一、多重逆转录-聚合酶链反应方法半定量检测多药耐药基因mRNA表达（论文文献综述）
孙艳芹[1]（2016）在《长链非编码RNA HOTTIP作为ceRNA参与小细胞肺癌增殖和耐药的机制研究》文中进行了进一步梳理一、研究意义肺癌是一种发病率较高的恶性肿瘤,其病死率居各种恶性肿瘤之首,其中小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）约占15%。由于小细胞肺癌细胞倍增时间短、进展快,常伴内分泌异常或类癌综合征,早期即发生血行转移,故小细胞肺癌的治疗应以全身化疗为主,联合放疗和手术为主要治疗手段。虽然小细胞肺癌细胞早期对放化疗非常敏感,但多数患者在以顺铂为基础的联合治疗过程中迅速发生多药耐药（multidrug resistance,MDR）而导致治疗失败,其临床预后较差。因此,小细胞肺癌的抗药性已成为目前临床治疗中亟待解决的问题。非编码RNAs（non-coding RNAs,ncRNAs）是近年来在真核生物中发现的一类在人类基因组中约占90%的核酸序列,它们的转录本长度既有短至19-25个核苷酸的微RNAs（microRNAs,miRNAs）,又有长达200-100000个核苷酸的长链非编码 RNAs（long non-coding RNAs,lncRNAs）。非编码 RNAs 通过在转录及转录后水平调控蛋白编码基因的表达,广泛参与到细胞分化、胚胎发育、新陈代谢、免疫调控等重要生命过程,其突变和失调可以造成多种人类疾病的发生,甚至引起肿瘤发生与肿瘤耐药。有研究发现,lncRNA除了可以直接调控其近端基因的表达,那些含有miRNA效应元件的lncRNA还能够结合miRNA而降低游离的功能性的miRNA的表达,从而通过降低miRNA而间接促进了 miRNA靶基因的表达,这种“lncRNAs-miRNAs-靶基因”的调控模式称为竞争性内源性RNA（competing endogenous RNAs,ceRNAs）调控模式。该调控模式已被越来越多的研究证实为ncRNAs参与基因表达调控的重要形式,并丰富了 RNA-RNA相互作用网络。lncRNA HOTTIP（HOXA distal transcript antisense RNA）是一种长达 4665 bp、并不参与蛋白质编码的HOX家族成员,染色体循环将其带到HOXA基因附近,通过在HOXA基因5’端起始转录来协助激活邻近HOXA基因的表达。多项研究证实,HOTTIP可以通过激活HOXA13的表达参与多种肿瘤的发生发展甚至化疗抗药性的产生。本课题组前期研究发现,HOTTIP可能通过促进HOXA11和HOXA13的表达参与小细胞肺癌化疗抗药性的产生,但其作用机制尚不清楚。本课题组前期研究中利用lncRNA及miRNA芯片技术分析小细胞肺癌多药耐药模型H69AR相对其亲本细胞（化疗敏感细胞株）H69中lncRNAs及miRNAs差异表达的情况发现,以HOTTIP为代表的多个HOXA家族成员在耐药细胞株H69AR中的表达显着高于H69细胞（两倍以上的差异）,而以miR-574-5p为代表的37种miRNAs在耐药细胞株H69AR中的表达显着低于H69细胞,随后我们通过实时荧光定量 PCR（Real time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR）技术验证了上述芯片结果。进一步的研究表明,小细胞肺癌组织和H69AR细胞中HOTTIP呈相对高表达,而miR-574-5p相对低表达,提示HOTTIP可能与小细胞肺癌化疗抗药性的产生密切相关;结合患者临床病理资料,我们分析发现HOTTIP还可以作为患者疾病分期、生存时间预测的预后指标之一。我们接下来通过生物信息学网站microRNA seq（https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/lmputController?viewtype=Text&trans cripr=ENST00000421733&version=MB21E78v2&species=HomoSapiens&type=lnc.RNA）和 microRNA.org（http://www.microma.org/microrna/home.do）预测发现,miR-574-5p在HOTTIP和EZH1的启动子区均有结合位点,然后我们采用qRT-PCR和Western blot技术检测发现,miR-574-5p沉默后可以促进HOTTIP和EZH1的表达。因此,HOTTIP可能通过竞争性抑制miR-574-5p的表达参与小细胞肺癌耐药。本课题组前期在国家自然基金的资助下进行cDNA表达谱芯片检测已经发现,与 EMT 相关的主要标志物（E-cadherin,Snail,Twist,Vimentin,β-catenin）在小细胞肺癌多药耐药细胞株及其亲本细胞株中呈现差异表达,提示EMT可能与小细胞肺癌多药耐药密切相关。因此,HOTTIP是否通过介导EMT参与小细胞肺癌化疗抗药性的发生值得进一步研究。本课题组拟在前期研究基础上,采用分子生物学和细胞生物学技术,利用小细胞肺癌细胞株H69/H69AR和H446/H446DDP探讨HOTTIP参与小细胞肺癌耐药的分子机制（详见研究内容）。通过本项目的研究,将进一步丰富小细胞肺癌耐药的分子机制,为小细胞肺癌靶基因治疗提供新的靶点,为寻找小细胞肺癌耐药及预后的生物学标志物的研究提供依据,为解决临床棘手的小细胞肺癌耐药问题提供一种新策略。二、研究目的本研究中采用lncRNA芯片、miRNA芯片等高通量筛选技术,并辅以生物信息学软件和网站预测、经典分子生物学实验技术等手段,利用临床小细胞肺癌石蜡组织、小细胞肺癌多药耐药细胞模型H69AR和体内裸鼠成瘤模型等多个层面,探讨HOTTIP作为ceRNA诱导EMT参与小细胞肺癌发生发展及耐药机制的调节。通过本项目研究,进一步丰富小细胞肺癌发生及耐药的分子机制,为筛选小细胞肺癌耐药及预后的生物学标志物提供理论依据。三、材料与方法1.非编码RNA芯片课题组利用Arraystar公司的人类lncRNA芯片技术分析小细胞肺癌多药耐药细胞株（H69AR）与化疗敏感细胞株（H69）的lncRNA差异表达谱,并结合前期通过北京博奥生物芯片有限公司的miRNA芯片差异表达谱的结果,利用生物信息学技术寻找与小细胞肺癌耐药可能相关的非编码RNA分子。2.临床样本收集2008年1月至2015年1月在南方医科大学附属顺德第一人民医院接受治疗的115例小细胞肺癌石蜡包埋组织,标本来自活检组织及纤维支气管镜检查穿刺组织,经病理诊断为小细胞肺癌。本研究经南方医科大学附属顺德第一人民医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。3.细胞培养人小细胞肺癌化疗敏感细胞株NCI-H69、NCI-H446、NCI-H146和多药耐药细胞株NCI-H69AR均购自美国ATCC;另一多药耐药细胞株H446DDP细胞为本课题组根据文献报道（PMID:2436751）的NCI-H69AR细胞的建立方法构建;16HBE为人支气管上皮细胞株。4.细胞转染（1）瞬时转染:采用阳离子脂质体法,将miR-574-5p mimics（模拟物）、inhibitors（抑制物）或antagomir（拮抗剂,更稳定,可用于动物实验）及其阴性对照（miR-NC）序列,和 HOTTIP、HOXA11、HOXA13、EZH1 的小干扰 RNA 序列和pcDNA3.1/PEX-3表达载体及相应的阴性对照载体,分别转染5株小细胞肺癌细胞和1株人支气管上皮细胞,获得瞬时上下调miR-574-5p、HOTTIP、H0XA11、HOXA13、EZH1 的细胞。操作按 LipofectamineTM2000 试剂说明书进行。（2）稳定转染:①采用阳离子脂质体法,将表达HOTTIP的pcDNA3.1载体及相应的空载体、表达HOXA11、HOXA13的PEX-3载体及PEX-2空载体（绿色荧光标记）分别转染H69和H446细胞,通过G418筛选阳性转染子进行扩大培养,获得稳定高表达HOTTIP、HOXA11、HOXA13的H69和H446细胞株。操作按LipofectamineTM2000试剂说明书进行。②采用慢病毒法,将HOTTIP的siRNA干扰序列通过LV3慢病毒载体包装后进行靶细胞侵染实验,同时设立LV3-NC对照转染组,获得稳定沉默HOTTIP的H146、H69AR及H446DDP细胞株。5.总RNA的提取及qRT-PCR（1）细胞内总RNA的抽提参照TRIZOL试剂说明书进行操作;石蜡包埋组织内总RNA的抽提采用Qiagen公司产品石蜡组织RNA提取试剂盒（miRNeasy FFPE Kit）说明书进行操作。（2）取上述RNA进行逆转录和qRT-PCR。逆转录反应参照AMV逆转录试剂盒说明,PCR反应在qRT-PCR反应仪上进行。miRNA特异性的逆转录序列及内参U6参照miRNAs qRT-PCR试剂盒说明。GAPDH和U6 snRNA分别作为内参,三次独立实验后得到的数据运用公式RQ=2-ΔΔCt进行分析。6.Western blot采用细胞裂解法提取细胞内全蛋白,参照石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒（上海生工,货号BSP058）说明书提取组织内全蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度,根据蛋白分子量选择配制10%～12%的分离胶然后依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、显影及定影,采用Quantity One（Bio-Rad）软件进行蛋白相对表达强度定量。7.CCK8法分析细胞增殖情况及对化疗药物的敏感性CCK8法测增殖:在96孔板中接种细胞悬液（100 ml/孔）,置于培养箱预培养（37℃,5%C02）;向每孔加入10 μl的CCK-8溶液（避免生成气泡）;将培养板置于培养箱内孵育1～4 h;用酶标仪测定细胞在450 nm波长处的吸光度;连续几日在固定时间进行测定;以空白孔为对照,分析各孔细胞吸光度,制作细胞生长曲线。CCK8法测药敏:按照接种密度为1×104/100 μ1将细胞平铺于96孔板中,细胞进行瞬时或稳定转染后培养24h;分别加入阿霉素（Adriamycin,ADM）、顺铂（Cisplatin,CDDP）及足叶乙甙（Etoposide,VP-16）三种药物,继续培养24 h;每孔100 pl培养基加CCK8溶液10μl,37℃、5%CO2条件下孵育细胞4 h;在酶标仪上测定各孔细胞在450 nm波长处的吸光度;求5个复孔的吸光度的平均值,计算各组细胞在每种药物各浓度梯度作用下的存活率:细胞存活率=（实验组吸光度—空白对照组吸光度）/（阴性对照组吸光度—空白对照组吸光度）×100%。以上操作步骤重复三次,求各组细胞存活率的平均值,并以细胞存活率为纵轴、药物浓度对数为横轴作半对数图,然后计算出各组细胞对每种化疗药物的IC50值。8.流式细胞术利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的变化,在瞬时转染24 h或者稳定转染后收集细胞,采用AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒分析其凋亡率;细胞周期检测需经70%乙醇于4℃固定过夜,经PI染色后再进行测定。9.克隆形成实验平板克隆形成实验:制备单细胞悬液,分别取500个细胞接种于直径3.5 cm的培养皿中,其中加药处理组次日更换为含药培养基（根据IC50确定药物浓度）。5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养14～21 d,可见细胞集落时终止培养。常规PBS漂洗,甲醇室温固定10 min,0.4%结晶紫室温染色10 min。显微镜下记数大于50个细胞的集落数。重复三次,取平均值。软琼脂克隆形成实验:制备单细胞悬液备用,调整细胞密度至1× 103细胞/ml;将配制好的5%的琼脂糖进行沸水浴使其溶化,从中取出一份量的液态琼脂糖移入小烧杯中,待冷至60℃左右,迅速加入9份量预温的新鲜完全培养基,混匀后立即浇入6孔培养板中,每孔2ml,室温凝固后备用;取37℃预热的细胞悬液9.4 ml加入小烧杯中（加药处理组采用含CDDP 4 pM的培养基）,加入50℃的5%的琼脂糖0.6 ml,迅速混匀后即配成0.3%琼脂糖细胞悬液,将其迅速加入铺有0.5%底层琼脂的6孔板中,每孔2ml,室温凝固;将每孔约含200个细胞的培养板置5%CO2、37℃下培养20天;使用倒置显微镜计数含50个以上细胞的克隆数,重复三次,取平均值。10.裸鼠成瘤实验裸鼠皮下成瘤模型的建立:a.实验动物:5-6周龄Balb/c裸鼠,雄性,体重15±2g,由广东省实验动物中心提供,均置于SPF环境下饲养;b.细胞处理:取生长状态良好、对数生长期的实验组和对照组细胞,以0.25%的胰酶消化,PBS洗涤三遍后,用生理盐水重悬细胞,调整其浓度为2.5×107/ml。置于冰上备用;c.肿瘤细胞皮下注射:医用碘伏消毒局部皮肤后,用1ml注射器,每组接种108/ml细胞悬液于裸鼠臀部皮下。为保证具有可比性,在裸鼠上、下肢侧随机接种,看成瘤情况;d.皮下接种瘤细胞悬液后,观察并分析各组细胞成瘤情况的差异,包括移植瘤体生长曲线、瘤体体积和重量之间的比较;e.药效学实验:待肿瘤体积长至100-300 mm3时,根据肿瘤体积随机分组后,腹腔注射法分别给予顺铂（5 mg/kg）和足叶乙甙（2.5mg/kg）两种化疗药联合应用（给药剂量参考Jaspers J,etal.Cancer Res,2015;75:732-41）,每周给药一次,每隔3天用游标卡尺测量肿瘤大小,计算并比较肿瘤体积和重量,并统计裸鼠的生存时间。f.病理观察:6周后,断颈处死裸鼠,剥离瘤块,摘取肝脏和脑组织等内脏组织,备注清楚编号,液氮保存备用。11.双荧光素酶报告基因实验编码荧光素酶报告基因的psiCHECK2质粒购自美国Promega公司,psiCHECK2-H-HOTTIP-3’-UTR 和 psiCHECK2-H-EZH1-3’-UTR 野生型重组质粒以及各自相应的突变型质粒由苏州吉玛基因股份有限公司协助构建,按照1～2×105细胞/孔的细胞密度将293T细胞接种于12孔板后,应用脂质体LipofectamineTM 2000 将 40nM hsa-miR-574-5p、阴性对照 miR-NC、上述重组质粒或相应突变质粒与1 ng的psiCHECK2质粒共转染293T细胞,psiCHECK2载体被作为内参来矫正转染效率的差异。转染后48 h收集293T细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统（碧云天）进行数据分析。12.免疫组化将小细胞肺癌石蜡包埋标本切成4 μm薄片,然后脱蜡并进行抗原修复,应用内源性过氧化物酶阻断剂处理、山羊血清封闭、抗体孵育、DAB显色、苏木素复染、二甲苯透明、中性树胶封片等一系列步骤完成后,对细胞染色强度进行半定量检测,于显微镜下随机选取5个高倍视野,以核阳性染色的细胞数超过50%判定为阳性表达,根据镜下细胞综合染色情况进行评分:棕褐色判定为3分（+++）,棕黄色判定为2分（++）,淡黄色判定为1分（+）,无着色则判定为0分（一）。13.统计学分析所有结果均经SPSS20.0软件统计处理,采用Graphpad Prism软件对分析结果作图。数据以均数±标准差（x±s）表示,计数资料两两比较采用χ2检验,计量资料两两比较采用t检验,多组间比较,方差齐则采用one-way ANOVA,方差不齐即采用Welch法;组间多重比较,方差齐采用LSD方法,方差不齐则采用Dunnett’s T3方法;采用Kaplan-Meier法进行生存分析;使用Chi-Square检验分析某个指标的表达量与各临床病理参数之间的关系;多基因表达相关性分析采用Spearman相关分析。各项实验独立重复三次,以P<0.05为差异有统计学意义。四、研究内容1.临床样本中分析HOTTIP表达与小细胞肺癌患者临床分期及预后的相关性①QRT-PCR、Western blot、免疫组化技术检测经临床验证的化疗敏感和耐药患者癌及癌旁组织中HOXA11、HOXA13和（或）HOTTIP的表达情况;②采用Kaplan-Meier法分析HOTTIP表达与患者临床分期及预后的相关性。2.明确HOTTIP在小细胞肺癌发生发展及耐药中的作用基因转染和RNA干扰技术分别增加H69、H446细胞和降低H69AR、H446DDP细胞中HOTTIP的表达水平,进行以下检测:①CCK8法分析HOTTIP与细胞化疗敏感性的关系;②CCK8法分析HOTTIP与细胞增殖的关系;③克隆形成实验分析HOTTIP与细胞增殖和耐药的关系;④利用裸鼠成瘤模型体内分析HOTTIP与肿瘤生长和耐药的关系;⑤流式细胞术分析HOTTIP对细胞周期和细胞凋亡率的影响;⑥细胞划痕实验和Transwell迁移实验分析HOTTIP对细胞迁移能力的影响。3.明确HOTTIP作为ceRNA诱导EMT参与小细胞肺癌耐药调控的分子机制①分析miR-574-5p对小细胞肺癌细胞增殖、迁移和化疗敏感性的影响;②基于生物信息学预测结果,采用qRT-PCR和Western blot进一步验证miR-574-5p可以负向调控其靶基因HOTTIP和EZH1;③双荧光素酶报告基因实验明确miR-574-5p分别与靶基因HOTTIP和EZH1的直接结合作用,并进一步证实HOTTIP是否能够与EZH1竞争结合miR-574-5p;④明确HOTTIP通过吸附miR-574-5p诱导了 EMT的产生,并进一步参与了小细胞肺癌耐药的调控。五、研究结果1.芯片结果显示,HOTTIP等多个HOXA家族成员在人小细胞肺癌多药耐药细胞株H69AR中异常高表达,miR-574-5p等多个miRNAs在H69AR细胞中异常低表达1.1 lncRNA芯片结果显示,HOTTIP等多个HOXA家族成员在H69AR细胞中异常高表达利用Arraystar公司的lncRNA芯片,分析H69AR细胞与H69细胞之间lncRNA的差异表达谱发现,在耐药细胞株中高表达的HOX家族成员有:HOTTIP上调表达倍数是14.9,HOXA13上调表达倍数是13.5,HOXA11为2.2倍的上调表达。QRT-PCR验证后发现,相对于H69细胞,HOTTIP及HOXA13、HOXA11在H69AR细胞中的差异表达倍数显着高出其他基因,分别为15.1433±0.6501、12.99±0.5411、8.23±0.2706,P<0.001,差异有统计学意义。1.2 miRNA芯片结果显示,miR-574-5p等37个miRNAs在H69AR细胞中异常低表达miRNA芯片分析发现,H69AR和H69细胞中miRNAs的表达谱存在显着差异,有85个miRNAs表达差异显着,其中包括miR-375在内的48个miRNAs在H69AR细胞中的表达显着高于H69细胞,包括miR-574-5p在内的37个miRNAs在H69细胞中的表达显着高于H69AR。接下来,通过qRT-PCR技术验证了上述结果的准确性,发现miR-574-5p在H69细胞中的表达是H69AR细胞中的3.963±0.3807倍,P<0.001,差异有统计学意义。1.3 miR-574-5p可能靶向调控HOTTIP的表达采用生物信息学网站分析发现,miR-574-5p在HOTTIP启动子区有相互结合位点,提示miR-574-5p可能通过靶向HOTTIP参与小细胞肺癌耐药。2.HOTTIP及HOXA11、HOXA13在小细胞肺癌细胞株及组织中的表达及临床病理联系2.1 QRT-PCR检测发现,HOTTIP及HOXA11、HOXA13在小细胞肺癌细胞株及经临床验证的产生了化疗抗药性的患者小细胞肺癌活检组织中显着高表达QRT-PCR 检测 HOTTIP、HOXA11、HOXA13 及其它 HOXA 家族成员（HOXA7、HOXA6、HOXA3、HOXA2、HOXA1）在 H69 及 H69AR 中的表达情况。结果显示,HOTTIP及HOXA11、HOXA13在H69AR细胞中显着高表达（P<0.01,详见结果部分）。Western blot检测H69、H69AR、16HBE细胞中HOXA11和HOXA13表达情况,结果显示,与任一组相比,16HBE细胞中两种蛋白的表达均较低;而与H69相比,H69AR中两种蛋白的表达较高（P<0.01,详见结果部分）。QRT-PCR检测临床收集的1 15例小细胞肺癌组织及癌旁组织中HOTTIP、HOXA13和HOXA11的表达情况发现,相对于癌旁组织,癌组织中HOTTIP相对表达倍数为 2.03±0.18 倍,HOXA13 为 6.34±0.22 倍,HOXA11 为 12.34±0.84倍。进一步分析发现,50例经临床验证的产生了化疗抗药性的患者癌组织内HOTTIP表达量（0.7825±0.1764）比其他50例临床化疗效果良好的患者癌组织中的表达量（0.3904±0.1665）显着增高（P<0.01）;HOXA13和HOXA11同样在化疗耐药组中的表达相对较高（P<0.01,详见结果部分）。Western blot检测HOXA13和HOXA11蛋白的表达情况,结果显示,与任一组相比,癌旁组织中两种蛋白的表达均较低;而与化疗敏感患者癌组织相比,产生化疗抗药性的患者癌组织中两种蛋白的表达较高（P<0.01,详见结果部分）。2.2 HOXA13和HOXA11蛋白在临床化疗耐药患者癌组织中表达较高免疫组化技术检测100例小细胞肺癌组织（化疗耐药组和化疗敏感组各50例）及相应的癌旁肺组织中HOXA13和HOXA11蛋白的表达情况后发现,HOXA13呈阳性表达有39例,阳性表达率为78%（39/50）;HOXA11 阳性表达有31例,阳性表达率为62%（31/50）。2.3采用Kaplan-Meier法分析HOTTIP表达与患者临床病理资料的关系结果发现,HOTTIP表达与性别差异无关（χ2=0.4183,P=0.5178）,HOTTIP表达与患者发病年龄无关（χ2=0.5957,P=0.4402）;而广泛期患者中HOTTIP阳性表达率比局限期患者明显较高（χ2=9.6084,P=0.0019）,HOTTIP表达阳性患者临床化疗效果出现抗药性的比率比HOTTIP阴性表达者增加（χ2=9.6976,P<0.0018）,HOTTIP表达阳性患者的中位生存时间较短,死亡率较高（χ2=23.5898,P<0.001）。2.4小细胞肺癌患者中位生存时间分析采用Kaplan-Meier法估计患者生存时间,结果发现性别与患者的生存时间无显着相关性（P=0.8306）;年龄与患者生存时间无显着相关性（P=0.8198）;局限期患者的生存时间长于广泛期患者,差异具有统计学意义（P<0.001）;HOTTIP阴性患者的生存时间长于阳性患者,差异具有统计学意义（P<0.001）。3.HOTTIP可激活HOXA11和HOXA13的表达3.1 QRT-PCR检测发现,HOTTIP、HOXA11和HOXA13在H69AR细胞中的表达高于H69细胞（P<0.001）。3.2将HOTTIP siRNAs（siHOTTIP-1,-2,-3）和阴性对照的空载体转入H69AR和H446DDP细胞,RT-PCR检测发现siHOTTIP-1序列的沉默效果最佳,被选用进行后续短效实验;同时,我们通过慢病毒载体LV3包装siHOTTIP-1序列导入细胞获得HOTTIP稳定下调的细胞株,用来进行平板克隆实验及裸鼠成瘤等长效实验。3.3将美国斯坦福大学Wang,K.C.教授惠赠的pcDNA3.1-HOTTIP表达质粒进行质谱鉴定后,以pcDNA3.1-NC空载体为阴性对照,转染H69和H446细胞,qRT-PCR检测发现HOTTIP上调效果显着（F=14.66,P=0.0006）,我们采用G418筛选后建立HOTTIP稳定过表达细胞株,用来进行部分后续体内外实验。3.4采用基因转染和RNA干扰技术分别增加和降低细胞内HOTTIP的表达,采用 qRT-PCR 和 Western Blot 技术检测发现,HOXA11 和 HOXA13 在 mRNA 和蛋白水平的表达均相应增加或降低（详见正文）;而在HOTTIP沉默的细胞内利用基因转染技术增加HOXA11和HOXA13的表达后,检测发现二者在mRNA和蛋白水平的表达均显着增加。4.HOTTIP参与了小细胞肺癌细胞耐药、增殖、克隆形成、凋亡、迁移、裸鼠成瘤等生物学行为4.1 CCK8法和流式细胞术检测发现,沉默HOTTIP可显着增加细胞对化疗药物ADM、DDP和VP-16的敏感性和细胞凋亡率,降低细胞的生存率及IC50值;反之过表达HOTTIP可显着降低细胞对化疗药物ADM、DDP和VP-16的敏感性及细胞凋亡率,提高细胞的生存率及IC50值。4.2 CCK8法和流式细胞术检测发现,沉默HOTTIP后细胞周期紊乱,增殖能力下降;反之,HOTTIP过表达后细胞增殖能力增强。4.3克隆形成实验检测发现,沉默HOTTIP后细胞克隆形成能力下降,单个克隆内平均细胞数量减少或克隆数量减少;反之,过表达HOTTIP后细胞克隆形成能力增强,单个克隆内平均细胞数量增加或克隆数量增多。4.4细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测发现,HOTTIP沉默可显着降低细胞的迁移能力;反之,HOTTIP过表达可增强细胞的迁移能力。4.5 HOTTIP沉默可显着降低细胞成瘤能力,瘤体体积和重量显着下降;相反,HOTTIP过表达可显着增强细胞成瘤能力,瘤体体积和重量显着增加。5.HOTTIP可作为ceRNA,通过吸附miR-574-5p促进其靶基因EZH1的表达5.1 miR-574-5p与小细胞肺癌细胞增殖、迁移及耐药密切相关根据miRNA芯片结果,筛选出miR-216a和miR-574-5p可能与小细胞肺癌耐药相关。接下来,我们通过增加miR-574-5p的表达可增强细胞对化疗药物ADM、CDDP、VP-16的敏感性;抑制miR-574-5p的表达则降低细胞对上述化疗药物的敏感性;CCK8法检测发现,沉默miR-574-5p可促进细胞增殖;平板克隆实验发现细胞克隆形成能力增加;Transwell细胞迁移实验检测发现,沉默miR-574-5p可使细胞迁移能力增强。miR-574-5p过表达则抑制细胞增殖和克隆形成,细胞迁移能力亦下降。5.2 利用miRNA靶基因预测网站分析发现,miR-574-5p分别与HOTTIP和EZH1的3’-UTR区具有互补结合位点;经QRT-PCR技术验证发现,沉默细胞内miR-574-5p的表达后HOTTIP和EZH1的表达显着增加;经Western Blot技术检测发现,沉默细胞内miR-574-5p的表达后HOXA11、HOXA13和EZH1蛋白的表达均显着增加。5.3沉默细胞内HOTTIP的表达可引起EZH1表达增加而miR-574-5p表达下降;采用SPEARMAN相关分析发现,小细胞肺癌组织中HOTTIP及EZH1的表达存在显着的正相关（P<0.001）。5.4双荧光素酶报告基因实验发现,miR-574-5p可分别与HOTTIP和EZH1的启动子区的相应位点直接结合;为了检测HOTTIP是否通过miR-574-5p来调控EZH1,我们加入HOTTIP报告质粒后,miR-574-5p引起的EZH1报告质粒荧光素酶活性被抑制的情况得到逆转;突变MIR-574-5P结合位点后,逆转作用消失,进一步证实HOTTIP通过MIR-574-5P结合位点调控EZH1。5.5通过沉默细胞内EZH1和EZH2的表达我们发现,细胞对三种化疗药物的敏感性均增强,由于二者均为组蛋白甲基化转移酶,HOTTIP是否通过诱导甲基化参与了小细胞肺癌耐药?具体研究仍在进行中。6.HOTTIP可能以ceRNA的调控模式诱导了小细胞肺癌EMT6.1本课题组前期通过cDNA表达谱芯片分析发现,EMT相关分子与小细胞肺癌耐药密切相关。QRT-PCR和Western blot技术检测发现,沉默细胞内HOTTIP的表达可抑制Vimentin、Twist和Snail的表达,促进E-cadherin和β-catenin的表达,提示HOTTIP可能通过诱导EMT参与了小细胞肺癌耐药。6.2沉默H146/si-HOTTIP细胞内miR-574-5p表达后,倒置显微镜下观察细胞形态的变化:与H146及H146/si-HOTTIP细胞卵圆形、半贴壁生长的特点不同,H146/si-HOTTIP+miR-574-5p antagomirs组细胞呈细长、梭形、极性逐渐丧失,逐渐转变成具有间质细胞表型和特征的细胞。6.3将稳定沉默HOTTIP的H69AR细胞,通过转染miR-574-5p antagomirs降低miR-574-5p的表达后,采用qRT-PCR和Westen blot技术检测EMT相关上皮标记物和间质标记物的表达情况。结果显示,与H69AR/si-HOTTIP组对比,H69AR/si-HOTTIP+miR-574-5p antagomirs 组细胞内上皮标记物 E-cadherin、β-catenin表达显着降低,而间质标记物Vimentin、Twist、Snail表达显着升高。因此,HOTTIP可能通过吸附miR-574-5p诱导EMT的发生被进一步在H69AR细胞中证实。6.4 进一步研究发现,与前两组相比,H146/si-HOTTIP+miR-574-5p antagomirs组细胞迁移能力和克隆形成能力均显着增强。以上结果提示,HOTTIP可能通过吸附miR-574-5p诱导EMT参与小细胞肺癌细胞增殖和迁移。六、结论1.HOTTIP可能是小细胞肺癌独立的预后因子之一。2.HOTTIP参与小细胞肺癌多药耐药、增殖、迁移、凋亡、皮下成瘤等恶性生物学行为的调控。3.HOTTIP可能通过吸附miR-574-5p,促进EZH1表达参与了小细胞肺癌耐药。4.HOTTIP可能作为ceRNA,诱导EMT,参与小细胞肺癌耐药、增殖和迁移。综上所述,作为小细胞肺癌可能的独立预后因子之一,HOTTIP可作为ceRNA,通过吸附miR-574-5p诱导EMT的发生,广泛参与调控小细胞肺癌多药耐药、增殖、凋亡、迁移、克隆形成以及裸鼠皮下成瘤等生物学行为。
唐兆前[2]（2010）在《卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究》文中进行了进一步梳理卵巢上皮癌在妇科恶性肿瘤中致死率最高。手术后,以铂类为基础的联合化疗是其主要的治疗方法。但随着化疗的进行,患者最终获得难以治愈的多药耐药,因而其五年生存率一直徘徊在30-50%。为了更好地认识肿瘤抑制基因在卵巢癌多药耐药中的机制,我们对卵巢癌卡铂耐药基因差异表达谱芯片进行了肿瘤抑制基因的筛选及验证,对相关的肿瘤抑制基因启动子区进行了甲基化检测以及突变基因筛选研究。并在组织标本中进行了临床意义的探讨。第二章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证目的:筛选卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）较其亲本（SKOV3）细胞系差异表达下调的肿瘤抑制基因,并验证其差异表达。方法:应用分子生物信息学方法,分析卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中卵巢癌SKOV3-CB细胞系较SKOV3细胞系差异表达下调两倍以上的基因1554条,筛选肿瘤抑制基因。应用real-time PCR技术对基因芯片中差异表达基因检测验证。结果:从卵巢癌卡铂耐药表达谱基因芯片中筛选出RNASET2,VHL,DLG1,COPS2,NOL7,GGNBP2, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3,PCGF2,ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等17个肿瘤抑制基因,荧光定量PCR技术差异表达验证结果示:RNASET2,VHL, COPS2,NOL7, RBL1, S100A2, PARG1,PERP,TCF3,DNAJA3, ING1,CYLD,RARRES3,RBBP8等基因差异表达下调,下调倍数分别为24.47、65.24、10.81、21.30、72.94、5.95、27.13、1.57、1.32、12.93、46.8、7.57、14.9、14. 00、23.98。GGNBP2,PCGF2,DLG1等基因差异表达上调,上调倍数分别为5.76,2.19,17.1,基因芯片差异表达结果与real-time PCR所验证表达下降趋势的结果一致率为82.35%,下调两倍以上的基因一致率为64.70%。结论:利用基因芯片技术分析基因差异表达结合real-time PCR对其检测结果验证是一种有效的方法,多肿瘤抑制基因参与卵巢癌卡铂耐药的机制。第三章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态与卵巢癌卡铂耐药表达下调的关系。方法:应用分子生物信息学方法,分析肿瘤抑制基因启动子区CPG岛并设计出引物,采用甲基化特异性PCR（MS-PCR）法或亚硫酸盐测序法（bisulphite sequencing）检测SKOV3-CB、SKOV3中的耐药相关肿瘤抑制基因启动子区甲基化状态。结果:表达下调的14个基因（VHL, COPS2, NOL7,RANSET2, RBL1, S100A2, PARG1, PERP, TCF3, DNAJA3, ING1, RARRES3, RBBP8,CYLD）中,有10个基因（VHL, COPS2, NOL7, RBL1, PARG1, PERP, DNAJA3, ING1, RNASET2,CYLD）启动子区能够设计出引物,其中CYLD未检出结果,后改用亚硫酸盐测序法检测。MS-PCR检测结果显示,SKOV3-CB、SKOV3的ING1、DNAJA3、VHL甲基化引物均能够扩增出产物,未甲基化引物均不能扩增出产物;COPS2、PERP甲基化引物均不能够扩增出产物,未甲基化引物均能够扩增出产物;RNASET2,PARG1、NOL7、RBL1甲基化引物与未甲基化引物均能够扩增出产物,CYLD重亚硫酸盐测序提示在SKOV3-CB及SKOV3细胞系均为未甲基化状态。结论:卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因启动子区无超甲基化,甲基化机制不是引起卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因差异表达下调的原因。第四章卵巢癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因突变检测目的:筛查可能的基因突变,探讨其与卵巢卡铂耐药以及相关肿瘤抑制基因表达下调的关系。方法:以亲本细胞系（SKOV3）为对照,在卵巢癌卡铂耐药细胞系（SKOV3-CB）,应用单链构象多态性分析（SSCP）检测RNASET2,VHL, COPS2, NOL7, PARG1, RBL1, PERP, DNAJA3, ING1, CYLD等10个基因RT-PCR扩增片段的突变。结果:以SKOV3细胞系为对照,在SKOV3-CB细胞系中,SSCP检测发现DNAJA3,PERP基因聚丙烯酰胺电泳带型存在差异;RNASET2,VHL,COPS2, NOL7, PARG1, RBL1,ING1, CYLD等基因未检测到差异带型。经测序发现PERP第三外显子1093,1160,1222位点上分别存在A→G突变;1083位点及1085,1086位点,分别存在T,C,C,碱基缺失。DNAJA3第八个外显子87位点处存在A→T突变。结论:DNAJA3,PERP的基因突变以及PERP基因的碱基缺失与卵巢癌卡铂耐药相关,可能是导致其表达下调的原因,宜进一步深入研究。第五章卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系的研究目的:探讨卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达的临床意义方法:Trizol一步法提取卵巢肿瘤患者卵巢组织总RNA,应用RT-PCR检测85例卵巢组织的RNASET2、VHL、PARG1、CYLD、COPS2、PERP、DNAJA3、ING1、NOL7、RBL1基因mRNA表达,其中卵巢癌49例,卵巢良性组织21例,卵巢正常组织15例。结果: RT-PCR结果显示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7基因在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织、卵巢癌组织中均有一定程度表达;VHL、PERP、COPS2、CYLD基因在正常卵巢组织、良性肿瘤中、卵巢癌组织中均有一定程度表达,但在部分卵巢癌组织中表达沉默,分别为4（4/49）、3（3/49）、2（2/49）、32（32/49）例;采用Fisher确切概率法统计分析,提示RNASET2、ING1、PARG 1、RBL1、NOL7、VHL、PERP、COPS2基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢正常组织及卵巢良性肿瘤中的表达沉默阳性率比较差异无意义。CYLD、DNAJA3基因在卵巢癌中的表达沉默阳性率与在卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢组织中的表达沉默阳性率比较差异有显着意义（P分别为0.00、0.00;0.00,0.00）。VHL等10个基因表达与卵巢癌临床病理的关系Fisher确切概率法统计分析,提示CYLD在FIGO I-II与III-IV期存在差异有意义外（P<0.05）,其余基因差异均无意义（P均>0.05）。Log Rank分析发现卵巢癌组织VHL、PERP、CYLD基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异均无统计学意义（P分别为0.183、0.493、0.271）。COPS2基因表达阳性患者与阴性患者的生存时间比较,差异有统计学意义（P=0.005）。COX回归模型多因素生存分析提示FIGO分期、病理分级进入模型（P分别为0.045、0.028）;淋巴结转移及COPS2、PERP、CYLD、ING1基因表达沉默等参数均未进入模型（P分别为0.907、0.476、0.754、0.728、0.304）。结论:结论CYLD、DNAJA3基因表达沉默可作为卵巢癌与卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织鉴别诊断的一个潜在的指标,COPS2、PERP、CYLD、ING1不能作为卵巢癌独立的预后因素。
马雪莲[3]（2010）在《COX-2转录抑制作用逆转MDR1/P-gp介导卵巢癌紫杉醇耐药的研究》文中指出背景与目的:卵巢癌的耐药已成为临床治疗失败的主要原因。环氧化酶-2（COX-2）过表达与肿瘤的发生和发展、多药耐药（Multi-drug resistance, MDR）形成、血管生成和侵袭转移等密切相关。转基因研究显示,COX-2参与了MDR1/P-gp表达的调节。COX-2和MDR1/P-gp表达的增加与卵巢癌的化疗耐受和预后差密切相关。紫杉醇诱导COX-2的稳定表达和MDR1的过表达与卵巢癌细胞MDR形成和紫杉醇耐药有关。临床免疫组化的证据显示,卵巢癌存在COX-2和MDR1/P-gp共表达现象,高表达COX–2的上皮性卵巢癌有较高的MDR1/P-gp表达,通常对化疗反应不佳,且无进展期较短,但卵巢癌COX-2和MDR1/P-gp共表达是否存在依赖关系尚未阐明;现有的COX-2选择性抑制剂具有下调肿瘤细胞MDR1/P-gp表达的作用。但大多是COX-2非依赖性的。因此,卵巢癌COX-2过表达是否与MDR1/P-gp介导的紫杉醇耐药有关仍需进一步研究。本文旨在从抑制COX-2转录活性,探讨卵巢癌细胞COX-2与MDR1/P-gp表达的依赖关系,以及对紫杉醇敏感性的影响,从而为避免或逆转COX-2依赖的MDR1/P-gp介导的紫杉醇耐药提供一个新的化疗策略。方法:1.利用COX-2促进子抑制剂槲皮素（Quercetin）处理人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/PTX,逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）检测A2780/PTX细胞的COX-2和MDR1 mRNA表达水平; 2.用免疫细胞化学染色法和酶联免疫吸附试验（Elisa）检测A2780/PTX细胞P-gp的表达; 3.用MTT法测定COX-2促进子抑制剂增加紫杉醇对A2780/PTX的生长抑制作用和敏感性。结果:1. RT-PCR分析显示,卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/PTX存在COX-2和MDR1过表达;COX-2转录抑制明显下调A2780/PTX细胞的COX-2和MDR1 mRNA表达,与对照相比,P<0.05,且呈良好的剂量和时间依赖关系; Pearson相关性分析显示COX-2 mRNA和MDR1 mRNA表达存在显着的依赖关系（R=0.748, P<0.01）;2.免疫细胞化学结果显示,COX-2转录抑制48h后,随着药物浓度的增加,细胞膜及细胞浆棕色逐渐淡染,可见,A2780/PTX细胞P-gp蛋白表达呈浓度依赖性减弱;与未处理A2780/PTX细胞比较,有显着差异;酶联免疫吸附试验定量检测了不同浓度Qu（Quercetin）处理48h的A2780/PTX细胞MDR1/P-gp蛋白的表达情况,结果显示,与对照相比,Qu（50,100和200μmol/L）显着下调了MDR1/P-gp蛋白的表达,P<0.05,且呈浓度依赖关系,进一步证实了COX-2转录抑制下调了MDR1/P-gp蛋白的表达, 3.COX-2转录抑制显着增加了紫杉醇对A2780/PTX细胞的生长抑制作用和敏感性,且呈明显的浓度依赖关系;不同浓度COX-2转录抑制剂（15μmol/L、30μmol/L）分别处理A2780/PTX细胞后,紫杉醇作用A2780/PTX细胞的IC50分别为2.114±0.122μmol/L、0.778±0.037μmol/L,与对照3.295±0.085μmol/L相比,其耐药指数ID（IC50 test/ IC50 contl）分别为0.64和0.24,分别降低了1.56和4.17倍（P<0.05）。结论:1)A2780/PTX细胞存在COX-2依赖的MDR1/P-gp的表达,具有显着相关的共表达特征; 2)COX-2转录抑制可明显下调MDR1/P-gp介导的MDR和增加A2780/PTX细胞对紫杉醇的敏感性,提示A2780/PTX细胞MDR表型与COX-2的过表达存在一定的依赖关系,通过COX-2转录抑制,下调COX-2依赖的MDR1/P-gp表达可能与增加紫杉醇敏感性有关。COX-2基因可能成为调控A2780/PTX细胞MDR1/P-gp表达的重要靶标。
申振涛[4]（2010）在《斑蝥素干预急性髓细胞性白血病端粒酶逆转录酶（hTERT）甲基化的研究》文中研究表明目的：研究中药提取物斑蝥素对端粒酶逆转录酶（hTERT）甲基化的影响,以期阐明斑蝥素对hTERT是否存在去甲基化治疗作用,探讨斑蝥素治疗急性髓细胞性白血病的作用机制。方法：采用HL-60细胞株,注入经60Co 200cGy辐射后的NOD/SCID小鼠体内,建立NOD/SCID小鼠一人急性白血病模型,分为实验组和空白组,实验组应用斑蝥素进行干预。RT-PCR法观察空白组和实验组hTERT mRNA的表达,MSP法观察空白组和实验组hTERT甲基化状态,对结果进行分析。结果：空白组和实验组经肝、脾、股骨病理证实造模成功；斑蝥素能明显延长白血病模型小鼠的生存时间（P<0.01）,并对小鼠外周白细胞影响明显（P<0.01）；斑蝥素能明显下调hTERT mRNA的表达（P<0.01）；但空白组和实验组均存在hTERT甲基化。结论：斑蝥素能够下调hTERT mRNA的表达；定性MSP未能证实斑蝥素对hTERT启动子产生明显去甲基化治疗作用,尚需采用实时荧光定量MSP进一步研究。
郭永良[5]（2009）在《水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性的影响及机制探讨》文中指出目的：探讨水蛭提取物（leech extract, LE）对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性的影响及机制。方法：比较液氮快速冻融法LE和传统水提醇沉法LE对HepG2细胞增殖的抑制作用并确定提取方法。以氟尿嘧啶（5-Fu）、阿霉素（ADM）对照,分别采用LE与5-Fu或ADM联合用药,体外干预HepG2细胞。采用MTT法检测各组药物对HepG2细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,RT-PCR法检测MDR1和baxmRNA的表达,吖啶橙／溴乙锭（AO/EB）荧光染色法观察HepG2细胞凋亡形态。结果：1、液氮快速冻融法制备的LE对人肝癌HepG2细胞增殖有明显抑制作用,细胞数目明显下降,并呈剂量依赖性,与水提醇沉提取法比较,差异有显着统计学意义（P<0.01）,从而确定液氮快速冻融法LE为下一步实验用药。2、LE可以增强5-Fu、ADM对HepG2细胞的抑制作用,差异有显着统计学意义（P<0.01）。倒置相差显微镜显示细胞数量明显减少,悬浮的圆细胞增多,细胞周围出现碎片；AO/EB荧光染色法观察到HepG2细胞明显的凋亡形态。3、LE可以增强5-Fu、ADM诱导HepG2细胞凋亡的作用,差异有显着统计学意义（P<0.01）。48h时,各药物组HepG2细胞凋亡率明显高于24h时,差异有显着统计学意义（P<0.01）。4、与5-Fu组比较,LE+5-Fu组HepG2细胞周期表现为GO／G1期、G2/M期细胞比例下降,s期细胞比例上升,差异有显着统计学意义（P<0.01）；与ADM组比较,LE+ADM组HepG2细胞周期表现为GO／G1期细胞比例下降,S期、G2/M期细胞比例上升,差异有显着统计学意义（P<0.01）5、与对照组比较,LE能够下调HepG2细胞MDR1 mRNA的表达,差异有显着统计学意义（P<0.01）；bax mRNA表达水平轻微上调,差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1、液氮快速冻融法制备的LE体外抑制HepG2细胞增殖作用明显优于水提醇沉法。2、LE可体外诱导人肝癌HepG2细胞凋亡,并提高对化疗药物5-Fu、ADM的敏感性。3、通过下调MDR1 mRNA的表达,可能是LE提高HepG2细胞化疗药物敏感性的重要分子机制。
丁震宇[6]（2008）在《HIF-1α及MDR1 miRNA重组慢病毒干扰体系逆转结肠癌细胞多药耐药的研究》文中认为背景与目的结肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,化疗在其治疗手段中占有重要地位,但不同个体对不同化疗方案的敏感性具有很大差异,很多患者疗效不佳,肿瘤细胞对抗肿瘤药物的多药耐药（multidrug resistance, MDR）一直是多种恶性肿瘤化疗失败的主要原因。所谓MDR是肿瘤细胞不单对原使用的药物产生耐药,同时对与之结构、作用机制完全不同的药物也产生交叉耐药。在引起MDR的众多机制中,目前研究的相对焦点则是多药耐药基因及其编码的蛋白,即人类MDR1基因的高表达,及其编码的膜P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）量的增加。P-gp是一种ATP酶活性的跨膜药物转运蛋白,能够转运多种结构和功能不同的化疗药物,将摄入细胞内的药物泵出,促使其外流而维持细胞内化疗药物的低浓度水平。在P-gp蛋白过表达的肿瘤细胞常表现对多种化疗药物的耐药,导致肿瘤化疗的失败。而实体瘤结肠癌中肿瘤细胞缺氧是一种常见的现象,在缺氧引起的肿瘤细胞生物学特性改变中,缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）起着重要作用。HIF-1α的过表达存在于大多数人类肿瘤细胞中,并与多种肿瘤的预后存在一定的相关性,且缺氧可导致肿瘤细胞对化疗药物抵抗性增加[1]。那么HIF-1α是否与肿瘤多药耐药的关键基因MDR1/P-gp相互作用也参与到结肠癌MDR的发生中?HIF-1α是否也是参与结肠癌化疗耐受的关键基因?如果对HIF-1α表达进行特异性抑制,能否在基因水平实现对结肠癌MDR的逆转呢?因此,更好的理解缺氧给结肠癌MDR带来的影响将有助于提高化疗效果。鉴于此,本课题拟观察结肠癌组织标本中HIF-1α与P-gp的表达和分布情况,检测四种结肠癌细胞株经低氧处理后HIF-1α与MDR1/P-gp的表达变化情况;构建慢病毒载体介导的HIF-1α与MDR1两套miRNA干扰体系,在建立的LoVo细胞多细胞球（multicellular spheroids, MCS）培养体系内研究其经低氧诱导产生MDR表型并有效沉默HIF-1α或MDR1基因表达后,LoVo MCS化疗敏感性及药物诱导凋亡水平变化情况,观察耐药逆转效率,旨在探讨以HIF-1α为靶点从基因水平实现对结肠癌MDR逆转的可能机制及可行性,为针对HIF-1α基因逆转结肠癌耐药的靶向性表达治疗策略提供理论基础和实验依据。方法1、通过免疫组织化学染色及免疫荧光双标染色技术观察结肠癌组织标本中HIF-1α与P-gp的表达和分布情况,了解二者在结肠癌组织中表达的关系及与肿瘤分期、淋巴转移等临床病理参数的关系。2、采用免疫细胞化学染色及RT-PCR技术分别在常氧及低氧培养条件下检测四种结肠癌细胞株中HIF-1α与MDR1/P-gp的表达变化情况,初步探讨肿瘤低氧微环境对HIF-1α及MDR1/P-gp表达的影响及二者表达的变化关系。3、设计合成分别针对靶基因HIF-1α与MDR1的各2组pre-miRNA干扰序列,构建带有报告基因EmGFP的pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR-HIF-1α及pcDNA?6.2-GW/ EmGFP-miR-MDR1两套干扰质粒,双酶切及测序鉴定质粒构建成功后,应用脂质体LipofectamineTM 2000分别介导两套miR干扰质粒转染LoVo细胞,经杀稻瘟菌素筛选稳定阳性克隆,利用半定量RT-PCR技术检测两种干扰质粒转染后相应目的基因mRNA表达抑制情况,分析其干扰效果及两种靶基因可能的作用关系,从而在备选的4组pre-miR RNA干扰序列中挑选出分别针对靶基因HIF-1α与MDR1干扰效果最佳的1组进行下游miR慢病毒表达载体的构建。4、选取上一部分鉴定出的干扰效果最佳的两组miR干扰质粒,应用Gateway重组反应技术构建分别针对靶基因HIF-1α与MDR1的两套miR慢病毒表达克隆pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR-HIF-1α与pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR-MDR1,应用脂质体LipofectamineTM 2000介导法,共转染ViraPower?混和慢病毒包装质粒体系入293FT细胞产毒,产毒上清经感染NIH/3T3细胞进行滴度测定。而后将HIF-1α与MDR1两套miR重组慢病毒干扰体系分别感染LoVo细胞,经杀稻瘟菌素稳定筛选后,利用半定量RT-PCR及Western blot技术分别检测干扰后HIF-1α与MDR1基因mRNA及蛋白的表达变化情况,并进一步在蛋白水平分析两种基因可能存在的作用关系。5、采用三维培养的方法分别建立稳定感染HIF-1α或MDR1 miR重组慢病毒及亲本LoVo细胞的多细胞球（MCS）培养体系,经低氧培养处理,模拟体内肿瘤细胞微环境,以建立体外经低氧诱导的LoVo MCS耐药模型,并采用流式细胞术分别检测各组LoVo MCS的细胞周期分布情况;随后利用Western blot技术检测HIF-1α及MDR1 miR慢病毒干扰体系在低氧诱导的LoVo MCS水平对相应目的基因的沉默效果并与常氧培养的正常LoVo MCS中目的基因蛋白表达情况作比较。6、应用MTT法检测亲本LoVo MCS分别在常氧培养及低氧处理后对ADR、VCR、5-Fu和CPT-11四种药物化疗敏感性的变化,并在低氧诱导的LoVo MCS多药耐药模型水平,分别检测HIF-1α和MDR1两套miR重组慢病毒感染组细胞对上述四种化疗药物敏感性的变化,观察其耐药逆转情况。7、应用流式细胞术检测各组LoVo MCS分别经ADR、VCR、5-Fu和CPT-11四种化疗药物作用,诱导细胞凋亡的情况。结果1、结肠癌组织标本观察到HIF-1α主要表达在肿瘤细胞的胞浆和（或）胞核,肿瘤坏死明显的区域内和肿瘤浸润边缘尤为多见,P-gp表达主要定位于肿瘤细胞的胞浆和胞膜;HIF-1α与P-gp蛋白阳性表达率分别为58.6%、46.6%;二者的表达不受患者性别、年龄、肿瘤位置及肿瘤分化程度的影响（P>0.05）;肿瘤有淋巴结转移者HIF-1α与P-gp的阳性表达率高于无淋巴结转移者（P<0.05）;随着Dukes分期进展,HIF-1α与P-gp表达率逐渐增高,C、D期表达情况较A、B期有显着差异（P<0.05）;二者在结肠癌组织中的表达呈显着正相关（γ=0.574, P<0.01）;免疫荧光双标染色结果显示HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中明确存在共表达现象。2、四种结肠癌细胞株（HCT-116, HT-29, LoVo, SW480）在常氧培养条件下HIF-1α与MDR1 mRNA及蛋白表达均很弱;低氧处理24 h后,四种细胞株中HIF-1α与MDR1/P-gp的表达水平均显着提高,差异具有统计学意义（P<0.01）;而二者在同种培养条件下四种细胞株之间的表达量则无明显差异（P>0.05）。3、成功构建带有报告基因EmGFP的pcDNA?6.2-GW/EmGFP-miR-HIF-1α（MDR1）两套干扰质粒,并能成功转染LoVo细胞,半定量RT-PCR显示与未处理组及阴性对照组相比较,HIF-1α与MDR1 miRNA干扰质粒组均能够特异并有效地抑制相应目的基因mRNA的表达（P<0.01）;同时发现,HIF-1αmiRNA干扰质粒组MDR1 mRNA表达水平与未处理组及阴性对照组相比也发生了显着下降（P<0.01）,而相反的, MDR1 miRNA干扰质粒组中HIF-1αmRNA的表达水平与未处理组及阴性对照组相比则无明显变化（P>0.05）;通过比较各质粒干扰效率,筛选出了分别针对HIF-1α与MDR1基因的最佳干扰质粒用于后续慢病毒干扰体系的构建。4、成功构建分别针对HIF-1α与MDR1的两套miR重组慢病毒表达质粒pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR-HIF-1α（MDR1）,经包装293FT细胞产毒后可以稳定感染LoVo细胞。半定量RT-PCR及Western blot结果显示HIF-1αmiR慢病毒感染组中HIF-1α与MDR1 mRNA及蛋白（HIF-1α与P-gp）表达量均显着低于未处理组和慢病毒阴性对照感染组（P<0.01）;在MDR1 miR慢病毒感染组中,MDR1 mRNA及P-gp蛋白表达水平也均显着低于未处理组和阴性对照组（P<0.01）,而HIF-1αmRNA及蛋白的表达水平则没有受到影响,与未处理组及阴性对照组之间无明显差异（P>0.05）。5、成功建立亲本LoVo MCS与LoVo MCS/LVV-HIF-1α（MDR1） miR模型,流式细胞术检测细胞周期分布结果显示:与亲本LoVo MCS常氧组相比,LoVo MCS低氧组G1期比例明显增高（P<0.01） ,同时S期与G2期比例下降（P<0.01） ; LoVo MCS/LVV-HIF-1αmiR组与LoVo MCS低氧组相比较,G1期比例显着减少（P<0.01）,同时S期与G2期比例明显增高（P<0.01）;而LoVo MCS/LVV-MDR1 miR组与LoVo MCS低氧组相比较,G1期、S期及G2期各期比例则无明显差异（P>0.05）。Western blot结果显示:LoVo MCS中两种目的蛋白的表达水平低氧组显着高于常氧组（P<0.01）,HIF-1α与MDR1两套miR慢病毒干扰体系感染的LoVo细胞所建立的MCS中相应目的蛋白的表达均得到了有效的抑制,抑制率分别达到76.0%与74.5%,而neg-miR阴性对照组与亲本细胞未处理组之间蛋白表达量并无差异（P>0.05）。6、四种药物在低氧处理后的LoVo MCS中敏感性均有不同程度下降,IC50值均高于相应的常氧组（ADR、VCR、5-Fu,均P<0.01,显着耐药;CPT-11,P>0.05,差异不显着）。LoVo MCS/LVV-HIF-1αmiR组中沉默HIF-1α基因后,LoVo细胞对ADR、VCR及5-Fu的敏感性均有不同程度的恢复,对ADR的耐药性从9.92-fold降至2.62-fold,耐药逆转81.78%（P<0.01）;VCR的耐药性从6.10-fold降至1.92-fold,耐药逆转82.04%（P<0.01） ; 5-Fu的耐药性从4.94-fold降至2.26-fold ,耐药逆转68.00%（P<0.01）; CPT-11耐受性从1.18-fold降至1.08-fold,但沉默HIF-1α前后并无统计学差异（P>0.05）。对于LoVo MCS/LVV-MDR1 miR组,沉默MDR1基因后,LoVo细胞对ADR与VCR的耐药性有所逆转,对ADR的耐药性从9.92-fold降至3.21-fold,耐药逆转75.24%（P<0.01）;VCR的耐药性从6.10-fold降至1.71-fold,耐药逆转86.04%（P<0.01）;而5-Fu与CPT-11的IC50值与低氧组相比无明显差异（P>0.05）,表明沉默MDR1基因表达对二者化疗敏感性变化无明显影响。7、流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示:与常氧培养的亲本LoVo MCS相比,低氧诱导的耐药LoVo MCS经上述药物诱导的凋亡水平均都有不同程度的下降,其中ADR、VCR及5-Fu作用后细胞凋亡水平分别是相应亲本细胞常氧组的11.10%、12.30%和30.58%,差异具有统计学意义（P<0.01）;而CPT-11作用后的低氧组凋亡水平虽有下降,但与常氧组相比并无明显差异（P>0.05）。两套miR慢病毒干扰体系对低氧耐药组细胞的凋亡诱导结果显示:与耐药LoVo MCS凋亡水平相比较,LoVo MCS/LVV-HIF-1αmiR组细胞通过沉默靶基因HIF-1α表达后,ADR、VCR及5-Fu诱导的凋亡水平均明显提高（P<0.01）,分别是相应耐药组的9.18、7.38和2.64倍,;而经CPT-11作用后的HIF-1α干扰组细胞凋亡水平仅是低氧组的1.05倍,并无统计学意义（P>0.05）;对于LoVo MCS/LVV-MDR1 miR组而言,通过沉默靶基因MDR1表达后,与耐药LoVo MCS凋亡水平相比较,ADR和VCR诱导的凋亡水平均有显着提高（P<0.01）,分别是相应耐药组的8.69和7.23倍,而经5-Fu或CPT-11所诱导的凋亡水平与低氧组相比则均无明显差异（P>0.05）。结论1、HIF-1α与P-gp在结肠癌组织中存在过表达和共表达现象,其表达不受患者性别、年龄、肿瘤位置、分化程度的影响,但在不同Dukes分期和是否伴随淋巴结转移等因素中二者表达阳性率呈显着差异,且二者表达呈显着正相关。2、低氧可以诱导结肠癌细胞中HIF-1α与MDR1/P-gp在mRNA及蛋白水平表达均显着升高,HIF-1α可能通过与MDR1/P-gp直接或间接的相互作用而参与了结肠癌多药耐药的发生。3、构建的分别针对靶基因HIF-1α与MDR1的两套miR慢病毒干扰体系可以分别在结肠癌LoVo细胞单层培养及MCS水平特异并有效地沉默相应目的基因mRNA及蛋白表达,且沉默HIF-1α的表达,能同时引起MDR1/P-gp表达显着下降,推测在低氧条件下,HIF-1α有可能作为MDR1上游的一个信号分子来直接或间接的激活或诱导其表达上调。4、低氧可以诱导结肠癌亲本LoVo MCS产生MDR表型,形成有效的耐药模型,对ADR、VCR及5-Fu均产生不同程度耐药,对CPT-11的敏感性也有所下降,但无统计学意义。沉默MDR1基因可以逆转由P-gp经典耐药途径介导的LoVo MCS对ADR和VCR产生的耐药;沉默HIF-1α基因可以有效逆转LoVo MCS对ADR、VCR及5-Fu产生的耐药,耐药逆转机制可能与其诱导MDR1/P-gp的表达、参与细胞周期的调控、抑制细胞凋亡等多因素相关。5、LVV-HIF-1αmiR干扰体系可以明显促进阻滞于G1期的细胞向S期过渡,参与细胞周期调控,联合ADR、VCR或5-Fu共作用可以显着诱导结肠癌耐药LoVo MCS发生细胞凋亡,提高化疗效果。6、CPT-11的化疗耐受机制不依赖于P-gp介导的经典耐药途径,可能通过其活性代谢产物SN-38对HIF-1α的抑制作用等其他途径使得其在肿瘤低氧微环境中保持一定的药物敏感性。
席子明[7]（2008）在《TRAIL及其受体的临床研究》文中认为
李骥[8]（2007）在《MBD1/mdr1信号转录调控胰腺癌多药耐药性的实验研究及其临床意义》文中研究表明在胰腺癌的综合治疗过程中，化疗效果始终不尽人意。多药耐药性MDR（multidrug resistance）及mdr1基因（multidrug resistance gene 1）被认为是临床化疗失败的主要原因之一。检测胰腺癌中mdr1基因的甲基化改变并试图应用甲基化CpG结合域蛋白1（methyl-CpG binding domain protein 1, MBD1）进行mdr1基因的甲基化转录调控，从而达到改变胰腺癌多药耐药性的目的。实验研究mdr1基因5′端的主要转录区域上游具有启动子活性，富有CAAT-盒和GC-盒，缺乏TATA-盒，其中-110GC盒和-50GC盒分别是转录抑制子和增强子的结合位点，结合位点的甲基化程度与肿瘤多药耐药基因表达有着密切的联系。通过荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）技术和甲基化特异性PCR（MSP）方法检测mdr1基因在胰腺癌肿瘤组织细胞中的表达及其甲基化水平，发现胰腺癌肿瘤组织细胞中mdr1mRNA与P-gp的表达存在显着相关性，同时mdr1基因转录区域的-110GC盒、-50GC盒结合位点甲基化程度与mdr1mRNA表达也存在显着相关性。所以我们认为mdr1基因转录区域结合位点甲基化可能是一种影响基因表达的重要机制，DNA甲基化状态改变可能是调控肿瘤多药耐药性的重要手段之一。我们利用基因芯片技术分析胰腺癌基因表达谱时，发现在差异表达的基因中，多个甲基化相关基因间的异常转录调控机制有重要的研究价值。其中甲基化结合域蛋白MBD1基因在胰腺癌中表达明显上调。作为一个重要的转录调控因子，胰腺癌中MBD1介导的甲基化转录调控作用可能是造成多药耐药基因转录表达增加／下降，以致胰腺癌多药耐药性发生改变的重要原因。BxPC-3为原发癌细胞株，且其原始mdr1基因和MBD1基因表达程度均高，因此选择BxPC-3细胞株作为进一步的研究对象。我们利用RNA干扰技术，设计合成了针对MBD1基因的siRNAs，成功构建MBD1siRNAs真核表达质粒Rotro Super-MBD1siRNAs，并成功载入质粒。采用脂质体介导的方法将MBD1siRNAs表达质粒转染胰腺癌细胞系BxPC-3，成功下调了BxPC-3细胞株MBD1基因表达水平。应用免疫组化定量分析法、FQ-PCR技术、MSP方法及MTT比色法检测BxPC-3细胞在调控前后mdr1／P-gp在蛋白水平、基因表达水平、基因甲基化程度以及肿瘤细胞增殖能力变化。研究结果显示MBD1siRNA表达质粒能显着抑制胰腺癌细胞BxPC-3中MBD1的表达，同时P-gp、mdr1基因表达随之下调，转录区域结合位点甲基化表达呈上调，细胞株对于药物的耐药性受到相应的抑制，即药物敏感性提高。临床研究应用免疫组织化学法和FQ-PCR技术、MSP方法分别从蛋白和基因水平检测胰腺癌临床组织标本和对应外周血标本中的mdr1基因的表达及转录区域结合位点甲基化水平。研究外周血有核细胞与肿瘤组织细胞的多药耐药基因及其甲基化表达的相关性及一致性。研究结果表明，外周血与肿瘤组织细胞中的mdr1基因及其甲基化表达存在显着的相关性及一致性。推想临床上可根据外周血测定mdr1基因及其甲基化表达水平来预测胰腺癌患者化疗前后多药耐药性的变化及影响。结论：研究结果表明，胰腺癌中P-gp与mdr1 mRNA表达呈显着一致，与mdr1基因转录区域结合位点甲基化表达程度也呈显着相关，提示mdr1基因转录区域结合位点甲基化对于胰腺癌的多药耐药性有着重要的意义。当胰腺癌细胞株BxPC-3通过脂质体介导方法转染MBD1siRNAs表达质粒后，MBD1的表达受到有效抑制，改变了mdr1／P-gp在蛋白水平、mRNA水平和基因甲基化的表达，影响了肿瘤细胞对药物的耐药能力，间接调控了胰腺癌的多药耐药性；外周血与肿瘤组织细胞中mdr1基因及其甲基化表达存在相关性及一致性。临床上可根据外周血测定mdr1基因及其甲基化变化程度来预测胰腺癌患者化疗前后多药耐药性的变化，从而指导临床。
张丽霞[9]（2007）在《淋球菌mtr耐药机制中IR区的作用》文中研究表明第一部分武汉地区淋球菌对6种抗菌药物敏感性的监测目的了解武汉地区淋球菌对6种抗菌药物耐药发生率及耐药趋势的变化,为临床用药提供依据,同时为进一步研究淋球菌多传递耐药系统（mtr）耐药机制中反向重复序列（IR区）的作用收集临床标本。方法临床分离76株淋球菌,采用琼脂稀释法测定淋球菌对于青霉素、四环素、阿奇霉素、环丙沙星、头孢曲松、大观霉素的最小抑菌浓度（MIC）;根据相关耐药标准判定菌株的耐药性。结果2004年4月～2004年12月从临床淋病患者共分离培养鉴定76株淋球菌,其中β-内酰胺酶试验阳性者共6株,约占7.89%。β-内酰胺酶试验阴性者耐青霉素、四环素、阿奇霉素、环丙沙星的菌株分别占60.00%（42）、71.42%（50）、37.14%（26）、54.28%（38）,同时耐2种及以上抗菌药物的交叉多重耐药率为80%（56）;未发现耐大观霉素、头孢曲松的菌株。结论武汉地区淋球菌环丙沙星耐药率、交叉多重耐药率均增长迅速;头孢曲松、大观霉素尚未发现耐药菌株,与1996年～1998年相比耐药率基本无变化,仍可以作为武汉地区治疗淋病的首选药物;其余4种不作为首选。第二部分淋球菌mtr系统的IR区基因突变与其耐药性的关系目的探讨mtr系统IR区基因点突变与淋球菌耐药性的关系;耐单一种类抗生素和耐两种或以上类型抗生素的耐药株的IR区点突变的差异;实验室诱导耐药株与自然耐药株之间IR区点突变的差异。方法临床分离淋球菌以琼脂稀释法进行药敏试验,测定其MIC;以次抑菌耐药浓度方法对临床分离敏感菌株进行药物诱导筛选,直至诱导筛选出耐不同药物菌株;对两种来源的菌株标本以聚合酶链反应（PCR）扩增包含IR区在内的目的基因,对扩增产物测序;比较IR区基因序列。结果临床分离组中:敏感株及仅耐青霉素菌株无IR区基因突变,交叉多重耐药菌株中IR区除1株为碱基A/T插入外均有碱基A/T缺失;由实验室诱导的耐药菌株中:所有仅耐1种药物菌株及1株多重耐药株无IR区基因突变,7株交叉多重耐药菌株IR区有碱基A/T缺失;交叉多重耐药株碱基点突变可能有两种形式即单个碱基A/T的缺失和插入。结论淋球菌敏感株及仅耐1种抗生素耐药株的IR区无点突变;淋球菌交叉多重耐药株存在IR区点突变,可能有两种形式即单个碱基A/T的缺失和插入。IR区点突变会引起淋球菌交叉多重耐药株的产生,增加淋球菌对抗生素的抗性。第三部分淋球菌株IR基因突变与mtrC基因表达的关系目的研究不同来源不同耐药性淋球菌株mtrC蛋白产物表达差异及mtr系统的IR区基因点突变与mtrC基因转录和蛋白表达水平的关系,进一步探索mtr系统的非mtrR依赖调节机制。方法琼脂稀释法测定抗生素对不同菌株MIC,以次抑菌耐药浓度方法对临床分离的敏感菌株进行药物诱导筛选,直至诱导筛选出耐不同药物的菌株;采用RT-PCR检测mtrC的mRNA表达水平变化,Western blot检测mtrC蛋白表达状况;将实验室诱导所得耐药菌株与临床分离自然耐药株mtrC转录及蛋白表达水平进行比较,对其IR区基因点突变与MtrC蛋白的表达作相关性分析。结果临床分离组中:敏感株及仅耐青霉素菌株无IR区基因突变,但两者之间mtrC转录水平及蛋白表达水平有差异（P<0.05）;而耐药组中交叉多重耐药菌株组（IR区碱基突变组）则显着高于仅耐青霉素菌株（无突变组）（P<0.05）,不同耐药性交叉多重耐药菌株组之间则无显着差异（P<0.05）。实验室诱导筛选组中:在敏感株及仅耐1种药物菌株组中,耐1种药物的菌株mtrC转录及蛋白表达水平显着高于敏感组菌株（P<0.05）,耐1种药物的菌株不同组别之间无显着的差异（P<0.05）;在耐药组中,交叉多重耐药菌株组（突变组）显着高于耐1种药物菌株组（无突变组）（P<0.05）。临床分离组与实验组相比较,交叉多重耐药菌株组mtrC转录水平及蛋白表达水平无显着性差异（P<0.05）。结论淋球菌mtr系统存在非mtrR依赖调节机制;mtr系统的IR区点突变可能和其它耐药机制协同作用引起mtrC基因转录及蛋白表达增加进而提高淋球菌的耐药性;淋球菌产生耐药的过程中可能首先发生的是mtrR基因突变,产生低中度耐药,随后IR区基因突变产生,中高度耐药。
郑雪平,谭兰,宋敬卉,王雁,孙妍萍,朱琪秀[10]（2006）在《难治性癫患者外周血中MDR1基因的表达及临床意义》文中研究表明目的研究难治性癫患者外周血中多药耐药1（MDR1）基因的表达以及抗癫药物和性发作在难治性癫多药耐药发生中的作用。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）半定量检测120例研究对象外周血中MDR1基因mRNA的表达。根据析因设计分性发作和抗癫药物两个因素,共分为A组（难治性癫组）、B组（癫治疗有效组）、C组（性发作未用药组）和D组（健康正常对照组）,各30例。结果4组的外周血中MDR1基因的表达水平明显不同（F=4.456,P=0.005）,其中性发作引起MDR1mRNA的表达明显增高（F=10.005,P=0.002）,抗癫药物的作用则不明显（F=0.919,P=0.340）,抗癫药物与性发作两者之间没有交互作用（F=2.445,P=0.121）。结论难治性癫患者外周血中MDR1基因mRNA的表达上调是性发作而非使用抗癫药物的结果,外周血中MDR1基因mRNA表达水平的监测可以作为评价癫耐药的一项指标。
二、多重逆转录-聚合酶链反应方法半定量检测多药耐药基因mRNA表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、多重逆转录-聚合酶链反应方法半定量检测多药耐药基因mRNA表达（论文提纲范文）
（1）长链非编码RNA HOTTIP作为ceRNA参与小细胞肺癌增殖和耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 HOTTIP在小细胞肺癌中的表达分析 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料和方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 第二章 HOTTIP与小细胞肺癌发生发展及耐药的关系 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 第三章 HOTTIP参与小细胞肺癌调控的分子机制 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 材料和方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 结论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读期间成果 |
| 致谢 |
（2）卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药研究现况(文献综述) |
| 1 卵巢恶性肿瘤概述 |
| 1.1 卵巢癌的发病情况简述 |
| 1.1.1 卵巢癌的发病率及生存率 |
| 1.1.2 流行病学与致病因素 |
| 1.2 卵巢上皮恶性肿瘤的主要临床表现及诊断 |
| 1.2.1 肿瘤标志物 |
| 1.2.2 影像学检查 |
| 1.2.3 细胞学检查 |
| 1.2.4 腹腔镜探查术 |
| 1.2.5 联合诊断 |
| 1.3 卵巢上皮性癌一线常规治疗现况 |
| 1.3.1 卵巢癌手术治疗的研究近况 |
| 1.3.1.1 早、中期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.1.1.1 全面分期手术的定义与价值 |
| 1.3.1.1.2 早期卵巢癌的手术切除范围及注意事项 |
| 1.3.1.1.3 阑尾切除在卵巢上皮性癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.4 大网膜切除在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.5 腹膜后淋巴结清扫在卵巢癌治疗中的价值 |
| 1.3.1.1.6 卵巢癌的保守性手术现状 |
| 1.3.1.1.6.1 保守性手术的适应症与禁忌症 |
| 1.3.1.1.6.2 保守性手术的手术范围 |
| 1.3.1.1.6.3 保守性手术的价值 |
| 1.3.2 晚期卵巢癌的手术治疗现状 |
| 1.3.2.1 肿瘤细胞减灭术的原由及范围 |
| 1.3.2.2 肿瘤细胞减灭术的注意事项 |
| 1.3.2.3 影响肿瘤细胞减灭术的因素及在晚期卵巢癌临床治疗中的价值 |
| 1.3.2.4 复发卵巢癌的手术治疗 |
| 1.3.2.4.1 手术的目的与意义 |
| 1.3.2.4.2 手术的适应症,禁忌症及范围 |
| 1.3.2.4.3 影响手术效果的预后因素 |
| 1.3.3 化疗 |
| 1.3.3.1 一线化疗药物及方案的选择 |
| 1.3.3.1.1 一线化疗的指征 |
| 1.3.3.1.2 一线化疗药物以及方案的选择 |
| 1.3.3.2 腹腔化疗 |
| 1.3.3.3 维持或巩固化疗的临床价值 |
| 1.3.3.4 新辅助化疗 |
| 1.3.3.5 影响化疗疗效的临床病理因素 |
| 1.3.3.5.1 FIGO 分期 |
| 1.3.3.5.2 病理类型 |
| 1.3.3.5.3 残余灶的大小 |
| 1.3.3.5.4 化疗的用药剂量 |
| 1.3.3.5.5 肿瘤细胞产生耐药性 |
| 1.3.3.5.6 其它因素 |
| 1.3.4 影响腹腔化疗临床应用的因素 |
| 1.3.5 影响化疗疗效的分子病理因素 |
| 1.4 生物治疗 |
| 1.4.1 免疫治疗 |
| 1.4.2 过继性免疫治疗 |
| 1.4.3 抗体 |
| 1.4.4 细胞因子 |
| 1.4.5 肿瘤疫苗 |
| 1.5 基因治疗 |
| 1.5.1 自杀基因治疗 |
| 1.5.2 癌基因与抑癌基因治疗 |
| 1.5.3 免疫基因治疗 |
| 1.5.4 耐药基因治疗 |
| 1.5.5 抗肿瘤血管生成基因治疗 |
| 2 卵巢上皮恶性肿瘤的多药耐药 |
| 2.1 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的原因及机理 |
| 2.1.1 卵巢癌多药耐药的分子机理 |
| 2.1.1.1 细胞内化疗药物浓度降低 |
| 2.1.1.2 P-糖蛋白 |
| 2.1.1.3 多药耐药相关蛋白 |
| 2.1.1.4 肺耐药蛋白 |
| 2.1.1.5 乳腺耐药蛋白 |
| 2.1.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加 |
| 2.1.3 DNA 损伤修复能力增加 |
| 2.1.4 抗凋亡能力增加 |
| 2.1.5 p53 基因突变 |
| 2.1.6 信号传导通路 |
| 2.1.7 其它机制 |
| 2.1.7.1 细胞间连接 |
| 2.1.7.2 DNA 聚合酶 |
| 2.1.7.3 ATP7B |
| 2.2 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐药的诊断 |
| 2.2.1 卵巢癌多药耐药的诊断 |
| 2.2.1.1 MDR-1 基因 |
| 2.2.1.2 肺耐药蛋白 |
| 2.2.1.3 GST-π |
| 2.2.1.4 mtP53 |
| 2.2.1.5 c-erbB-2 基因(HER-2 基因) |
| 2.2.1.6 DNA 错配修复基因 |
| 2.2.1.7 ATP7B |
| 2.2.1.8 多药耐药基因 SNPs 的检测 |
| 2.2.1.9 细胞凋亡相关基因 |
| 2.2.1.10 多基因联合检测在诊断多药耐药的价值 |
| 2.3 卵巢上皮恶性肿瘤多药耐的治疗 |
| 2.3.1 卵巢癌多药咐药的分型及治疗原则和目的 |
| 2.3.1.1 卵巢癌多药耐药的分型 |
| 2.3.1.2 卵巢癌多药耐药的治疗原则 |
| 2.3.1.3 治疗的目标及价值 |
| 2.3.2 多药耐药的化疗 |
| 2.3.2.1 二线化疗药物及方案的选择及疗效评价 |
| 2.3.2.2 顽固型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.3 耐药型和难治型卵巢癌的治疗 |
| 2.3.2.4 影响二线化疗疗效的主要因素 |
| 2.3.2.5 常规化疗药物疗效预测分子靶向化疗 |
| 2.3.2.6 自体骨髓移植加大剂量化疗在卵巢癌多药耐药治疗中的应用 |
| 2.3.3 多药耐药的逆转耐药治疗 |
| 2.3.3.1 反义核酸技术 |
| 2.3.3.2 反义 RNA 技术 |
| 2.3.3.3 RNA 干涉技术 |
| 2.3.3.4 核酶基因转移技术 |
| 2.3.3.5 细胞因子基因逆转技术 |
| 2.3.3.6 针对 P-gp 的增敏治疗 |
| 2.3.3.7 针对 MRP 的增敏治疗 |
| 2.3.3.8 针对 BCRP 的增敏剂 |
| 2.3.4 多药耐药的手术治疗 |
| 2.3.5 多药耐药的的基因治疗 |
| 2.3.5.1 药物敏感基因 |
| 2.3.5.2 肿瘤免疫基因治疗 |
| 2.3.5.3 骨髓细胞修饰 |
| 2.3.6 多药耐药的综合治疗方案筛选及临床验证 |
| 2.3.6.1 单克隆抗体 |
| 2.3.6.2 腺病毒载体 |
| 2.3.6.3 中药治疗 |
| 2.3.6.4 亚致死量陡脉冲 |
| 3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因研究现况 |
| 3.1 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定技术 |
| 3.1.1 基因芯片技术 |
| 3.1.2 DDRT-PCT |
| 3.1.3 比较基因组杂交法 |
| 3.1.4 表达序列标签 |
| 3.1.5 基因表达的系列分析 |
| 3.1.6 消减杂交基因克隆技术 |
| 3.1.7 差异显示技术衍生的方法 |
| 3.1.8 差异基因的鉴定技术 |
| 3.2 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定现况及临床价值 |
| 3.2.1 基因芯片应用 |
| 3.3 卵巢上皮癌多药耐药差异表达基因筛选鉴定存在问题 |
| 4 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.1 基因甲基化的定义及主要检测手段 |
| 4.1.1 基因甲基化定义 |
| 4.1.2 主要检测手段 |
| 4.1.2.1 高效液相色谱柱(HPLC)及相关方法 |
| 4.1.2.2 SssI 甲基转移酶法 |
| 4.1.2.3 免疫化学法 |
| 4.1.2.4 氯乙醛法 |
| 4.1.2.5 特异性位点的 DNA 甲基化的检测 |
| 4.1.2.5.1 甲基化敏感性限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.2 直接测序法 |
| 4.1.2.5.3 甲基化特异性的 PCR |
| 4.1.2.5.4 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸 |
| 4.1.2.5.5 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 |
| 4.1.2.5.6 甲基化敏感性单链构象分析 |
| 4.1.2.5.7 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳 |
| 4.1.2.5.8 荧光法 |
| 4.1.2.5.9 DNA 微阵列法 |
| 4.1.2.5.10 甲基化敏感性斑点分析 |
| 4.1.2.5.11 甲基化特异性多连接依赖性探针扩增 |
| 4.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因甲基化的关系 |
| 4.3 卵巢上皮癌多药耐药基因甲基化检测的临床意义 |
| 4.3.1 治疗反应的标志物 |
| 4.3.2 化疗耐药和预后 |
| 5 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.1 基因突变的定义及主要检测手段 |
| 5.1.1 基因突变的定义 |
| 5.1.2 基因突变主要检测手段 |
| 5.1.2.1 直接 DNA 序列分析法 |
| 5.1.2.2 单链构象多态性分析技术 |
| 5.1.2.3 温度梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.4 变性梯度凝胶电泳分析 |
| 5.1.2.5 变性高效液相色谱 |
| 5.1.2.6 异源双链分析 |
| 5.1.2.7 核酸分子杂交 |
| 5.1.2.8 核糖核酸酶切法 |
| 5.1.2.9 限制性内切酶酶谱分析 |
| 5.1.2.10 蛋白截短试验 |
| 5.1.2.11 聚合酶链反应—限制性片段长度多态性分析 |
| 5.1.2.12 等位基因特异性扩增法 |
| 5.1.2.13 等位基因特异性寡核苷酸分析法 |
| 5.1.2.14 毛细管电技术 |
| 5.2 卵巢上皮癌多药耐药与基因突变的关系 |
| 5.3 卵巢上皮癌多药耐药基因突变检测的临床意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因甲基化检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 卵巢上皮癌卡铂耐药细胞与非耐药细胞筹异表达基因突变检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 卵巢癌卡铂耐药相关肿瘤抑制基因表达与临床病理的关系研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）COX-2转录抑制作用逆转MDR1/P-gp介导卵巢癌紫杉醇耐药的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 正文 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（4）斑蝥素干预急性髓细胞性白血病端粒酶逆转录酶（hTERT）甲基化的研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 实验研究 |
| 一、实验材料 |
| (一) 主要仪器 |
| (二) 主要试剂 |
| 二、主要溶液的配制方法 |
| (一) DEPC水的配制 |
| (二) 无RNA酶水的配制 |
| (三) RPMI-1640培养基配制 |
| (四) 冻存液配制 |
| (五) 磷酸盐缓冲液(PBS) |
| (六) 无RNA酶75%乙醇的配制 |
| (七) 电泳缓冲液的配制 |
| 三、实验方法 |
| (一) NOD/SCID小鼠 |
| (二) HL-60细胞培养 |
| (三) 细胞的冻存 |
| (四) 细胞复苏 |
| (五) 细胞浓度调整 |
| (六) 斑蝥素的配制及应用 |
| (七) NOD/SCID小鼠预处理及造模 |
| (八) 一般情况记录 |
| (九) 骨髓涂片 |
| (十) 病理 |
| (十一) 外周血常规 |
| (十二) 骨髓单个核细胞的收集 |
| (十三) 细胞总RNA的提取 |
| (十四) 总RNA的测定 |
| (十五) RT-PCR一步法反应 |
| (十六) 细胞总DNA提取 |
| (十七) DNA修饰 |
| (十八) DNA扩增 |
| (十九) DNA电泳 |
| 四、统计方法 |
| 五、实验结果 |
| (一) 造模后小鼠的一般情况及生存时间 |
| (二) 病理结果 |
| (三) 造模后各组小鼠外周血常规统计结果 |
| (四) RT-PCR半定量检测HTERT MRNA表达情况 |
| (五) MSP法检测HTERT启动子甲基化 |
| 讨论 |
| 一、NOD/SCID小鼠 |
| (一) NOD/SCID小鼠的来源 |
| (二) SCID小鼠-人白血病模型的建立 |
| (三) SCID-人白血病模型的应用 |
| 二、端粒酶、端粒酶逆转录酶 |
| (一) 端粒 |
| (二) 端粒酶 |
| (三) HTERT基因的结构特点和意义 |
| (四) DNA甲基化与去甲基化 |
| (五) DNA甲基化与白血病 |
| (六) HTERT的甲基化调节 |
| (七) 端粒酶在白血病细胞中的表达 |
| 三、中医药对白血病的研究现状 |
| (一) 临床治疗方面 |
| (二) 实验研究 |
| 四、斑蝥素对恶性肿瘤的干预作用 |
| (一) 诱导肿瘤细胞凋亡 |
| (二) 抗肿瘤细胞的侵袭和转移 |
| (三) 逆转多药耐药 |
| (四) 直接作用于肿瘤干、祖细胞 |
| 五、实验结果及分析 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 论文着作 |
| 中文详细摘要 |
（5）水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性的影响及机制探讨（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 两种提取方法制备的水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞增殖抑制作用的对比研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株来源 |
| 1.2 药物及试剂 |
| 1.2.1 药物 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 试剂配制方法 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 制备水蛭超微粉 |
| 1.4.2 水蛭提取物的制备 |
| 1.4.3 细胞培养 |
| 1.4.4 MTT法检测水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用 |
| 1.4.5 细胞计数绘制生长曲线 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞增殖抑制作用的影响 |
| 2.2 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞形态及生长的影响 |
| 第二部分 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性及MDR1、bax mRNA表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株来源 |
| 1.2 药物及试剂 |
| 1.2.1 药物 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 试剂配制方法 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 水蛭提取物的制备 |
| 1.4.2 细胞培养 |
| 1.4.3 MTT法检测各组药物对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用 |
| 1.4.4 流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期 |
| 1.4.5 AO/EB荧光染色观察细胞凋亡形态 |
| 1.4.6 RT-PCR技术检测MDR1和bax mRNA的表达 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 水蛭提取物对5-Fu、ADM抑制HepG2细胞增殖作用的影响 |
| 2.2 HepG2细胞的形态变化 |
| 2.3 HepG2细胞的凋亡情况 |
| 2.4 HepG2细胞的周期变化 |
| 2.5 荧光显微镜下HepG2细胞的凋亡形态 |
| 2.6 水蛭提取物对HepG2细胞MDR1和bax mRNA表达的影响 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 中医医籍中对水蛭及含水蛭的方剂的记载 |
| 2 水蛭抗肿瘤的现代及临床实验研究 |
| 3 肿瘤细胞的多药耐药基因MDR1及促凋亡基因bax |
| 3.1 多药耐药基因MDR1 |
| 3.2 促凋亡基因bax |
| 4 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响 |
| 4.1 水蛭提取物提取方法对人肝癌HepG2细胞抑制增殖的差异性 |
| 4.2 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性的影响 |
| 4.3 水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞MDR1、bax表达的影响 |
| 5 进一步研究与展望 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 文献综述 |
| 附录2 攻读硕士学位期间的主要成果 |
（6）HIF-1α及MDR1 miRNA重组慢病毒干扰体系逆转结肠癌细胞多药耐药的研究（论文提纲范文）
| 英文简写缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 HIF-1α及MDR1 miRNA 重组慢病毒干扰体系逆转结肠癌细胞多药耐药的研究 |
| 前言 |
| 第一部分 HIF-1α与MDR1/P-gp 在结肠癌组织及细胞系中的表达及相关性研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 RNA 干扰沉默LoVo 细胞HIF-1α及MDR1/P-gp 表达的研究 |
| 分题一 HIF-1α及MDR1 miRNA 干扰质粒的构建及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 分题二 慢病毒载体介导的HIF-1α及MDR1 miRNA 干扰体系的构建及其功能评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 慢病毒载体介导的miRNA 干扰体系对结肠癌LoVo 细胞多药耐药逆转的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 照片 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 肿瘤多药耐药及其逆转的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 慢病毒载体介导RNAi 的研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间撰写和发表的文章 |
| 英文论着 |
（8）MBD1/mdr1信号转录调控胰腺癌多药耐药性的实验研究及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 胰腺癌多药耐药基因mdr1及其转录区域结合位点甲基化的测定及其意义 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 MBD1siRNA调控胰腺癌细胞株BxPC-3多药耐药性的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 外周血测定胰腺癌多药耐药基因及其甲基化水平的临床意义 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 胰腺癌和肿瘤多药耐药 |
| 发表论文 |
| 胰腺癌外周血mdr1及其转录区域结合位点甲基化的检测和临床意义 |
| 致谢 |
（9）淋球菌mtr耐药机制中IR区的作用（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究背景 |
| 第一部分 武汉地区淋球菌对6 种抗菌药物敏感性的监测 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 淋球菌mtr 系统的IR 区基因突变与其耐药性的关系 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 淋球菌株IR 基因突变与mtrC 基因表达的关系 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 博士期间发表的主要论文 |
| 致谢 |
四、多重逆转录-聚合酶链反应方法半定量检测多药耐药基因mRNA表达（论文参考文献）
- [1]长链非编码RNA HOTTIP作为ceRNA参与小细胞肺癌增殖和耐药的机制研究[D]. 孙艳芹. 南方医科大学, 2016(04)
- [2]卵巢癌耐药细胞与非耐药细胞差异表达基因的验证与结构和表型变化研究[D]. 唐兆前. 广西医科大学, 2010(08)
- [3]COX-2转录抑制作用逆转MDR1/P-gp介导卵巢癌紫杉醇耐药的研究[D]. 马雪莲. 广西医科大学, 2010(08)
- [4]斑蝥素干预急性髓细胞性白血病端粒酶逆转录酶（hTERT）甲基化的研究[D]. 申振涛. 山东中医药大学, 2010(03)
- [5]水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞化疗药物敏感性的影响及机制探讨[D]. 郭永良. 湖南中医药大学, 2009(S1)
- [6]HIF-1α及MDR1 miRNA重组慢病毒干扰体系逆转结肠癌细胞多药耐药的研究[D]. 丁震宇. 第三军医大学, 2008(03)
- [7]TRAIL及其受体的临床研究[J]. 席子明. 社区医学杂志, 2008(03)
- [8]MBD1/mdr1信号转录调控胰腺癌多药耐药性的实验研究及其临床意义[D]. 李骥. 复旦大学, 2007(06)
- [9]淋球菌mtr耐药机制中IR区的作用[D]. 张丽霞. 华中科技大学, 2007(05)
- [10]难治性癫患者外周血中MDR1基因的表达及临床意义[J]. 郑雪平,谭兰,宋敬卉,王雁,孙妍萍,朱琪秀. 中国神经精神疾病杂志, 2006(05)