原性上与马立克氏病毒（MDV）相近,常用于鸡马立克氏病（MD）的预防。由于HVTFC126株的基因组含有较多可供外源基因插入的复制非必需区,同时又可以冻干保存,常作为禽用重组病毒疫苗的载体。融合（F）蛋白是NDV囊膜表面的主要糖蛋白,与NDV的致病性直接相关,也是主要保护性抗原。本研究以HVT FC126株的US2复制非必需区作为外源基因的插入位点,构建表达基因VII型NDVF蛋白的重组病毒疫苗株;此外,还将构建缺失F蛋白跨膜区的重组病毒,以期将表达的F蛋白分泌到重组病毒囊膜外,避免机体内抗体的中和作用,并评价了两株重组病毒疫苗的免疫效力首先构建含HVT FC126株外源基因插入位点处上下游序列的中间质粒pCR2.1-US2,然后将EGFP基因表达盒克隆到此中间质粒,获得转移载体质粒pCR2.1-US2-EGFP;采用磷酸钙共沉淀法,将pCR2.1-EGFP和HVT FC126株基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经同源重组获得表达EGFP的重组病毒rHVT-EGFP。采用与上述类似的方法和步骤,用基因VII型NDV F基因表达盒替代rHVT-EGFP的EGFP基因表达盒,构建表达NDVF蛋白的重组病毒。以基因VII型NDVDT2014毒株基因组为模板,采用RT-PCR扩增其F基因。将F基因插入至真核表达载体pEASY（?）-M3中,再经PCR扩增含CMV启动子、TK ployA终止子和Flag标签的F基因表达盒。将F基因表达盒克隆到中间质粒pCR2.1-US2,构建转移载体pCR2.1-US2-F。对F基因的跨膜区进行分析,显示F蛋白含有两个跨膜区,分别位于117-139和502-525位氨基酸的位置;以pCR2.1-US2-F为模板,采用重叠延伸PCR的方法分别对两个跨膜区进行缺失,构建缺失跨膜区的转移载体pCR2.1-US2-△F。分别将pCR2.1-US2-F和pCR2.1-US2-△F与rHVT-EGFP基因组DNA共转染CEF,拯救出两株重组病毒rHVT-NDV-VII-F和rHVT-NDV-VII-△F。用有限稀释法对重组病毒进行反复纯化,直至病毒蚀斑在荧光显微镜下观察均不带荧光。通过PCR验证,F基因正确插入到重组病毒基因组。以基因Ⅶ型NDV的阳性血清为一抗,进行间接免疫荧光试验,两株重组病毒均呈阳性反应;以Flag标签蛋白作为一抗,进行Western-blot试验,重组病毒rHVT-NDV-VII-F成功表达了约55kDa和60kDa的目的条带,重组病毒rHVT-NDV-VII-△F成功表达约60kDa的目的条带。两株重组病毒在CEF细胞上的生长特性与HVT FC126株疫苗毒株相似。为了评价重组病毒rHVT-NDV-VII-F和rHVT-NDV-VII-△F的免疫效力,用1日龄SPF鸡进行了动物试验。动物试验分组依次是:rHVT-NDV-VII-F组、rHVT-NDV-VII-△F组、弱毒疫苗组、攻毒对照组、空白对照组,每组各20只鸡。首先对rHVT-NDV-VII-F组和rHVT-NDV-VII-△F组的1日龄鸡只进行免疫接种,颈部皮下注射相应的重组病毒,剂量为5000蚀斑形成单位（PFU）/鸡;弱毒疫苗组则在鸡只7日龄时,接种La Sota疫苗。除空白对照组外,其余各组于鸡只21日龄时攻毒,以滴鼻点眼的方式接种105EID5o/鸡的NDV DT-2014株。攻毒后连续观察14天,统计各实验组的临床症状和死亡率。并于攻毒后第3天,采集各组咽喉、泄殖腔的棉拭样品,提取RNA,以荧光定量PCR的方法检测排毒情况。动物试验结果显示:在攻毒后的第3天,两株重组病毒免疫组的排毒量显着低于攻毒对照组,其中重组病毒rHVT-NDV-VII-F组排毒量最低,其次是重组病毒rHVT-NDV-VII-AF 组。针对 NDV DT-2014 株强毒的攻击,两株重组病毒可使鸡的发病和死亡时间大大推迟,rHVT-NDV-VII-F组的存活率为40%。表明重组病毒rHVT-NDV-VII-F对基因Ⅶ型NDV可提供一定的保护,可望作为预防和控制ND的疫苗候选株。
白银荣[2]（2018）在《利用CRISPR/Cas9技术构建表达EGFP的两株重组火鸡疱疹病毒rHVT-US2/US10-EGFP》文中进行了进一步梳理本研究利用CRISPR/Cas9的基因编辑技术建立了火鸡疱疹病毒的载体平台,并拯救获得在US2或US10基因内表达外源基因的重组火鸡疱疹病毒。首先根据HVT FC-126毒株US2基因序列,设计并合成g RNA,并通过双链退火的方式,获得目的片段。目的片段与Bbs1酶切处理后的px330载体连接,获得重组质粒px330-gRNA。通过PCR的方法,分别扩增获得US2的g RNA序列两侧的同源臂A（US2A）和B（US2B）及EGFP编码蛋白的序列,并通过PCR的方法,扩增获得US2A-EGFP-US2B片段。将px330-g RNA和US2A-EGFP-US2B电转入鸡胚成纤维细胞。24h后,将电转的细胞感染HVT FC-126。感染后72h,收集较大荧光簇的细胞。进一步地将收集的细胞团稀释成一定的浓度并接种于新的鸡胚成纤维细胞。通过蚀斑纯化的方法,最终获得了稳定表达EGFP的重组病毒rHVT-US2-EGFP。用同样的方法,也获得了稳定表达EGFP的重组病毒rHVT-US10-EGFP。这些研究结果建立了HVT重组表达载体系统,为后期的拯救稳定表达外源蛋白HVT重组病毒及其应用研究奠定基础。
韩妮[3]（2018）在《先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别》文中认为鸡马立克病（Marek’s disease,MD）是由鸡马立克病病毒（Marek’s disease virus,MDV）引起的一种鸡上最常见的T淋巴细胞增生性疾病。疫苗免疫是防控MD的主要措施。目前,我国使用最广泛的是CVI988/Rispens疫苗。然而近年来,有的鸡群免疫CVI988/Rispens疫苗后仍有马立克病的发生,影响了我国养禽业的健康发展,造成经济损失。禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）是一种可以引起多种肿瘤性疾病的免疫抑制性病原,它主要通过垂直感染的方式进行传播。流行病学调查显示,MDV感染鸡群常伴发ALV等免疫抑制性病原的共感染,ALV的先天感染有可能是造成免疫CVI988/Rispens疫苗鸡群仍发生MD的原因之一。为证实这一推论,本文通过动物试验人工模拟先天感染J亚群禽白血病病毒（ALV-J）探究对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响。此外,针对本实验室研发的新型MD疫苗SC9-1株与市场其他疫苗株尚无特异性鉴别方法的问题,建立了区别SC9-1株与其他株MD疫苗的分子鉴别方法。1.先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响为研究先天感染ALV-J对CVI988/Rispens疫苗免疫保护效果的影响,将200枚SPF鸡胚分为5组,每组40枚。第1、2组为先天感染ALV-J组,在6胚龄时通过卵黄囊途径接种500 TCID500 ALV-J NX0101株。出壳后,第1、2、3、5组鸡颈部皮下免疫CVI988/Rispens疫苗,6日龄对第2、3、4组鸡均以2000 PFU/只的剂量腹腔注射MDV超强毒GX0101。试验期间,观察并记录各组鸡的病变及死亡情况,统计死亡率和肿瘤发生率,对疑似马立克病特有的病变脏器做病理切片;MDV GX0101攻毒后第1、2、3、4、5、6周称量各组鸡的体重;所有鸡10日龄免疫禽流感、新城疫灭活苗,免疫后第3、4、5周检测相应抗体水平;在GX0101攻毒后第1周每组随机选取5只鸡进行剖检,选取胸腺和法氏囊测定免疫器官指数;第2、3、4组在GX0101攻毒后5、10、14、21、28天,每组各随机选取6只鸡采集抗凝血分离淋巴细胞提取DNA,利用荧光定量PCR方法检测GX0101的拷贝数。研究结果表明,先天感染ALV-J增加了CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒鸡的死亡率和肿瘤率,2组死亡鸡中一只鸡肝脏出现肿瘤,1、2、3、4、5各组鸡的死亡率分别为:5.7%、20%、2.9%、37.1%、0%;先天感染ALV-J、CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组鸡的体重与CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组鸡相比,体重显着降低（P<0.05）,引起胸腺和法氏囊的萎缩,显着抑制AIV-H9、NDV抗体的产生,GX0101的拷贝数在第14、21、28天显着高于CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组。因此,先天感染ALV-J降低了CVI988/Rispens疫苗的免疫保护效果,引起感染鸡的免疫抑制,增强了GX0101在鸡体内的复制水平以及致病性,这或许表明先天感染ALV是造成免疫CVI988/Rispens疫苗后鸡群仍发生MD的原因之一。2.不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立为了对马立克病病毒meq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株和HVT Fc-126株进行分子鉴别,根据疫苗株SC9-1与其它MD疫苗株的基因组差异,分别针对I型MDV meq基因以及SC9-1基因组中的禽网状内皮组织增殖症病毒-长末端重复序列（REV-LTR）插入片段,设计三对PCR扩增引物,同时合成针对meq基因和REV-LTR片段的地高辛标记探针,通过PCR扩增和核酸斑点杂交方法区分SC9-1株与其他疫苗株。结果表明,使用针对meq基因的引物F1/R1进行PCR扩增,SC9-1株、CVI988/Rispens株、814株分别扩增出184bp、1297bp、1297bp目的片段,HVT Fc-126株没有条带;使用针对meq基因的引物F2/R2进行PCR扩增,CVI988/Rispens株、814株均扩增出746bp目的片段,SC9-1株、HVT Fc-126株均没有条带;使用针对REV-LTR片段设计的引物F3/R3进行PCR扩增,SC9-1株扩增出512bp目的片段,CVI988/Rispens株、814株、HVT Fc-126株均没有条带。同时,使用针对meq基因的探针进行核酸斑点杂交,CVI988/Rispens株、814株均显示阳性结果,SC9-1株、HVT Fc-126株均为阴性;使用针对REV-LTR的探针进行核酸斑点杂交,SC9-1株显示阳性结果,CVI988/Rispens株、814株、HVT Fc-126株均为阴性。因此,利用本研究设计的特异性PCR引物以及探针,通过PCR扩增和核酸斑点杂交方法可以有效区分SC9-1与市场其他MD疫苗株。
周忠文[4]（2018）在《表达REV env基因的重组马立克病毒的构建及生物学活性研究》文中研究表明禽网状内皮组织增生病（Reticuloendotheliosis,RE）、马立克病（Marek’s disease,MD）是危害我国养禽业健康发展的两大重要免疫抑制性疫病。前期对我省乃至全国范围内鸡群RE的检测,表明RE在鸡群的流行越来越普遍,然而,目前尚没有有效的疫苗对RE进行防控。苏帅等构建了马立克病毒（Marek’s disease virus,MDV）致肿瘤基因meq的缺失疫苗SC9-1,能够为免疫鸡提供100%的免疫保护,显着高于MD商品化疫苗CVI988/Rispens的免疫保护（保护率80-90%）。本研究利用SC9-1构建了表达禽网状内皮增生病病毒（Reticuloendotheliosi s virus,REV）env基因的重组MDV,并对其生物学活性进行了研究。1、构建表达REV env的重组MDV SC9-env,并对其致病性、免疫保护效果进行了研究以REV SNV株DNA为模板,PCR扩增其env基因,克隆进真核表达载体pcDNA3.1（+）;以其为模板,PCR扩增整个REV env基因真核表达盒与卡那霉素抗性基因分别克隆进pUC18载体;pUC18-env-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV env真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重组插入SC9-1的meq位点,分别筛选出阳性后,最终利用阿拉伯糖诱导表达flp重组酶,敲除卡那霉素抗性基因,阳性重组质粒命名为SC9-env BAC。选阳性重组质粒SC9-env BAC,转染CEF细胞,拯救重组MDV,利用MDV单抗H19以及REV单抗11B118经间接免疫荧光试验鉴定阳性,命名为SC9-env,分析在CEF细胞上的复制水平,利用动物实验评价SC9-env对SPF鸡的致病性以及SC9-env对SPF鸡感染MDV、REV的免疫保护效果。SC9-env接种SPF鸡没有引起死亡以及肿瘤的发生;SC9-env对感染MDV rMd5的SPF鸡能够提供92%的免疫保护,与SC9-1差异不显着;SC9-env能够降低SNV感染SPF鸡引起的体重减轻以及灭活苗抗体水平的下降。2、利用同源重组技术构建了表达REV env、gp90的不同重组MDV以REV SNV株DNA为模板,PCR扩增其env基因、gp90基因,克隆进真核表达载体pCAGGS;以其为模板,PCR扩增整个REV env基因真核表达盒、REV gp90基因真核表达盒并与卡那霉素抗性基因分别克隆进pUC18载体。以pUC18-env-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株US10基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV env真核表达盒以及卡那霉素抗性基因;以pUC18-gp90-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株US10基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV gp90真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重组插入SC9-1的US10位点;以pUC18-gp90-kana为模板,利用含有MDV SC9-1株meq基因位点两侧同源臂的引物经PCR扩增REV gp90真核表达盒以及卡那霉素抗性基因,利用同源重组插入SC9-1的meq位点。分别筛选出阳性后,最终利用阿拉伯糖诱导表达flp重组酶,敲除卡那霉素抗性基因,阳性重组质粒命名为SC9-gp90-2 BAC、SC9-env-3 BAC、SC9-gp90-4 BAC;分别提取SC9-gp90-2 BAC、SC9-env-3 BAC、SC9-gp90-4 BAC质粒,转染CEF细胞,拯救三种种重组MDV,利用MDV单抗H19以及REV单抗11B118经间接免疫荧光试验鉴定阳性,命名为SC9-gp90-2、SC9-env-3、SC9-gp90-4。本研究为进一步构建表达REV env基因的重组MDV并评价其免疫保护效果奠定基础。结果表明,利用同源重组技术构建的重组MDV SC9-env、SC9-env-3能够稳定表达REV env蛋白,SC9-gp90-2、SC9-gp90-4能够稳定表达REV gp90蛋白。重组MDV SC9-env在CEF细胞上的复制水平与亲本病毒SC9-1相似。3、不同启动子的真核重组质粒pcDNA-env、pCAGGS-env、gB-env在CEF细胞上REV env表达效果的比较比较带有不同启动子的重组质粒pcDNA-env、pCAGGS-env、gB-env在细胞上表达效果。结果表明β-actin启动子活性强于cmv启动子,而且cmv启动子活性强于gB启动子活性。重组gp90蛋白免疫鸡可诱导鸡产生特异性抗体,未发现不良反应,说明重组亚单位疫苗对雏鸡和种鸡是安全可靠的。结果表明,gp90蛋白具有良好的抗原性,RE亚单位疫苗可以诱导高水平的抗体反应,对雏鸡和种鸡均具有良好的免疫效力。本研究构建能够表达禽网状内皮组织增生病病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）env基因或gp90基因的重组MDV并对其生物学活性进行研究。本研究以前期构建的血清I型MDV meq基因缺失株SC9-1为载体,利用同源重组技术将REV env、gp90基因插入SC9-1的基因组,构建重组MDV,SC9-1为载体能够稳定表达外源基因,构建的重组MDV SC9-env对SPF鸡没有致病性,本研究对SPF鸡感染MDV、REV均具有一定的免疫保护效果为其它重组MDV的构建提供思路,也为REV的免疫防控奠定基础。
申晓晨[5]（2017）在《表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗的构建》文中研究指明火鸡疱疹病毒（Herpes virus of turkey,HVT）Fc-126株自20世纪70年代以来一直作为马立克氏病（Marek’s disease,MD）疫苗使用,也作为表达外源保护性抗原基因的病毒载体,作为载体有许多优势:HVT无致瘤性,使用安全;HVT宿主范围窄,只感染鸡和火鸡,不感染人;接种后可持续刺激鸡体产生高水平抗体;可以制成冻干苗,运输储存方便;免疫接种不需要佐剂,减轻对动物应激刺激;生产成本低。目前养禽生产中广泛使用的H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）全病毒灭活疫苗虽具有良好的免疫效果,但此类疫苗不能诱导有效的细胞免疫应答和黏膜免疫应答,同时受母源抗体的干扰较大。本研究旨在研制以HVT为载体,表达H9N2 AIV HA抗原的重组活载体疫苗,该疫苗可以刺激鸡体产生潜伏感染,引起终生免疫,为有效防控H9N2禽流感和马立克氏病提供技术支持,具有重要的生产指导意义。本研究首先构建HVT细菌人工染色体（BAC）,以BAC为载体,利用黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Eco-gpt）作为筛选标记基因,将构建成功的重组病毒转移载体与HVT全基因组共同转染鸡胚原代成纤维细胞（CEF）,待其产生噬斑后利用加压筛选培养基筛选重组病毒,经过5轮筛选得到纯化的重组病毒。以构建成功的HVT BAC为平台,联合使用RED/ET重组技术和ccdB反向筛选技术得到表达HA基因的重组火鸡疱疹病毒。利用两步重组法:第一步将两端带有50bp同源臂的正/反向筛选基因ccdB-amp基因表达盒电转化入包含了 HVT细菌人工染色体的DH10B感受态细胞,在RecE/T重组酶的作用下,进行同源重组,将选择标记基因ccdB-amp替换在HVT的US2区;第二步,将带有同样50bp同源臂的HA基因表达盒替换掉选择标记基因ccdB-amp,实现无痕突变。通过酶切鉴定和测序,鉴定正确的克隆大量扩繁纯化,转染CEF,再拯救重组病毒,并通过间接免疫荧光检测,确定了 HA基因在重组病毒中得到表达。本研究为新型重组活载体疫苗的研制打下了基础,对养禽业MD和AI的防控具有重要意义。
陈健[6]（2016）在《鸡传染性支气管炎H120株活疫苗耐热保护剂的工艺研究》文中进行了进一步梳理传染性支气管炎（Infectious Bronchitis, IB）是由传染性支气管炎病毒引起的一种常见的传染病。该病毒具有囊膜结构,且对温度敏感,该特性为研制传染性支气管活炎疫苗耐热保护剂研究增加了难度。由于温度容易影响该病毒的活性,导致冻干后疫苗产品的病毒效价损失较高,使得传染性支气管炎冻干苗的贮存面临挑战,这也是目前国内生物制品行业的一个普遍性难题。国内常规的冻干苗必须保存在-15℃以下,且保存期偏短,而国外的冻干苗产品在2～8℃可保存两年以上。为降低疫苗效价的损失、提高疫苗质量、延长保存期、解决冷链运输等问题,本文旨在研制鸡传染性支气管炎病毒H120株耐热保护剂。本文的研究内容分为三部分,即耐热保护剂成分的筛选以及冻干曲线参数的调试、耐热保护剂的耐老化实验、耐热保护剂冻干疫苗的实验。在耐热保护剂成分筛选的实验中,共尝试了8组不同的配方,编号从A到H,其中C组又分为C1-C6,D组分为D1、D2。分组冻干后,通过比较产品冻型、溶解度、残留水分含量、效价损失,最终筛选出效果最好的E组作为耐热保护剂,其主要成分为多聚蛋白胨和海藻糖。冻干曲线的调试对冻干疫苗的质量也是至关重要的,必须确保每组耐热保护剂都对应一条合适的冻干曲线。首先对不同的耐热保护剂配制的疫苗进行少量冻干,依据冻干后产品的形态,改变冻干曲线的参数,如预冻的最低温度、升华干燥的温度及真空度等。最终确保当批量疫苗冻干时,产品的形态一致且美观,方可将此次调试的冻干曲线作为标准。调试的冻干曲线（E组）参数如下：预冻的最低温度为-45℃,升华干燥的真空度为0.08mbar,升华温度为-15℃,解析干燥温度为26℃,总冻程约43 h。将E组制成的疫苗分别在37℃、室温（20℃）、2-8℃环境条件下放置10天、2个月、1年,间隔一段时间测定一次EID50,同时设置常规疫苗作为对照组。数据显示,随着时间的推移,疫苗病毒的效价会持续不断降低。耐热保护剂冻干疫苗在37℃条件下放置10d,其效价由10-4.32下降到10-3.38；在室温中放置2个月,效价由10-4.625降到10-3.620,常规疫苗则在1周后就从10-4.75降到10-3.52；耐热保护剂冻干疫苗在2～8℃条件下放置12个月时,效价由10-4.36降到10-3.37,第6个月时检测效价达到10-3.82,而常规疫苗在半年之后效价已经从10-4.45降到10-3.44。将耐热保护剂冻干疫苗用于动物实验,包括安全性检验、免疫效力检验及抗体水平监测。将易感鸡分为A（耐老化前的疫苗）、B（耐老化后的疫苗）、C（PBS对照）三组,每组10只。安全性检验的免疫剂量为10羽份,三组的存活率均达到80%以上。免疫效力检验使用的攻毒株为M41株,攻毒剂量为1羽份,A、B两组的保护率均达到80%以上,对照组只有1只鸡存活。对发病鸡与外表健康鸡进行解剖,作气管的病理切片,电镜下可见发病鸡的气管纤毛脱落,细胞坏死,而外表健康鸡则纤毛完整。抗体水平测试数据表明,A、B两组抗体消长趋势一致,且A组效果较好。两组在21-28 d均达到抗体的最高水平。综上所述,与国内的常规疫苗相比较,本文研制的耐热保护剂对传染性支气管炎冻干苗的保护效果更好。在37℃可保存10 d,在20℃左右的室温中可保存2个月,在2～8℃条件下可保存1年以上,保存期均比常规疫苗长。由此可见该耐热保护剂的研制对提高疫苗质量、解决冷链运输等问题可提供帮助。
刘杉杉[7]（2016）在《鹦鹉热衣原体pmpD-N基因重组HVT的构建及其免疫效果评价》文中指出鹦鹉热衣原体是专性胞内革兰氏阴性菌,禽感染后能够引起禽衣原体病,人感染后通常表现为流感样症状。衣原体免疫需要高效的细胞免疫和体液免疫,商品化的鹦鹉热衣原体亚单位疫苗不能提供良好的细胞免疫应答。火鸡疱疹病毒（HVT）可以诱导机体产生良好的细胞免疫和体液免疫,已经广泛应用于开发家禽的多价活载体疫苗。本研究首先建立了检测鹦鹉热衣原体抗体的间接ELISA方法和检测HVT病毒含量的实时荧光定量PCR方法,之后通过利用细菌人工染色体（BAC）技术构建表达pmpD-N基因的重组HVT活载体疫苗,并将该疫苗免疫鸡后评价其对马立克病毒和鹦鹉热衣原体的保护效果。PmpD-N ELISA方法的建立及初步应用：采用纯化的鹦鹉热衣原体PmpD-N重组蛋白为包被抗原,优化反应条件和检测限,建立检测抗体的间接ELISA方法。结果表明该方法敏感性为97.9%,特异性为100%,重复性好,与MOMP ELISA符合率为98.1%。该方法可以用于临床血清样品的检测,同时为本研究后续疫苗免疫后抗体水平的监测奠定基础。火鸡疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立：以HVT的sorfl区基因构建的重组质粒为标准品,建立检测HVT的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示获得的标准曲线循环闽值（Ct）与模板拷贝数呈良好线性关系（r2=0.99）,熔解曲线分析显示其PCR扩增具有良好的特异性,能检测到的最低模板浓度为7×10’拷贝/μL,对不同浓度的质粒重复检测得出的Ct值的变异系数最高仅为1.44%,并可以鉴别诊断HVT和CV1988。该方法可用于HVT病毒含量测定,同时为本研究后续检测HVT的体内外增殖情况提供了有效手段。pmpD-N基因重组HVT的构建：改造HVT感染性BAC克隆,使其分别表达带有CMV和EF-1 α启动子的pmpD-N基因,拯救重组BAC,体外鉴定重组病毒的相关特性。结果成功获得HVT重组病毒（rHVT-CMV-pmpD和rHVT-EF-1 α-pmpD）。Western-blotting和IFA分析表明二者均表达了PmpD-N蛋白,而且PmpD-N蛋白在rHVT-CMV-pmpD中的表达量是rHVT-EF-1α-pmpD的四倍。Confocal分析显示PmpD-N蛋白分布在细胞的胞核、胞浆和细胞表面。rHVT-CMV-pmpD的复制特性和野生型HVT一致,在体外进行连续传代到20代时仍能稳定表达PmpD-N蛋白,能够激活巨噬细胞。pmpD-N基因重组HVT免疫效力评价：采用8000PFU的rHVT-CMV-pmpD免疫1日龄SPF鸡,免疫后第8天腹腔攻毒马立克病毒强毒RB-1B,第36天喉头接种鹦鹉热衣原体CB7株,评价免疫保护效果。实时荧光定量PCR结果显示,rHVT-CMV-pmpD免疫鸡后在体内的增殖水平与野生型HVT无显着性差异。免疫后产生了针对PmpD-N的特异性抗体以及高水平淋巴刺激指数,CD4+细胞比例呈现显着性升高,诱导了高水平的Th1细胞免疫。攻毒超强毒马立克病毒后,免疫组鸡保护率100%,对照组鸡全部发病。攻毒鹦鹉热衣原体后,免疫组的病变指数显着性降低,喉头拭子排菌量和肺脏的细菌载量显着性下降。本研究构建的重组HVT活载体疫苗可以提供良好的免疫保护效果。综上所述,本研究建立的PmpD-N ELISA方法可以检测鹦鹉热衣原体的早期感染；建立的实时荧光定量PCR检测方法可以测定HVT的病毒含量；利用BAC技术成功构建表达PmpD-N的重组HVT活载体疫苗可以作为预防马立克病毒和鹦鹉热衣原体的候选疫苗。
龚振华,张康,王丽萍,郭光礼,李金平,于建敏,李蕾,侯广宇,王建琳,单虎[8]（2015）在《超强马立克病病毒株的致病性研究》文中研究指明拟对一株超强马立克病病毒（MDV）SD2012-1株的致病性进行研究。将60只SPF鸡平均分成未免组、HVT免疫组和CVI988疫苗免疫组3组。于1日龄时对其进行马立克病（MD）疫苗免疫,于10日龄时进行SD2012-1攻毒;每天观察攻毒鸡临床症状,对病死鸡进行病理剖检和组织学观察;用PCR反应对感染鸡进行MDV跟踪监测。病理学研究结果显示:攻毒后第2周,试验鸡有轻微组织病变;攻毒后第6周,试验鸡有眼观病变,镜检有散在的肿瘤细胞团块;攻毒后第9周,试验鸡有明显的眼观肿瘤病变,镜检有大量肿瘤细胞聚集;SD2012-1可以突破CVI988疫苗免疫,引起高达30%的鸡发病。PCR跟踪监测结果显示:攻毒后第5天,未免组和HVT免疫组可检出MDV;攻毒后第10天,未免组和HVT免疫组阳性检出率均为100%,CVI988免疫组阳性检出率为30%;攻毒后第20天,3组试验鸡阳性检出率均为100%;用PCR检测病死鸡的肝、肾、肌胃、肠系膜、十二指肠、心和法氏囊样品的结果均为MDV阳性;攻毒300d后,健康存活鸡的羽髓PCR检测结果均为MDV阳性。结果表明,HVT疫苗对于SD2012-1株几乎无保护作用,超强马立克病病毒SD2012-1株能够长期在免疫鸡体内存在,突破免疫保护,引起发病,这对国内防控鸡马立克病提出了严峻挑战。
周鑫[9]（2015）在《马立克氏病meq基因转染CEF后部分微卫星不稳定性和错配修复基因的研究》文中研究表明鸡马立克氏病（Marek’s Disease,MD）是一种由血清型Ⅰ型马立克氏病毒（Marek’s Disease Virus,MDV）引起的T淋巴细胞肿瘤性疾病,具有高度的传染性。MDV是唯一已知能急性转化的α疱疹病毒。MDV不仅可引起患鸡内脏T细胞淋巴瘤、瘫痪、失明和神经功能障碍,而且还可以引起较强的免疫抑制。微卫星（Microsatellite,MS）是一个位点特异的DNA序列,它们的核苷酸序列较短（重复单元为1-6个碱基对）,核苷酸序列串联重复10-60次,其侧翼为独特的序列。在生物体基因组中,微卫星是有高丰度的特异性DNA标记。微卫星不稳定性（Microsatellite Instability,MSI）是由于复制错误（replication error,RER）引起的微卫星等位基因的增加或丢失,造成微卫星DNA长度发生改变,表现为（CA）n双核苷酸电泳迁移率的改变,出现与正常基因长度不同的等位基因条带。错配修复基因（Mismatch Repair,MMR）是切除修复未成对或错配的碱基并通过替换正确的DNA碱基对的一组基因。本试验对马立克氏病meq基因转染鸡胚成纤维细胞（CEF）后部分微卫星不稳定性和错配修复基因表达情况进行研究。研究目的是为马立克氏病meq基因的致瘤机制提供线索,试验分为以下三部分。第一部分是pVAX-1-meq真核表达载体的构建和在鸡胚成纤维细胞中表达验证。采用TA克隆将MEQ基因片段连接pMD 19-T Vector构建出pMD 19-T-meq质粒,pMD19-T-meq质粒和pVAX-1真核表达质粒采用EcorR I、Xho I限制性内切酶双酶切,将meq基因ORF克隆至pVAX-1质粒中,构建pVAX-1-meq真核表达质粒。转化DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆采用pVAX-1质粒通用引物T7 primer和BGH reverse primer进行PCR验证和EcorR I、Xho I限制性内切酶双酶切验证。将pVAX-1-meq真核表达质粒用转染试剂转染至鸡胚成纤维细胞,并分别在转染后的24 h、48 h、72 h提取贴壁细胞总RNA,反转录成cDNA,根据meq基因mRNA设计引物MEQ mRNA F/R,以β-actin作为内参进行real-time PCR反应,检测出meq基因mRNA成功在细胞内表达。比较正常细胞和转染meq基因的细胞增殖,细胞凋亡,细胞周期的指标。转染meq基因后细胞凋亡率并未明显改变,细胞周期失控,G2期和S期阻滞,DNA复制过程受阻,MTT法检测发现细胞活性降低,说明转染MEQ基因至CEF细胞后并未使得CEF细胞发生转化,但会引起CEF的DNA合成受阻。试验第二部分是把构建好的pVAX-1-meq真核表达质粒用转染试剂转染至鸡胚成纤维细胞,同时设置空载体对照组、脂质体对照组和空白对照组,并分别在转染后的24h、48h、72h提取贴壁细胞总DNA;选取本实验室前期初步筛选的马立克氏病肿瘤中变化频率较高的微卫星标记,以此微卫星位点设计了 46对引物,以提取的DNA进行PCR扩增,采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测微卫星不稳定性,根据银染后的结果来看,并未发现实验组与对照组有明显的微卫星条带差异。试验第三部分是把构建好的pVAX-1-meq真核表达质粒用转染试剂转染至鸡胚成纤维细胞,同时设置空载体对照组、脂质体对照组和空白对照组,并分别在转染后的24h、48h、72h以β-actin作为内参进行real-time PCR反应,检测错配修复相关基因MLH1,MSH2和PMS1的mRNA表达情况,结果发现转染meq基因后24h,错配修复基因MLH1,MSH2和PMS1的相对表达量较各个对照组均有不同程度升高,而转染meq基因后48h、72h错配修复基因MLH1,MSH2和PMS1的相对表达量又低于对照组。这表明转染meq基因后24h错配修复系统开始发挥其功能,而在转染meq基因后48h和72h错配修复系统功能开始减弱或消失,这说明meq基因参与了错配修复相关基因的表达调控。
苏帅[10]（2013）在《重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究》文中研究表明马立克氏病毒（Marek′s disease virus, MDV）是α疱疹病毒的成员，基因组为180kb左右的双股DNA，可引起鸡的淋巴细胞瘤。GX0101株MDV是国内外从鸡体内分离到的第一株整合有网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus, REV）长末端重复序列（Long terminal repeat, LTR）的重组野毒株。本实验室前期研究中已经构建了GX0101的细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome, BAC）克隆以及敲除REV-LTR的突变株GX0101LTR，证实REV-LTR插入片段显着增强了GX0101的横向传播能力。敲除肿瘤基因meq的突变株GX0101meq病毒不但丧失对SPF鸡的致病性，而且不再引起肿瘤以及胸腺和法氏囊萎缩。本学位论文在上述研究的基础上，进一步构建不同的突变株，并以此深入研究MDV相关的生物学活性和研发MDV的基因缺失疫苗。1完成了GX0101株MDV的全基因组序列分析自然重组病毒GX0101在致病性、免疫原性、横向传播能力等方面具有独特的生物学活性。为了对GX0101进一步的分子病毒学研究，本研究利用GX0101的BAC克隆结合高通量测序技术完成了对其全基因组的序列分析。GX0101全基因组长178101bp,其基因组的TRL、UL、IRL、IRS、US和TRS区分别长12758bp、113572bp、12741bp、12700bp、11695bp、13134bp。GX0101全基因组仅含有一个REV-LTR重组片段，位于其基因组US区的SORF1中，SORF2基因前267bp碱基处。与rMd5不同，GX0101含有一个SORF2基因。通过与已发表的近10株MDV的比较,发现GX0101与英国分离株C12/130的两个不同毒力的感染性克隆pC12/130-10和pC12/130-15同源性最高。除了GX0101比其它毒株多出REV-LTR片段外，在经比较的190个开放阅读框（Open reading frame，ORF）中，不同毒株间发生不同程度变异的有77个。在这77个ORFs中， GX0101与pC12/130-10、pC12/130-15两个克隆呈100%同源的ORF分别有50个和47个，但与RB1B、Md5、GA、814和CVI988等毒株却只有7-27个ORFs呈现100%同源性。GX0101基因组TRS区的MDV97.3-97.6开放阅读框中，有5个连续的217bp碱基的重复，显着多于其它不同毒株的拷贝数。GX0101基因组的IRS区的86.2-86.4开放阅读框中，存在3个相同的217bp的重复序列，而其它MDV仅含有1-2拷贝的重复。GX0101的全基因组序列的比较分析，将有助于阐明与MDV致病性、传播性相关的基因，也有助于揭示不同地域间MDV的遗传变异和演化关系。2构建了meq基因缺失性疫苗候选株SC9-1，在SPF鸡实验中显示出比国内外最广泛应用的CVI988/Rispens有更好的保护性免疫力重组病毒GX0101meq表现出良好的保护性免疫作用，但基因组中带有卡纳霉素抗性基因，不符合农业转基因生物安全条例，因此不能作为疫苗使用。本研究设计的“对flp重组酶的部分诱导结合多重筛选”的方法，敲除掉GX0101meq中的卡那霉素抗性基因，筛选到具有良好复制能力的SC9-1（GX0101meq kana）株MDV。将SC9-1株MDV接种SPF鸡和含有MDV母源抗体的海兰褐蛋鸡，既没有致肿瘤性，也没有呈现免疫抑制、生长迟缓等任何致病性，而且能够为免疫鸡提供比CVI988/Rispens更好的保护性免疫。多次重复SC9-1株MDV对SPF鸡的免疫保护试验，以500PFU/只的剂量感染MDV超强毒rMd5，SC9-1均提供100%的免疫保护，显着高于CVI988/Rispens的免疫保护（保护率80-90%）。将SC9-1感染性克隆DNA通过肌肉注射1日龄SPF鸡，14天后能从鸡的体内分离到SC9-1病毒。为进一步探讨SC9-1的BAC质粒作为DNA疫苗提供思路。SC9-1株MDV基因缺失疫苗已获得农业部环境释放的审批书，并在3000只海兰褐蛋鸡完成了6个月的环境释放试验，并且持续观察6个月，不仅符合农业转基因生物安全，而且呈现很好的免疫保护效果，是一株理想的新型疫苗株，并且已经转让给北京翎羽生物科技有限公司进行后续相关的生产性试验。制备的中试产品证明SC9-1能提供比国内外最广泛应用的CVI988/Rispens株疫苗更好的保护性免疫力3对GX0101和GX0101LTR混合感染鸡群后连续病毒鉴别定量跟踪试验证明，REV-LTR插入片段使GX0101提高横向传播性，是其成为流行毒株的竞争性选择压优势为了模拟自然感染传播模式，比较并证实GX0101相对于其突变株GX0101LTR在鸡群横向传播上的竞争性选择压优势,本研究比较研究了能够对GX0101和GX0101LTR病毒基因组作鉴别性定量的双重荧光定量PCR的引物、探针和反应体系,并且成功的用于动态比较鸡群共感染以上两种病毒后在连续传代过程中不同病毒病毒血症。结果表明，将GX0101、GX0101LTR同等剂量感染SPF鸡后，第一代用于接触感染的空白SPF鸡在接触感染14天时即可检测到感染GX0101，而在接触感染28天时才能检测到感染GX0101LTR；而第二代用于接触感染的鸡在接触感染21、28天均能检测到感染GX0101，在28天时仅有一只鸡检测到GX0101LTR；同样第三代用于接触感染的鸡在与第二代鸡接触感染21、28天均能检测到感染GX0101，而没有检测到GX0101LTR。将GX0101显着低于GX0101LTR（100PFU/只的GX0101和2000PFU/只的GX0101LTR）的病毒共感染SPF鸡群，同一个隔离罩饲养进行接触感染传播。连续2次传代后，虽然在一部分接触感染病毒的鸡（6/10）中仍能够检出GX0101LTR，甚至在个别鸡仍为优势毒株，但是接触感染病毒的鸡全部能够检出带有REV-LTR的GX0101,并且部分鸡（4/10）仅能检出GX0101，不能检出GX0101LTR。以上结果证明了在鸡群内自然感染和传播过程中，带有REV-LTR的GX0101相对于敲除其REV-LTR的GX0101LTR株在横向传播性上显示出明显的竞争性选择压优势。这可以解释为什么在鸡群中发生率很低的MDV与REV间的基因重组产生的整合有REV-LTR的GX0101能从极低的比例演变为从鸡群中易于分离到的流行株的生物学机制。4敲除GX0101株SORF2基因的生物学活性比较表明SORF2基因表达产物与MDV不同株的横向传播性密切相关REV-LTR片段具有真核启动子和增强子活性，能够增强位于其插入位点后的MDV基因的表达。GX0101基因组中的REV-LTR片段位于SORF2基因上游,其对SORF2基因的转录表达都可能有很大影响，为了深入研究重组病毒GX0101的SORF2基因功能，本研究在感染性克隆GX0101-BAC的基础上构建了SORF2基因缺失株GX0101sorf2。试验结果表明SORF2基因并非MDV复制以及致肿瘤必需基因，敲除掉SORF2基因的GX0101sorf2在细胞培养与GX0101的复制能力相同。与GX0101相比，GX0101sorf2对鸡的致死率以及致肿瘤率下降，但是差异不显着。GX0101sorf2横向传播的感染率低于GX0101。GX0101中的REV-LTR片段插入增强SORF2蛋白的表达，表明GX0101具有较强的横向传播能力可能与SORF2蛋白的大量表达这一分子机制相关。5插入ALV-LTR的重组MDV的构建及其生物学活性的比较研究ALV与REV一样同属于禽反转录病毒，在我国鸡群中普遍存在MDV与ALV的共感染。为了研究ALV-LTR片段在GX0101基因组重组位点上的稳定性，以及ALV-LTR片段的插入对MDV生物学活性的影响，并以此为模型研究ALV与MDV的重组病毒。本研究利用基于链霉素负筛选系统的同源重组方法将ALV-J中国分离株NX0101的LTR片段完全等位取代bac-GX0101的REV-LTR片段，构建了含有ALV-LTR片段的重组病毒GX0101-ALV-LTR。GX0101-ALV-LTR在细胞培养上具有与GX0101相似的复制能力，在细胞上连续传代20代，通过PCR验证，ALV-LTR都能在GX0101-ALV-LTR的基因组中稳定存在。将GX0101-ALV-LTR接种1日龄SPF鸡，接种后6-8周，PCR验证ALV-LTR能在GX0101-ALV-LTR基因组中稳定存在。通过接触感染的病毒基因组中ALV-LTR依然能够稳定遗传。攻毒90天，GX0101-ALV-LTR的死亡率和肿瘤率分别为55%和20%。相比GX0101LTR，间接免疫荧光以及Western Blot试验显示，GX0101-ALV-LTR的SORF2蛋白表达量显着增加；Northern Blot试验显示GX0101-ALV-LTR的SORF2、US1、US10基因转录量显着增加。GX0101-ALV-LTR是国内外第一株整合进ALV来源LTR的重组MDV,证实整合进MDV同一位点的ALV-LTR片段能与插入的REV-LTR片段一样稳定遗传，并显示类似的生物学特性。6用基因芯片技术比较分析了LTR插入片段对重组MDV中不同基因表达水平的影响利用定制的Agilent表达谱芯片，分析比较了带有REV-LTR的GX0101及其LTR敲除株GX0101LTR和ALV-LTR替代株GX0101-ALV-LTR在感染CEF细胞上的病毒不同基因的表达水平。结果表明，在GX0101与GX0101LTR病毒差异表达显着的基因中（P<0.05），75个MDV基因GX0101的转录水平显着增高，其中上调倍数大于10倍的共14个基因，而位于REV-LTR片段直接下游的SORF2、US1、US10基因上调倍数多达30倍以上，其中SORF2基因上调最为显着，高达399倍；GX0101的UL38基因转录降低，下调倍数为8.3倍。GX0101-ALV-LTR与GX0101非常类似，与GX0101LTR相比，同样位于ALV-LTR片段直接下游的SORF2、US1、US10基因上调倍数多达30倍以上，SORF2基因上调最为显着；GX0101-ALV-LTR的UL38基因转录下调倍数为6.7倍。利用Northern Blot以及Western Blot试验证实了插入LTR片段的重组病毒SORF2的转录子及表达蛋白均显着升高。这些比较研究结果将有助于进一步分析LTR插入片段赋予重组MDV显着升高的横向传播性究竟与MDV的那些基因表达产物相关。7用基因芯片技术比较分析了LTR插入片段对重组MDV感染的细胞基因组不同基因转录水平的影响利用定制的Agilent表达谱芯片，分析比较了带有REV-LTR的GX0101及其LTR敲除株GX0101LTR和ALV-LTR替代株GX0101-ALV-LTR对感染的CEF细胞基因组不同基因的表达水平的影响。对鸡41765个基因的表达差异进行了分析，结果显示，感染GX0101的CEF细胞基因与感染GX0101LTR相比，转录显着增高的有12个基因（差异倍数大于20倍），其中ChEST1024a11（GeneBank NO. BU288902.1）、SKOR2（GeneBank NO. XM001233569.2）上调倍数分别为190倍、165倍；转录显着降低的基因有4个基因（差异倍数大于20倍），其中ChEST445i1（GeneBank NO. CR390488.1）下调倍数为105倍。感染GX0101-ALV-LTR的CEF细胞基因与感染GX0101LTR相比，转录显着增高的有5个基因（差异倍数大于20倍），其中ChEST1024a11（GeneBank NO. BU288902.1）、SKOR2（GeneBank NO. XM001233569.2）上调倍数分别为203倍、83倍；转录水平下降基因的下调倍数均小于20倍。通过基因芯片表达谱筛选出的显着差异基因有助于进一步研究插入LTR片段的重组MDV病毒不同的生物学活性与宿主基因转录水平的相关性。本研究不仅进一步通过模拟自然感染模式证明REV-LTR插入片段显着提高了病毒GX0101在鸡群中的横向传播性，是其从极少数的突变株变为流行株的流行病学机制，也部分阐明了REV-LTR提高GX0101横向传播性的分子机制。还利用BAC克隆技术将GX0101改造成了一株保护免疫力优于CVI988/Rispens的新的疫苗候选株。
二、鸡马立克氏病CV1988/Rispens冷冻活疫苗和HVT冻干苗效力比较试验（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡马立克氏病CV1988/Rispens冷冻活疫苗和HVT冻干苗效力比较试验（论文提纲范文）
（1）表达基因Ⅶ型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株构建及其免疫效力试验（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 NDV的病原学 |
| 1.1 NDV的分类与形态结构 |
| 1.2 NDV的理化特性 |
| 1.3 NDV的增殖特性 |
| 1.4 NDV的生物学活性 |
| 1.4.1 血凝活性 |
| 1.4.2 神经氨酸酶活性 |
| 1.4.3 细胞融合与溶血活性 |
| 1.4.4 抗肿瘤的作用 |
| 1.5 NDV的致病性 |
| 2 F蛋白的结构及功能 |
| 3 NDV疫苗的研究进展 |
| 3.1 活疫苗 |
| 3.2 灭活疫苗 |
| 3.3 基因工程疫苗 |
| 3.3.1 亚单位疫苗 |
| 3.3.2 重组活载体疫苗 |
| 4 新城疫的流行病学 |
| 第二章 表达基因Ⅶ型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株构建及其免疫效力试验 |
| 1 材料 |
| 1.1 载体和菌株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组病毒rHVT-EGFP的纯化 |
| 2.1.1 rHVT-EGFP重组病毒的构建 |
| 2.1.2 重组病毒rHVT-EGFP的纯化与扩大培养 |
| 2.1.3 重组病毒rHVT-EGFP的基因组的提取 |
| 2.1.4 重组病毒rHVT-EGFP的转染 |
| 2.2 新城疫病毒株(DT-2014)F基因的克隆与鉴定 |
| 2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2 病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 RT-PCR扩增NDV F基因 |
| 2.2.4 中间质粒pM3-F的构建 |
| 2.3 转移载体pCR2.1-US2-F和pCR-US2-AF的构建 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 F基因表达盒的PCR扩增 |
| 2.3.3 中间质粒pCM V-F的构建 |
| 2.3.4 转移载体pCR-US2-F的构建 |
| 2.3.5 转移载体pCR-US2-△F的构建 |
| 2.4 转移载体pCR2.1-US2-F和pCR2.1-US2-AF的鉴定 |
| 2.4.1 酶切鉴定 |
| 2.4.2 Western-blot试验鉴定 |
| 2.4.3 间接免疫荧光试验(IFA)鉴定 |
| 2.5 重组病毒rHVT-NDV-VII-F和rHVT-NDV-VII-AF的拯救与纯化 |
| 2.5.1 转移载体的线性化 |
| 2.5.2 重组病毒rHVT-EGFP的提取 |
| 2.5.3 重组病毒的拯救 |
| 2.6 重组病毒rHVT-NDV-VII-F和rHVT-NDV-VII-AF的鉴定 |
| 2.6.1 PCR鉴定重组病毒 |
| 2.6.2 间接免疫荧光试验(IFA)鉴定重组病毒F蛋白表达 |
| 2.6.3 Western-blot试验鉴定重组病毒F蛋白的表达 |
| 2.6.4 重组病毒的效价测定试验 |
| 2.6.5 重组病毒在CEF上的生长特性 |
| 2.7 重组病毒针对NDV的免疫保护评价 |
| 2.7.1 重组病毒的免疫保护试验 |
| 2.7.2 排毒检测 |
| 2.7.3 不同试验组在攻毒后的生存曲线 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组病毒rHVT-EGFP的纯化 |
| 3.2 真核表达载体pCR2.1-US2-F的构建 |
| 3.2.1 F基因的克隆鉴定 |
| 3.2.2 F基因表达盒的扩增 |
| 3.2.3 转移载体的酶切鉴定 |
| 3.2.4 转移载体Western-blot试验鉴定 |
| 3.2.5 转移载体间接免疫荧光(IFA)试验鉴定 |
| 3.3 重组病毒rHVT-NDV-VII-F和rHVT-NDV-VII-AF的拯救与鉴定 |
| 3.3.1 重组病毒的拯救 |
| 3.3.2 PCR鉴定重组病毒的F基因 |
| 3.3.3 PCR鉴定重组病毒F基因的表达盒 |
| 3.3.4 IFA试验鉴定重组病毒F蛋白的表达 |
| 3.3.5 Western-blot鉴定重组病毒F蛋白的表达 |
| 3.3.6 重组病毒的效价 |
| 3.3.7 重组病毒的生长曲线 |
| 3.4 重组病毒对NDV强毒的免疫保护试验 |
| 3.4.1 绝对荧光定量PCR检测排毒 |
| 3.4.2 不同试验组在攻毒后的生存曲线和保护率 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）利用CRISPR/Cas9技术构建表达EGFP的两株重组火鸡疱疹病毒rHVT-US2/US10-EGFP（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 马立克氏病病毒与火鸡疱疹病毒的概述 |
| 1.1.1 马立克氏病病毒与火鸡疱疹病毒基因组结构及形态 |
| 1.1.2 马立克氏病病毒与火鸡疱疹病毒的复制 |
| 1.2 疫苗的概述 |
| 1.3 火鸡疱疹病毒作为病毒载体的优点 |
| 1.4 火鸡疱疹病毒作为活病毒载体的条件 |
| 1.4.1 构建外源基因表达盒 |
| 1.4.2 复制非必需区的选择 |
| 1.4.3 启动子的选择 |
| 1.4.4 重组火鸡疱疹病毒的研究进展 |
| 1.5 同源重组技术 |
| 1.5.1 同源重组技术的概况 |
| 1.5.2 同源重组技术的发展历史 |
| 1.6 CRISPR系统的介绍 |
| 1.6.1 CRISPR系统的结构 |
| 1.6.2 CRISPR系统的类型 |
| 1.6.3 CRISPR/Cas9编辑技术的介绍 |
| 1.6.4 CRISPR/Cas9系统的应用 |
| 1.7 本试验研究目的意义 |
| 2 表达EGFP的重组火鸡疱疹病毒rHVT-US2-EGFP的拯救与鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与质粒 |
| 2.1.2 细胞与鸡胚 |
| 2.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 设计引物 |
| 2.2.2 px330-gRNA质粒的构建 |
| 2.2.2.1 gRNA双链退火 |
| 2.2.2.2 px330质粒的BbsⅠ单一酶切 |
| 2.2.2.3 酶切产物与双链退火引物快速链接 |
| 2.2.2.4 转化与菌液鉴定 |
| 2.2.2.5 阳性质粒的大量抽提 |
| 2.2.3 重组质粒pUC19-US2A-EGFP-US2B的构建 |
| 2.2.3.1 含US2基因左右臂的重组质粒的构建 |
| 2.2.3.2 鸡胚成纤维细胞(CEF)制备步骤 |
| 2.2.3.3 火鸡疱疹病毒细胞毒的冻存与复苏 |
| 2.2.3.4 火鸡疱疹病毒的增殖 |
| 2.2.3.5 火鸡疱疹病毒的DNA的提取 |
| 2.2.3.6 US2基因左右臂的扩增 |
| 2.2.3.7 目的片段的纯化 |
| 2.2.3.8 目的片段与pSIMPLE19EcoRV/BAPVector载体的连接 |
| 2.2.3.9 连接产物的转化及鉴定 |
| 2.2.3.10 阳性质粒小量提取及测序 |
| 2.2.3.11 US2基因左右同源臂的扩增 |
| 2.2.3.12 pUC19-EGFP表达载体质粒的线性化 |
| 2.2.3.13 pUC19-EGFP质粒双酶切产物的纯化 |
| 2.2.3.14 载体与目的片段进行同源重组 |
| 2.2.3.15 转化及重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.2.3.16 线性化同源重组臂 |
| 2.2.4 共转染 |
| 2.2.4.1 次代鸡胚成纤维细胞中脂质体法转染 |
| 2.2.4.2 人肾上皮细胞中脂质体法转染 |
| 2.2.4.3 电转染法 |
| 2.2.4.4 转染条件的优化 |
| 2.2.4.5 重组病毒rHVT-US2-EGFP的筛选 |
| 2.2.4.6 US2重组病毒的鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 px330质粒BbsⅠ酶切电泳结果 |
| 2.3.2 px330-gRNA菌液鉴定结果 |
| 2.3.3 US2左右臂菌液鉴定结果 |
| 2.3.4 pUC19-EGFP质粒双酶切实验结果 |
| 2.3.5 US2基因的左右同源臂扩增电泳结果 |
| 2.3.6 线性化重组质粒pUC19-US2A-EGFP-US2B的PCR扩增电泳结果 |
| 2.3.7 电压的优化 |
| 2.3.8 细胞量的优化实验结果 |
| 2.3.9 质粒转染量的优化实验结果 |
| 2.3.10 US2重组病毒的拯救及蚀斑纯化结果 |
| 2.3.11 US2重组病毒的鉴定结果 |
| 3 表达EGFP的两株重组火鸡疱疹病毒rHVT-US10-EGFP的拯救与鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 设计引物 |
| 3.2.2 px330-gRNA质粒的构建 |
| 3.2.2.1 gRNA双链退火 |
| 3.2.2.2 px330质粒的BbsⅠ单一酶切 |
| 3.2.2.3 酶切产物与双链退火引物快速连接 |
| 3.2.2.4 转化与菌液鉴定 |
| 3.2.2.5 阳性质粒的大量抽提 |
| 3.2.3 重组质粒pUC19-US10A-EGFP-US10B的构建 |
| 3.2.3.1 US10基因左右臂的扩增 |
| 3.2.3.2 US10基因左右同源臂的扩增 |
| 3.2.3.3 载体与目的片段进行同源重组 |
| 3.2.3.4 转化及重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.2.3.5 线性化同源重组臂 |
| 3.2.4 电转染 |
| 3.2.5 重组病毒rHVT-US10-EGFP的筛选 |
| 3.2.6 US10重组病毒的鉴定 |
| 3.2.7 结果 |
| 3.2.7.1 px330-gRNA菌液鉴定结果 |
| 3.2.7.2 US10左右同源臂菌液鉴定结果 |
| 3.2.7.3 US10左右同源臂扩增电泳图结果 |
| 3.2.7.4 线性化重组质粒pUC19-US10A-EGFP-US10B的PCR扩增电泳结果 |
| 3.2.7.5 US10重组病毒的拯救与蚀斑纯化结果 |
| 3.2.7.6 US10重组病毒的鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡马立克病(MD)的研究进展 |
| 1.1.1 MDV分类及病原学特点 |
| 1.1.2 MDV的基因组结构 |
| 1.1.3 MDV特有基因 |
| 1.1.4 MDV的发病机理 |
| 1.1.4.1 早期溶细胞感染 |
| 1.1.4.2 潜伏感染 |
| 1.1.4.3 第二次溶细胞感染 |
| 1.1.4.4 肿瘤细胞增生期 |
| 1.1.5 MDV的免疫抑制 |
| 1.1.6 流行病学 |
| 1.1.7 临床症状及病理变化 |
| 1.1.8 诊断技术 |
| 1.1.8.1 常规诊断 |
| 1.1.8.2 病毒分离与鉴定 |
| 1.1.8.3 聚合酶链反应技术(PCR) |
| 1.1.8.4 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.1.9 MD疫苗的研究进展 |
| 1.1.9.1 疫苗的免疫机理 |
| 1.1.9.2 疫苗的种类 |
| 1.2 禽白血病(AL)的研究进展 |
| 1.2.1 病原学特点 |
| 1.2.2 流行病学特征 |
| 1.2.3 免疫抑制机制与致病性 |
| 1.3 MDV与ALV混合感染 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.4.1 先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响 |
| 1.4.2 不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 疫苗与质粒 |
| 2.1.3 主要试剂与仪器 |
| 2.1.4 其他试剂的配制 |
| 2.1.5 试验动物与SPF饲养设施 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备 |
| 2.2.2 MDV的增殖与定量 |
| 2.2.3 ALV的增殖与定量 |
| 2.2.4 先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响 |
| 2.2.4.1 试验设计 |
| 2.2.4.2 鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
| 2.2.4.3 体重和免疫器官指数的测定 |
| 2.2.4.4 AIV-H9和NDV灭活疫苗的免疫和抗体水平的测定 |
| 2.2.4.5 外周血淋巴细胞DNA的提取 |
| 2.2.4.6 GX0101的增殖动态 |
| 2.2.4.7 病理学检测 |
| 2.2.4.8 统计学分析 |
| 2.2.5 不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立 |
| 2.2.5.1 PCR引物的设计与合成 |
| 2.2.5.2 疫苗DNA的提取 |
| 2.2.5.3 PCR扩增体系及条件优化 |
| 2.2.5.4 地高辛标记DNA探针的制备 |
| 2.2.5.5 核酸斑点杂交检测 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响 |
| 3.1.1 MDV毒株GX0101以及ALV-J毒株NX0101含量测定结果 |
| 3.1.2 SPF鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
| 3.1.3 SPF鸡各组体重 |
| 3.1.4 SPF鸡AIV-H9疫苗免疫后抗体水平测定 |
| 3.1.5 SPF鸡NDV疫苗免疫后抗体水平测定 |
| 3.1.6 SPF鸡中枢免疫器官指数 |
| 3.1.7 SPF鸡GX0101病毒增殖动态 |
| 3.2 不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立 |
| 3.2.1 PCR方法对MDVmeq基因缺失疫苗SC9-1与商品化疫苗的鉴别结果 |
| 3.2.2 核酸斑点杂交方法对MDVmeq基因缺失疫苗SC9-1与商品化疫苗的鉴别结果. |
| 3.2.2.1 探针标记结果 |
| 3.2.2.2 核酸斑点杂交结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响 |
| 4.2 不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）表达REV env基因的重组马立克病毒的构建及生物学活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 RE的研究进展 |
| 1.1.1 RE的流行病学调查 |
| 1.1.2 REV的分子生物学特性 |
| 1.1.3 RE的实验室诊断 |
| 1.1.4 RE的预防与治疗 |
| 1.2 MD的研究进展 |
| 1.2.1 马立克氏病的流行病学调查 |
| 1.2.2 MDV病毒的分子生物学特性 |
| 1.2.3 MD的实验室诊断 |
| 1.2.4 MD的预防与治疗 |
| 1.2.5 REV对马立克疫苗效果的影响 |
| 1.2.6 新型独立自主知识产权的马立克基因缺失疫苗 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常规分子克隆试剂 |
| 2.1.2 SPF鸡 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 相关试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 env基因的扩增与纯化(基因扩增产物的回收与纯化) |
| 2.2.2 回收env基因PCR产物 |
| 2.2.3 PCR产物与真核表达载体的酶切与连接 |
| 2.2.4 提取重组质粒进行酶切鉴定 |
| 2.2.5 重组质粒转染CEF细胞 |
| 2.2.6 IFA鉴定 |
| 2.2.7 带有kana基因的pUC载体的构建 |
| 2.2.8 基因表达盒与表达载体连接 |
| 2.2.9 重组载体的回收(质粒DNA的回收) |
| 2.2.10 质粒转染 |
| 2.2.11 IFA鉴定 |
| 2.2.12 带有Meq两侧同源臂的env表达盒以及kana抗性基因的扩增与纯化 |
| 2.2.13 将REV env基因表达盒以及kana抗性基因插入MDV SC9-1基因组meq基因位点 |
| 2.2.14 插入meq位点重组病毒的拯救及生物学特性的研究 |
| 2.2.15 表达REV env、gp90蛋白的MDV meq位点重组病毒的构建、拯救及鉴定 |
| 2.2.16 带有不同启动子真核表达载体的构建 |
| 3 结果 |
| 3.1 表达REV env的重组MDV病毒的构建、拯救、鉴定及生物活性比较 |
| 3.1.1 env的扩增与回收 |
| 3.1.2 将env基因、gp90基因与真核表达载体连接及鉴定 |
| 3.1.3 扩增带有gp90基因的表达盒 |
| 3.1.4 重组MDV SC9-env在CEF细胞的复制水平 |
| 3.1.5 重组病毒SC9-env对SPF鸡的致病性 |
| 3.1.6 重组病毒SC9-env对SPF鸡感染vv MDV rMd5的免疫保护效果 |
| 3.2 表达REV env、gp90蛋白的MDV meq位点重组病毒的构建、拯救及鉴定结果 |
| 3.2.1 gp90基因的扩增与回收 |
| 3.2.2 将gp90基因与真核表达载体连接及鉴定 |
| 3.2.3 插入US10位点的重组病毒的拯救与鉴定 |
| 3.2.4 相对RT-PCR荧光定量方法比较不同插入位点重组病毒转录REV gp90RNA的水平 |
| 3.2.5 ELISA方法比较携带不同目的基因重组病毒表达蛋白的水平 |
| 3.3 不同启动子体外表达env蛋白的水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 马立克氏病病毒的概述 |
| 1.1.1 马立克氏病病毒的生物学特性 |
| 1.1.2 马立克氏病病毒的形态学特征和病原学特征 |
| 1.1.3 火鸡疱疹病毒的应用 |
| 1.2 马立克氏病疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 免疫机理 |
| 1.2.2 常规疫苗 |
| 1.2.3 基因工程疫苗 |
| 1.2.4 抗病育种 |
| 1.3 细菌人工染色体技术 |
| 1.3.1 BAC载体简述 |
| 1.3.2 BAC分子克隆化病毒 |
| 1.3.3 BAC载体修饰技术 |
| 1.4 MDV细菌人工染色体研究概述 |
| 1.4.1 MDV BAC的构建 |
| 1.4.2 MDV BAC构建原则 |
| 1.4.3 ccdB反向筛选在RED/ET重组中的应用 |
| 1.4.4 利用ccdB反向筛选BAC的一般策略 |
| 1.4.5 ccdB反向筛选系统的优越性 |
| 1.5 禽流感病毒的概述 |
| 1.5.1 禽流感病毒的结构与分类 |
| 1.5.2 禽流感病毒的诊断与防控 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌种,质粒载体和毒株,细胞系 |
| 2.2 主要试剂与药品 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 2.5 方法 |
| 2.5.1 重组火鸡疱疹病毒转移载体的构建 |
| 2.5.1.1 引物设计与合成 |
| 2.5.1.2 HVT感染细胞总DNA的提取 |
| 2.5.1.3 PCR扩增同源臂及加压筛选标记基因 |
| 2.5.1.4 同源臂及加压筛选标记基因的回收 |
| 2.5.1.5 PCR纯化产物与pMD18-T载体的连接 |
| 2.5.1.6 连接产物转化感受态细胞 |
| 2.5.1.7 阳性菌落的筛选与PCR鉴定 |
| 2.5.1.8 BAC载体基本功能基因片段的制备 |
| 2.5.1.9 重组病毒转移载体pGNP-gpt-BAC11的构建 |
| 2.5.2 火鸡疱疹病毒细菌人工染色体的构建 |
| 2.5.2.1 DH10B电转化感受态细胞的制备 |
| 2.5.2.2 将pGAB-gpt-BAC 11电转化感受态细胞DH10B |
| 2.5.2.3 无内毒素质粒pGAB-gpt-BAC11的提取和纯化 |
| 2.5.2.4 共转染用HVT病毒DNA的制备 |
| 2.5.2.5 次代CEF的制备 |
| 2.5.2.6 脂质体-DNA沉淀物的制备 |
| 2.5.2.7 共转染 |
| 2.5.2.8 同源重组病毒的筛选与纯化 |
| 2.5.3 感染性BAC分子克隆化病毒的筛选 |
| 2.5.3.1 DH10B电转化感受态细胞的制备 |
| 2.5.3.2 环化的重组病毒基因组DNA的提取 |
| 2.5.3.3 电转化筛选BAC分子克隆化病毒 |
| 2.5.3.4 BAC转化子的初步鉴定 |
| 2.5.3.5 BAC分子克隆化病毒DNA的提取和纯化 |
| 2.5.3.6 BAC DNA的限制性内切酶酶切图谱分析 |
| 2.5.3.7 BAC分子克隆化病毒的PCR鉴定 |
| 2.5.3.8 重组病毒的拯救 |
| 2.5.4 表达H9N2 AIV HA基因的重组HVT的构建 |
| 2.5.4.1 RED/ET重组所用引物和基因扩增 |
| 2.5.4.2 真核表达质粒pcDNA- HA的构建 |
| 2.5.4.3 RT-PCT鉴定HA基因的表达 |
| 2.5.4.4 HA基因表达盒的生物学活性检测 |
| 2.5.4.5 HA基因表达盒的扩增 |
| 2.5.4.6 选择标记基因ccdB-amp表达盒的扩增 |
| 2.5.4.7 利用RED/ET重组将选择标记基因ccdB-amp表达盒替换HVT US2区 |
| 2.5.4.8 利用RED/ET重组将HA基因表达盒替换HVT US2区 |
| 2.5.4.9 重组病毒的拯救 |
| 2.5.4.10 重组病毒生物学活性的检测 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 同源臂及筛选标记基因的PCR扩增 |
| 3.2 BAC功能基因的线性化 |
| 3.3 重组病毒转移载体PGAB-GPT-BAC 11的构建 |
| 3.4 HVT DNA与转移载体共转染启动病毒感染 |
| 3.5 HVT BAC亘组病毒的加压筛选与鉴定 |
| 3.6 重组子的电转筛选 |
| 3.7 HVT BAC的内切酶设计与酶切鉴定 |
| 3.8 HVT BAC重组病毒的拯救 |
| 3.9 H9N2亚型禽流感病毒HA基因的扩增 |
| 3.10 真核表达质粒PCDNA-HA的鉴定 |
| 3.11 RT-PCT鉴定HA基因的表达 |
| 3.12 HA基因表达盒的生物学活性检测 |
| 3.13 RED/ET重组所用基因表达盒的扩增 |
| 3.14 第一轮重组质粒酶切鉴定 |
| 3.15 第一轮重组质粒CCDB功能鉴定 |
| 3.16 第二轮重组质粒酶切鉴定 |
| 3.17 RHVT-HA重组病毒的生物学活性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组病毒转移载体的构建 |
| 4.2 重组病毒插入位点的选择 |
| 4.3 重组病毒筛选标记基因的选择 |
| 4.4 利用共转染构建细菌人工染色体重组火鸡疱疹病毒 |
| 4.4.1 电转化的优势 |
| 4.4.2 电转化感受态细胞制备的技巧 |
| 4.4.3 HVT感染细胞总DNA的提取 |
| 4.4.4 共转染的技术要点 |
| 4.5 适时提取重组病毒基因组 |
| 4.6 HVT BAC的酶切鉴定 |
| 4.7 RED/ET重组技术 |
| 4.7.1 RED/ET重组技术的优势 |
| 4.7.2 尝试使用rpsL反向筛选 |
| 4.7.3 利用ccdB作反向筛选标记基因 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（6）鸡传染性支气管炎H120株活疫苗耐热保护剂的工艺研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 1 传染性支气管炎病的发展 |
| 2 基因组特性 |
| 3 鸡传染性支气管炎疫苗的使用 |
| 4 国内外耐热保护剂的发展情况 |
| 5 耐热保护剂配方及各组分的作用 |
| 5.1 多聚蛋白胨 |
| 5.2 PVP |
| 5.3 海藻糖 |
| 5.4 氯化钠 |
| 5.5 维生素C |
| 6 疫苗冷冻真空干燥技术 |
| 6.1 共熔点的测定 |
| 6.2 产品预冻 |
| 6.3 升华干燥 |
| 6.4 解析干燥 |
| 参考文献 |
| 第一章 耐热保护剂及冻干曲线的筛选和优化 |
| 1 材料 |
| 1.1 IBV非生产用种毒 |
| 1.2 耐热保护剂原料 |
| 1.3 实验用10～11d SPF鸡胚 |
| 1.4 细菌检验用培养基 |
| 1.5 仪器 |
| 1.6 水分测试使用材料 |
| 1.7 pH 7.2的PBS缓冲液 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡传染性支气管炎H120株疫苗的制备 |
| 2.2 疫苗剩余水分测定方法 |
| 2.3 耐热保护剂的筛选及冻干曲线的调试 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 耐热保护剂的耐老化实验 |
| 1 材料 |
| 1.1 鸡胚 |
| 1.2 疫苗株 |
| 1.3 耐热保护剂 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 H120冻干疫苗的安全性和效力试验 |
| 1 材料及仪器 |
| 1.1 疫苗 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 攻毒用的毒种 |
| 1.4 实验场地 |
| 1.5 仪器及试剂 |
| 1.6 pH 6.5的HBS缓冲液 |
| 2 方法 |
| 2.1 安全性检验 |
| 2.2 免疫效力检验 |
| 2.3 接种后动物体内抗体消长规律 |
| 3 结果 |
| 3.1 安全性检验结果 |
| 3.2 免疫效力检验结果 |
| 3.3 抗体水平检测结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
（7）鹦鹉热衣原体pmpD-N基因重组HVT的构建及其免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 衣原体研究进展 |
| 1.2 HVT研究进展 |
| 1.3 细菌人工染色体研究进展 |
| 1.4 本课题研究目的和意义 |
| 1.5 研究内容和技术路线 |
| 第二章 鹦鹉热衣原体PmpD-N ELISA方法的建立及初步应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 火鸡疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 鹦鹉热衣原体pmpD-N基因重组HVT的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 鹦鹉热衣原体pmpD-N基因重组HVT免疫效力评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）超强马立克病病毒株的致病性研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 SPF鸡、MDV毒株和疫苗 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 免疫与攻毒试验 |
| 1.4 剖检与组织病理学观察 |
| 1.5 感染鸡的MDV跟踪监测 |
| 1.5.1 带毒活鸡的MDV检测 |
| 1.5.2 病死鸡的MDV检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 感染鸡的临床表现 |
| 2.2 病理变化 |
| 2.2.1 病死鸡的剖检变化 |
| 2.2.2 病理组织学观察 |
| 2.3 病毒的PCR跟踪监测 |
| 2.3.1 病毒的PCR检出率 |
| 2.3.2 存活鸡的带毒试验结果 |
| 2.3.3 病毒在感染鸡体内的分布 |
| 3 讨论 |
（9）马立克氏病meq基因转染CEF后部分微卫星不稳定性和错配修复基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 鸡马立克氏病综述 |
| 1 病原 |
| 2 发病机制 |
| 3 meq基因及致病机理 |
| 4 流行病学 |
| 5 临床症状 |
| 5.1 内脏型 |
| 5.2 神经型 |
| 5.3 眼型 |
| 5.4 皮肤型 |
| 6 组织病理学和病理变化 |
| 7 诊断 |
| 8 防控 |
| 参考文献 |
| 第二章 微卫星不稳定性和错配修复综述 |
| 1 微卫星 |
| 1.1 微卫星简介 |
| 1.2 微卫星的功能与特点 |
| 2 微卫星不稳定性 |
| 3 错配修复基因及其相关机制 |
| 4 错配修复基因与微卫星不稳定性的关系 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验研究 |
| 第三章 马立克氏病病毒meq基因真核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 meq克隆及测序 |
| 2.2 真核表达载体构建及鉴定 |
| 2.3 荧光定量结果 |
| 2.4 细胞凋亡结果 |
| 2.5 细胞周期结果 |
| 2.6 MTT法结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 meq基因转染CEF后部分微卫星不稳定性的探究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 聚丙烯酰胺电泳结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 马立克氏病meq基因转染CEF后错配修复基因的表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 实时荧光定量PCR |
| 2 结果 |
| 2.1 标准曲线 |
| 2.2 MLH1基因的mRNA平均相对表达量 |
| 2.3 MSH2基因的mRNA平均相对表达量 |
| 2.4 PMS1基因的mRNA平均相对表达量 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（10）重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究（论文提纲范文）
| 符号说明及缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 马立克氏病病毒（MDV）的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 病理生物学 |
| 1.1.4 诊断技术 |
| 1.2 MDV 分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 MDV 基因组结构 |
| 1.2.2 MDV 结构蛋白及相关基因 |
| 1.3 禽反转录病毒与 MDV 基因重组的研究进展 |
| 1.3.1 MDV 与 REV 间的基因重组 |
| 1.3.2 MDV 与 ALV 间的基因重组 |
| 1.3.3 REV 与 MDV 基因重组的机制 |
| 1.3.4 带有 REV-LTR 的重组 MDV 野毒株 GX0101 流行病学意义 |
| 1.4 BAC 技术和同源重组技术在 MDV 研究中的应用 |
| 1.4.1 细菌人工染色体载体系统(BAC) |
| 1.4.2 利用 BAC 构建 MDV 感染性克隆 |
| 1.4.3 基于 MDV BAC 感染性克隆的同源重组技术 |
| 1.5 基因芯片技术在 MDV 研究中的应用 |
| 1.5.1 基因芯片的简介 |
| 1.5.2 基因芯片的应用 |
| 1.6 MD 疫苗研究进展 |
| 1.6.1 常规致弱疫苗 |
| 1.6.2 新型基因工程疫苗 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常规分子克隆试剂 |
| 2.1.2 细胞培养相关试剂 |
| 2.1.3 荧光定量相关试剂 |
| 2.1.4 多克隆抗体制备相关试剂 |
| 2.1.5 Agilent 表达谱芯片相关试剂 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 相关疫苗及抗原 |
| 2.1.8 相关病毒及菌种 |
| 2.1.9 病毒增殖与鉴定相关试验材料 |
| 2.2 常规试验操作方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备 |
| 2.2.2 MDV 的拯救、鉴定 |
| 2.2.3 MDV 的增殖、定量 |
| 2.2.4 MDVBAC 质粒的大量制备及电转化 |
| 2.2.5 重组蛋白的纯化以及SDS-PAGE 蛋白质电泳 |
| 2.2.6 淋巴细胞的分离以及DNA 的提取 |
| 2.2.7 病毒RNA 的提取以及反转录 |
| 2.3 自然重组马立克氏病毒 GX0101 的全基因组序列的测定和比较分析 |
| 2.3.1 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 质粒的制备 |
| 2.3.2 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 的测序 |
| 2.3.3 GX0101 的全基因组分析 |
| 2.4 以 GX0101 构建 meq 基因缺失疫苗候选株及其安全性免疫保护效果的比较研究 |
| 2.4.1 利用同源重组技术构建 SC9-1(GX0101Δmeq kana)株 MDV |
| 2.4.2 利用同源重组技术构建SC9-2(GX0101 meq kana BAC)株MDV |
| 2.4.3 SC9-1、SC9-2 株MDV 的拯救、鉴定 |
| 2.4.4 SC9-1、SC9-2 株MDV 在细胞上的复制水平 |
| 2.4.5 SC9-1、SC9-2 株MDV 对SPF 鸡的安全性 |
| 2.4.6 SC9-1 株MDV 在鸡体内的增殖水平 |
| 2.4.7 SC9-1、SC9-2 株MDV 对SPF 鸡的免疫保护效果 |
| 2.4.8 SC9-1 株MDV 对海兰褐蛋鸡的免疫保护效果 |
| 2.4.9 SC9-1 株MDV 对SPF 鸡感染低剂量rMd5 的免疫保护效果 |
| 2.5 GX0101 在自然感染传播过程中竞争性选择压优势的模拟分析 |
| 2.5.1 用于区分MDVGX0101 和GX0101 LTR 的荧光定量PCR 探针设计 |
| 2.5.2 双重荧光定量PCR 探针标准曲线的制备 |
| 2.5.3 接种相同剂量GX0101 和GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 2.5.4 接种不同剂量GX0101 和GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 2.6 缺失 GX0101 SORF2 基因的重组病毒的构建及其生物学活性比较 |
| 2.6.1 鼠抗MDVSORF2 蛋白多克隆抗体制备 |
| 2.6.2 敲除SORF2 基因的重组病毒GX0101Δsorf2 的构建 |
| 2.6.3 间接免疫荧光试验鉴定重组病毒GX0101Δsorf238 |
| 2.6.4 Western blot 对重组病毒GX0101Δsorf2 以及SORF2 蛋白特异性鉴定 |
| 2.6.5 GX0101Δsorf2 在CEF 细胞上的复制能力的检测 |
| 2.6.6 GX0101Δsorf2 的致病性试验 |
| 2.6.7 GX0101Δsorf2 在鸡体内的的病毒血症的检测 |
| 2.6.8 GX0101Δsorf2 对SPF 鸡体液免疫应答的影响 |
| 2.6.9 GX0101Δsorf2 和GX0101 横向传播能力比较 |
| 2.7 插入 ALV-LTR 的重组 MDV 的构建及其生物学活性的比较研究 |
| 2.7.1 插入ALV-LTR 片段的重组MDV 的构建 |
| 2.7.2 重组MDVGX0101-ALV-LTR 的拯救 |
| 2.7.3 GX0101-ALV-LTR 在细胞上的复制能力 |
| 2.7.4 间接免疫荧光鉴定GX0101-ALV-LTR SORF2 蛋白的表达 |
| 2.7.5 GX0101-ALV-LTR 在CEF 细胞培养的稳定性鉴定 |
| 2.7.6 GX0101-ALV-LTR 的致病性检测及鸡体内的稳定性鉴定 |
| 2.8 LTR 插入片段对重组病毒的病毒基因表达以及重组病毒对宿主基因表达的影响 |
| 2.8.1 不同CEF 细胞感染不同重组病毒的总RNA 提取 |
| 2.8.2 样品的RNA 的放大和荧光标记 |
| 2.8.3 Agilent 表达谱芯片杂交 |
| 2.8.4 Agilent 表达谱芯片扫描 |
| 2.8.5 Agilent 表达谱芯片结果的质控检测 |
| 2.8.6 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 的病毒基因差异表达的分析 |
| 2.8.7 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 对宿主基因表达的差异性分析 |
| 2.8.8 GX0101 重组REV-LTR 片段对其重组位点后的基因转录水平的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GX0101 的全基因组序列的测定和比较分析 |
| 3.1.1 GX0101 的基因组结构以及与其它不同株 MDV 的系统进化关系 |
| 3.1.2 从 GX0101 全基因组水平比较分析 REV-LTR 插入片段 |
| 3.1.3 相对其它毒株 GX0101 基因组中缺失的片段 |
| 3.1.4 相对其它毒株 GX0101 基因组中增加的片段 |
| 3.1.5 GX0101 基因组的开放阅读框和单核苷酸多态性 |
| 3.1.6 GX0101 与英国分离株 C12/130 感染性克隆的基因组差异比较 |
| 3.2 以 GX0101 构建 meq 基因缺失疫苗候选株及其安全性免疫保护效果的比较 |
| 3.2.1 SC9-1、SC9-2 疫苗候选株的构建和鉴定 |
| 3.2.2 SC9-1、SC9-2 株 MDV 拯救鉴定结果 |
| 3.2.3 SC9-1、SC9-2 株 MDV 在细胞上的复制能力 |
| 3.2.4 SC9-1 株 MDV 在鸡体内的增殖水平 |
| 3.2.5 SC9-1、SC9-2 株 MDV 对 SPF 鸡的安全性 |
| 3.2.6 SC9-1、SC9-2 株 MDV 对 SPF 鸡的免疫保护效果 |
| 3.2.7 SC9-1 株 MDV 对海兰褐蛋鸡的免疫保护效果 |
| 3.2.8 SC9-1 株 MDV 对 SPF 鸡感染低剂量 rMd5 的免疫保护效果 |
| 3.2.9 SC9-1 疫苗候选株中试产品与 CVI988/Rispens 疫苗的保护性免疫力 |
| 3.3 GX0101 在自然感染传播过程中竞争性选择压优势的模拟分析 |
| 3.3.1 区分 MDV GX0101 和 GX0101 LTR 的荧光定量 PCR 探针具有良好的特异性 |
| 3.3.2 双重荧光定量 PCR 探针标准曲线的制备 |
| 3.3.3 接种相同剂量 GX0101 和 GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 3.3.4 接种不同剂量 GX0101 和 GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 3.4 缺失 GX0101 SORF2 基因的重组病毒的构建及其生物学活性的研究 |
| 3.4.1 SORF2 融合目的蛋白的表达纯化及分析鉴定 |
| 3.4.2 间接免疫荧光(IFA)鉴定高效价多克隆抗体特异性 |
| 3.4.3 GX0101Δsorf2 的 PCR 鉴定结果 |
| 3.4.4 间接免疫荧光鉴定 GX0101Δsorf2 的结果 |
| 3.4.5 Western blot 对重组病毒 GX0101 sorf2 以及 SORF2 蛋白的特异性鉴定 |
| 3.4.6 GX0101Δsorf2 在 CEF 细胞上的复制能力 |
| 3.4.7 GX0101Δsorf2 与亲本病毒 bac-GX0101 在鸡体内的病毒血症比较 |
| 3.4.8 GX0101Δsorf2 对 SPF 鸡的致病性 |
| 3.4.9 GX0101Δsorf2 对鸡体体液免疫应答的影响 |
| 3.4.10 GX0101Δsorf2 对鸡体重的影响 |
| 3.4.11 GX0101Δsorf2 和 GX0101 横向传播能力的比较 |
| 3.5 插入 ALV-LTR 的重组 MDV 的构建及其生物学活性的比较 |
| 3.5.1 不同重组 BAC 克隆质粒的 PCR 鉴定 |
| 3.5.2 拯救的重组病毒 GX0101-ALV-LTR 在细胞培养上形成的病毒蚀斑 |
| 3.5.3 插入 ALV-LTR 片段对重组 MDV SORF2 基因的转录和表达影响 |
| 3.5.4 GX0101-ALV-LTR 在细胞上复制性能 |
| 3.5.5 GX0101-ALV-LTR 基因组中 ALV-LTR 片段稳定性的鉴定 |
| 3.5.6 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡体重的影响 |
| 3.5.7 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡抗体水平的影响 |
| 3.5.8 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡的致死率和致肿瘤率 |
| 3.6 LTR 插入片段对重组病毒的病毒基因表达以及重组病毒对宿主基因表达的影响 |
| 3.6.1 样品总 RNA 的提取和质检结果 |
| 3.6.2 Agilent 表达谱芯片结果的质控检测结果 |
| 3.6.3 Agilent 表达谱芯片扫描数据归一化结果 |
| 3.6.4 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 的病毒基因差异表达的分析结果 |
| 3.6.5 感染 GX0101、GX0101-ALV-LTR、GX0101 LTR 鸡的显着差异表达基因的分析结果 |
| 3.6.6 Northern blot 技术对重组病毒 SORF2、US1、US10 基因的鉴定结果 |
| 3.6.7 荧光定量 PCR 检测重组病毒 SORF2、US1、US10 基因表达结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
四、鸡马立克氏病CV1988/Rispens冷冻活疫苗和HVT冻干苗效力比较试验（论文参考文献）
- [1]表达基因Ⅶ型新城疫病毒融合蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株构建及其免疫效力试验[D]. 白雪雁. 扬州大学, 2019
- [2]利用CRISPR/Cas9技术构建表达EGFP的两株重组火鸡疱疹病毒rHVT-US2/US10-EGFP[D]. 白银荣. 内蒙古农业大学, 2018(12)
- [3]先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别[D]. 韩妮. 山东农业大学, 2018(09)
- [4]表达REV env基因的重组马立克病毒的构建及生物学活性研究[D]. 周忠文. 山东农业大学, 2018(08)
- [5]表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗的构建[D]. 申晓晨. 华南农业大学, 2017(08)
- [6]鸡传染性支气管炎H120株活疫苗耐热保护剂的工艺研究[D]. 陈健. 扬州大学, 2016(02)
- [7]鹦鹉热衣原体pmpD-N基因重组HVT的构建及其免疫效果评价[D]. 刘杉杉. 中国农业大学, 2016(08)
- [8]超强马立克病病毒株的致病性研究[J]. 龚振华,张康,王丽萍,郭光礼,李金平,于建敏,李蕾,侯广宇,王建琳,单虎. 畜牧兽医学报, 2015(07)
- [9]马立克氏病meq基因转染CEF后部分微卫星不稳定性和错配修复基因的研究[D]. 周鑫. 南京农业大学, 2015(06)
- [10]重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究[D]. 苏帅. 山东农业大学, 2013(05)