一、肽段在肿瘤治疗应用中的展望（论文文献综述）
张金[1]（2021）在《嵌合肽纳米载药体系的构建及其在肿瘤精准治疗中的研究》文中提出肿瘤因其超高的死亡率和难以捉摸的特性,被认为是近几十年来最复杂的疾病之一。为此,科学家们在理解癌症发展机制和寻找高效的治疗策略上付出了巨大的努力。随着现代分子生物学的快速发展和对肿瘤生物学的深入研究,许多肿瘤特有的生理特性和具有特殊生理活性的多肽被发现。这些活性肽能与肿瘤组织过表达的抗体结合,能响应肿瘤组织中过表达的酶,也能直接靶向肿瘤细胞的亚器官,具有在分子和细胞水平上响应和调控肿瘤进程的能力。由于传统药物具有靶向效率低、毒副作用高,难以跨越复杂的生理障碍到达病灶部位等特点,常常造成了不理想的治疗结果和严重的副作用。将药物与这些活性肽结合而形成的功能分子（嵌合肽,chimeric peptide）能有效的改善药物的选择性,提高药物的活性,减低药物使用剂量。基于此,本文主要利用了一些具有特殊功能的多肽,构建了一些新型的,具有响应组装性质的嵌合肽载药体系。相较于传统的载药体系,这些纳米颗粒在肿瘤微环境中能发生再组装,改变药物的结构及理化性质,为肿瘤治疗和诊断提供了新思路。其主要内容如下:1.基于肿瘤微酸响应的可组装纳米颗粒用于增强肿瘤细胞摄取和光动力治疗纳米颗粒的几何形状在细胞内化过程中起着重要作用。然而,通过形貌变化来提高药物选择性摄取却鲜有报道。通过像AEAEAKAKAEAEAKAK多肽序列上修饰2,3-二甲基马来酸酐基团（DMA）,我们设计了一个能响应肿瘤胞外酸性,具有几何形状转变嵌合肽。该嵌合肽分子在正常的生理条件下能自组装成球形的纳米颗粒。然而在肿瘤酸性微环境下,该嵌合肽上带负电酸敏感DMA基团将会分离。随后,失去DMA的AEAEAKAKAEAEAKAK多肽能通过离子互补现象再组装成为棒状的纳米颗粒。体外和体内研究表明,这种由酸性触发的几何形状转变能加速肿瘤细胞对嵌合肽的摄取,提高嵌合肽在肿瘤组织中积累,增强光动力治疗并最小化副作用。这些结果表明,通过响应性多肽组装来改变几何形状的方法也许能为靶向给药提供一个新思路。2.基于MMP-2酶响应的可组装嵌合肽用于双重放大MRI及精准光动力治疗传统Gd3+基造影剂质子通常具有弛豫效率低、代谢清除快、敏感性差的问题。第二部分内容主要设计了一种间基质金属蛋白酶-2（MMP-2）响应的嵌合肽。该嵌合肽可在生理条件下自组装成球形纳米颗粒,增强造影剂的r1值到28.17 m M-1s-1。然而一旦达肿瘤部位,肿瘤区域过表达的MMP-2可特异性水解嵌合肽,驱动嵌合肽间β-折叠的形成,实现球到纤维的转变。这种转化增强了嵌合肽在肿瘤组织中的积累以及造影剂的弛豫率,导致其r1显着升高至51.52 m M-1s-1,实现了双重放大肿瘤MRI及精准的光动力治疗。通过这种由肿瘤微环境触发的组装策略来特异性的提高肿瘤MRI的策略应该能在肿瘤靶向成像和光疗方面展现巨大的应用潜力。3.基于肿瘤/Caspase-3双重响应的Mn O2-嵌合肽复合物用于缓解PDT后肿瘤乏氧光动力疗法（PDT）是在光照的条件下将氧气转化为活性氧杀伤肿瘤细胞。因此在治疗肿瘤同时会消耗大量氧气,导致恶劣的肿瘤缺氧环境,加剧肿瘤的发展。在本章中,我们构建一个肿瘤/Caspase-3双重响应的Mn O2-嵌合肽纳米复合材料（MPPa-DP）。这个复合材料能在肿瘤部位释放出嵌合肽（PPa-DP）,并在凋亡细胞中出现响应性自组装,改变药物分子的光活性,从而实现一个新型的PDT策略-有氧PDT（即在PDT前后肿瘤组织处于有氧状态）。在生理条件下,这种纳米复合材料具有较低的光活性。而在H2O2富集的肿瘤微环境中,纳米复合材料可以与过表达的H2O2发生反应生成O2,并释放出高活性的嵌合肽PPa-DP,提高了肿瘤含氧量,有利于肿瘤的PDT。重要的是,当PDT介导细胞凋亡时,PPa-DP能被凋亡酶caspase-3水解,诱导嵌合肽的分子聚集,降低光活性和O2的消耗,避免了剩余氧气消耗在凋亡细胞上。通过免疫荧光和免疫组化实验表明,该纳米复合材料能有效地下调乏氧标志物HIF-1α和VEGF的表达,为缓解由光动力治疗导致的不良副作用提供了思路。4.p H/Caspase-3双重响应的可组装纳米探针在核磁评估p H和治疗响应中的研究对于疾病做出准确,高穿透,无侵袭性的诊断和实时治疗反馈对于疾病控制有非常重大的意义。在第四部分容内中,我们在第三章的基础上构建了一个p H/Caspase-3双重响应的多功能核磁探针（PDDP）用于p H和治疗响应的评估。首先,该嵌合肽纳米颗粒中的DEVD多肽序列侧基上的羧基在正常生理条件下（p H 7.4）是带负电荷的。这些羧酸根负离子的亲水性和电荷排斥作用会使PDDP自组装成一个较小的纳米颗粒。然而随着p H的降低,羧酸根负离子会逐渐质子化为中性的、疏水的羧酸。疏水性的增强和静电排斥力的减少会驱动PDDP重组装成为一个较大尺寸的纳米颗粒。重要的是,这个组装过程能与PDDP的弛豫强度相关,能用于p H的核磁评估。其次,PDDP中DEVD多肽序列也能被凋亡标志物,Caspase-3,特异性水解,导致一个更强健的聚集和更高的弛豫率,实现对caspase-3酶的核磁评估。体外结果表明PDDP能对p H和caspase-3酶做出响应,改变其纳米结构和弛豫率,应该能用于体内p H的监测和治疗性响应的评估。
陈文彦[2]（2021）在《牛奶来源外泌体的糖组学及糖蛋白质组学研究》文中进行了进一步梳理外泌体是由各种类型细胞分泌的纳米级别（30-150 nm）的胞外囊泡,通过转运miRNA、mRNA、DNA和蛋白质等功能活性物质,在细胞与细胞之间的通讯中发挥着重要作用。牛奶来源外泌体不仅易于获取、价格适中还具有高生物相容性、长循环半衰期及低免疫原性等特性,已被广泛应用于纳米药物递送系统。为了更好地研究牛奶来源外泌体蛋白质及蛋白质翻译后修饰在靶向载药应用中的功能,我们需要对外泌体中蛋白质及糖基化修饰进行解析。本论文建立了一套用于检测牛奶中不同组分（牛奶来源外泌体及乳清）的糖组及糖蛋白质组的方法。首先,采用等电点沉淀法去除乳清中的高丰度酪蛋白,再利用超高速离心法获得外泌体。随后分别应用酶解法和化学法释放外泌体及乳清中的N-/O-连接糖链,再利用不同的衍生化策略对糖链进行修饰,最后通过MALDI-TOF-MS质谱检测糖链。本论文从牛奶样品中共鉴定到13种游离寡糖、44种O-连接糖链和94种N-连接糖链。其次,我们发现了两种唾液酸化（F0H5N3S0G1和F0H4N4S0G1）和一种具有Lacdi NAc结构（F0H5N8S0G0）的N-连接糖链,可作为牛奶来源外泌体的潜在生物标志物,用于快速鉴定牛奶来源外泌体。我们还发现牛奶中的糖链结构主要以岩藻糖化及唾液酸化修饰糖链为主,此类糖链结构不仅可以作为外泌体的识别位点,促进包裹药物的外泌体快速转移并结合在病灶区域,还可以在传递的过程中抵抗病原菌。另外,我们利用一步法分离纯化复杂样品中糖肽及非糖肽的技术,并通过HPLC-ESI-MS/MS质谱检测,可同时获得多肽及位点特异性糖基化修饰信息。本研究从牛奶来源外泌体中共鉴定到1223个蛋白,包括86种糖蛋白、767个独特的完整糖肽、113个特征性糖基化位点及80种N-连接糖链。其中有95个糖基化位点是首次在牛中检测到的。利用优化的方法我们对牛乳、羊乳及猪乳来源外泌体中的糖蛋白进行分析,分别鉴定到136、82及125种糖蛋白,匹配到258、259和247种N-连接糖链。这些糖蛋白均参与补体凝血级联反应,对于介导炎症、免疫调节和清除免疫复合物等具有重要意义。
吴静成[3]（2021）在《基于深度学习的肿瘤新生抗原预测方法研究》文中研究表明癌症已经成为危害人类健康的重要疾病,近年来,以肿瘤免疫检验点抑制剂、抗体偶联药物、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法和个体化肿瘤疫苗为代表的肿瘤免疫治疗表现出前所未有的抗肿瘤治疗效果,成为抗肿瘤研究和临床治疗的热点。而肿瘤抗原靶点的选择是肿瘤免疫治疗能否成功的关键因素。肿瘤新生抗原被认为是肿瘤免疫治疗的理想靶标,然而如何准确进行肿瘤新生抗原的鉴定仍是一个难题。本论文利用深度学习等新一代人工智能算法对肿瘤新生抗原形成过程中关键的生理过程,如多肽和主要组织相容性复合体（MHC）分子相互作用,多肽-MHC复合体（pMHC）与T细胞受体（TCR）相互作用进行了生物信息学预测方法研究,并通过肿瘤新生抗原预测软件构建、大规模肿瘤样本肿瘤新生抗原分析和肿瘤新生抗原数据库构建等方面开展了系统的肿瘤新生抗原预测研究。研究内容主要包括以下三部分:首先,本论文同时考虑了突变肽呈递的可能性和pMHC的潜在免疫原性,提出了一种基于循环神经网络（RNN）的新方法DeepHLApan用于高可信度新生抗原预测。我们证明了结合模型可以在未训练的MHC分型上获得良好的性能,并且在最新的IEDB基准数据集和独立的质谱数据集上具有与其他公认的工具相当的性能。在从Ko（?）alo（?）lu-Yal（?）（?）n等人收集的新生抗原数据集上使用免疫原性模型,我们证明了预测的免疫原性评分可以显着提高新生抗原的预测精度。最后,将DeepHLApan应用于能引起T细胞反应的突变上的结果表明,在每百万reads数中的转录本数（TPM）>2的情况下,其预测性能可与现有最佳的EDGE模型相媲美。其次,本论文对pMHC与TCR之间的相互作用进行了研究。针对四个结合TCR数量超过1000的pMHC复合体（A0301＿KLGGALQAK,B0801＿RAKFKQLL,A1101＿AVFDRKSDAK和A0201＿GILGFVFTL）的结合TCR进行序列特征分析发现,A0201＿GILGFVFTL结合TCR的序列特征最显着,以之为基础构建的pMHC限制性TCR预测模型具有较好的性能。该pMHC限制性模型随后被应用于指导TCR亲和力的改造。我们分别预测了突变对TCR-pMHC亲和力的影响,预测结果表明,单点突变中有6个突变可提高复合物的亲和力,且其中一个突变得到了实验的验证。除了pMHC限制性模型外,我们进一步探讨了HLA-A02:01分型限制性TCR预测模型的构建及应用。HLA-A02:01分型结合TCR的TRAV和TRBV基因频率分布显示其序列特征不如A0201＿GILGFVFTL结合TCR显着,但以该数据构建的HLA-A02:01分型限制性模型,在VDJdb数据库中799条阳性数据集上的性能优于基于A0201＿GILGFVFTL的pMHC限制性模型。在具有T细胞单细胞转录组数据的肿瘤样本上的应用表明,HLA-A02:01分型限制性模型结合DeepHLApan软件可以对肿瘤样本的肿瘤新生抗原进行预测,并能得到可能与肿瘤新生抗原相结合的对应TCR。最后,本论文利用开发的肿瘤新生抗原预测算法,针对肿瘤样本基因组数据,进行了软件构建、肿瘤新生抗原分布分析、数据库开发等工作。首先,我们利用开发的肿瘤新生抗原预测方法DeepHLApan与一系列肿瘤体细胞突变鉴定软件构建了一站式肿瘤新生抗原预测软件TSNAD V2.0,其可提供从全外显子组或全基因组出发预测肿瘤新生抗原的功能,是第一个提供完整流程的一站式集成软件,为肿瘤新生抗原预测的广泛应用提供了重大帮助。除了提供点突变（SNV）和小片段插入缺失（INDEL）来源的肿瘤新生抗原预测外,TSNAD V2.0还可在提供转录组测序数据的前提下进行基因融合（Fusion）来源的肿瘤新生抗原预测。为了方便TSNAD V2.0软件的使用,我们同时提供了本地安装的软件包和网络在线工具。利用肿瘤新生抗原筛选联盟（TESLA）提供的临床验证数据,验证了TSNAD V2.0的实际预测效果。分析结果表明,在23个既被TSNAD V2.0预测为高可信度肿瘤新生抗原组合又由TESLA验证的多肽-MHC组合中,有5个（21.7%）被验证是具有免疫原性的,显着高于TESLA在综合了28个软件的结果后从608个组合中得到37个免疫原性的组合（6.1%）的比例,体现了TSNAD V2.0的预测可靠性。我们进一步利用TSNAD V2.0对TCGA数据库中的大规模肿瘤样本进行SNV,INDEL和Fusion来源的肿瘤新生抗原分析。基于大规模肿瘤样本的肿瘤新生抗原分析结果,我们构建了肿瘤新生抗原数据库TSNAdb,该数据库存储了TCGA 7748例样本SNV来源的肿瘤新生抗原预测结果,研究者们可以借用该数据库研究不同肿瘤类型中SNV来源肿瘤新生抗原的分布情况;数据库还提供了高频突变（所有样本中至少发生3次）和高频MHC分型对应的肿瘤新生抗原预测结果,用于共有新生抗原的分析。综上所述,本论文从肿瘤新生抗原发挥作用过程中的多肽-MHC相互作用,TCR-pMHC相互作用两个关键步骤出发,利用深度学习算法构建了肿瘤新生抗原预测模型,并探讨了其在临床中的应用,为基于肿瘤新生抗原的免疫治疗提供了坚实的基础。
鲍赫鑫[4]（2021）在《酸敏感抗癌组合肽的设计、合成及抗肿瘤活性研究》文中进行了进一步梳理癌症是全世界发病率和死亡率的主要来源,尽管抗癌药物的研发取得了重大进展,但癌症仍然是全球人口死亡的主要原因之一。目前,传统化疗仍是肿瘤治疗的主要策略之一。在抗癌药物研究开发中,具有抗肿瘤活性的生物活性肽—抗癌肽（Anticancer peptides,ACPs）,由于阳离子、两亲性的结构特点和多重的抗癌机制,使其具有良好的抗癌作用、增强化疗药物效果以及降低多药耐药性的优势。尽管如此,抗癌肽的研究和应用仍面临许多挑战,如稳定性、选择性、毒性等问题。如何更好地提高抗癌肽的选择性、降低毒副作用成为我们主要关注的方向。由于肿瘤细胞代谢异常,许多实体肿瘤和正常组织之间的一个主要区别是有一个更酸性的细胞外环境。因此,这种特异的肿瘤组织酸性环境可以作为提高抗癌肽选择性的一个有效靶点。组氨酸中的咪唑基p Ka值约为6.5,因此在酸性环境下,会质子化带正电荷,而在生理环境下带微负电,可以根据这一特征设计含组氨酸的pH靶向肽。LK（LKKLLKLLKKLLKL）是一条带有正电荷的α-螺旋肽,具有较强的抗肿瘤活性,但其缺乏选择性。为提高LK的抗肿瘤选择性,我们以肿瘤酸性微环境为靶点,利用特异性的阴离子屏蔽肽LE,通过二硫键与LK共轭连接,构建酸敏感抗癌组合肽,使其在正常条件pH下由于静电吸引LK与阴离子屏蔽肽紧密结合,呈闭合状态,母体肽LK活性被屏蔽;在肿瘤酸性条件下,由于组氨酸与谷氨酸的电荷转变,两分子产生静电排斥作用,分子打开,母体肽从阴离子屏蔽肽上解离下来,活性被激活,进而发挥抗肿瘤作用。在本研究中,设计合成了3条阴离子屏蔽肽LE-1,LE-2,LE-3,通过二硫键共轭连接反应,最终获得组合肽LK-LE-1,LK-LE-2,LK-LE-3。我们对新设计合成的组合肽的二级结构、酸敏感抗肿瘤活性、毒性、稳定性及相关机制进行了研究探讨。结果表明,LK与阴离子屏蔽肽共轭后形成的组合肽,其二级结构与LK相比并没有发生明显变化,均呈现标准的α-螺旋结构。相比于母肽LK,组合肽均表现出明显的pH依赖的抗肿瘤活性,有效提高了LK的选择性。乳酸脱氢酶（LDH）释放,PI染色,扫描电镜实验结果表明组合肽与LK均通过破膜机制发挥抗肿瘤活性。溶血实验结果表明,组合肽的溶血率与LK相比降低7-14倍,显着提高了LK的安全性。并且血清稳定性实验表明新设计的组合肽在血清中的稳定性明显高于母肽LK。本文通过一系列实验研究,证明了利用阴离子屏蔽肽LE,通过二硫键与LK共轭连接,构建酸敏感抗癌组合肽的改造方式成功地提高了LK的抗肿瘤选择性,安全性和酶解稳定性。这种酸敏感抗癌组合肽的设计为提高抗癌肽的选择性提供了一种新的思路。
金延玲[5]（2021）在《乳腺癌循环肿瘤细胞生物学特性及其在血液中存活的机制研究》文中研究指明肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要因素,目前对于肿瘤转移的分子机制仍未被阐明。循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）是脱离于肿瘤原发部位和远处转移灶进入血液中的肿瘤细胞,在远处靶器官滞留形成肿瘤转移灶。循环肿瘤细胞在血道转移中扮演了重要角色,研究循环肿瘤细胞生物学特性对于阐明肿瘤转移分子机制至关重要。目的:本课题以乳腺癌循环肿瘤细胞和黑色素瘤循环肿瘤细胞作为研究对象,体内外实验研究循环肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移、化疗药物敏感性和血液中的存活情况等生物学特性,探讨循环肿瘤细胞在血液中存活的机制;进一步阐明循环肿瘤细胞在肿瘤血道转移中的作用和相关分子机制。方法:1.4T1乳腺癌细胞建立乳腺癌原位肿瘤模型,B16黑色素瘤细胞建立黑色素瘤实验性肺脏转移模型;Ficoll密度梯度离心方法分离循环肿瘤细胞,并命名为4T1-CTCs和B16-CTCs;分别用免疫组化染色、RT-PCR检测上皮标记物和体内致瘤实验鉴定CTCs。蛋白质免疫印迹法检测CTCs中E-cadherin和Vimentin表达,流式细胞术检测CTCs上皮标记物Ep CAM和间叶标记物Vimentin阳性率,鉴定CTCs EMT不同表型。2.MTT实验和细胞克隆形成实验检测CTCs增殖和克隆形成能力;流式细胞术检测CTCs周期分布情况;蛋白质免疫印迹法检测CTCs周期相关蛋白CDK6表达;体内致瘤实验检测CTCs生长情况;免疫组织化学方法检测组织中Ki-67表达情况;MTT法检测CTCs对化疗药物敏感性。3.划痕实验和Transwell迁移实验检测CTCs迁移能力;Transwell侵袭实验检测CTCs侵袭能力;激光共聚焦显微镜检测肿瘤细胞CTCs骨架蛋白F-actin分布情况;肺脏转移实验检测CTCs肺转移情况。4.悬浮培养和流体剪切力处理细胞后检测细胞EMT标记物（E-cadherin,Ep CAM和Vimentin）表达情况。5.定量iTRAQ蛋白组学分析乳腺癌CTCs差异蛋白,使用GO数据库、KEGG数据库和String网站进行生物信息学分析;Kaplan-Merier Plotter数据库（http://kmplot.com/analysis）分析MT2与乳腺癌患者预后之间的关系;String数据库在线分析MT2与凋亡自噬相关蛋白之间的相互作用,Gene MANIA数据库分析MT2与凋亡相关信号通路相关蛋白之间的相互作用。6.流式细胞术检测CTCs血液存活情况、细胞失巢凋亡抵抗能力;剪切力诱导凋亡实验检测细胞对流体剪切力抵抗情况;Transwell趋化外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）实验检测细胞对CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞的趋化能力;流式细胞术检测细胞表面免疫逃逸相关蛋白PD-L1和CD47表达。7.蛋白质免疫印迹方法和细胞免疫组化方法检测CTCs中MT2表达水平;慢病毒干扰CTCs MT2蛋白,蛋白质免疫印迹方法检测慢病毒干扰效率、凋亡相关蛋白caspase-3和自噬相关蛋白LC3 I及LC3 II;流式细胞术检测PI阳性细胞百分比。结果:1.分离和鉴定不同EMT表型的4T1乳腺癌CTCs:建立4T1乳腺癌原位肿瘤模型30天,心脏采血后,使用Ficoll密度梯度离心分离血液中CTCs,从18只小鼠血液中分离出以上皮细胞为主的CTCs和以间叶细胞为主的CTCs,本实验中以4T1CTC-1作为上皮细胞为主CTCs的代表,4T1CTC-2作为间叶细胞为主CTCs的代表。（1）通过细胞标记物鉴定4T1乳腺癌CTCs:4T1CTC-1中Ep CAM+Vimenin+细胞占85.8%,4T1CTC-2中Ep CAM-Vimentin+细胞占69.4%;RT-PCR结果显示4T1CTC-1高表达上皮标记物（E-cadherin,Ep CAM和CK）（p<0.05或p<0.001）,4T1CTC-2低表达上皮标记物（E-cadherin,Ep CAM和CK）（p<0.001）;蛋白质免疫印迹法结果显示4T1CTC-1高表达E-cadherin和Vimentin（p<0.05）,4T1CTC-2低表达E-cadherin而高表达Vimentin（p<0.001）。证实分离的细胞来源于4T1乳腺癌,且具有不同EMT表型。（2）通过皮下成瘤能力鉴定乳腺癌CTCs:体内致瘤实验显示4T1CTC-1和4T1CTC-2均可形成肿瘤,且肿瘤组织HE染色结果显示4T1CTC-1和4T1CTC-2形成的肿瘤组织核大深染、异型明显,并且可见病理性核分裂像。皮下致瘤实验表明4T1CTCs具有致瘤能力,4T1CTC-1和4T1CTC-2均为肿瘤来源细胞。2.分离和鉴定B16黑色素瘤CTCs:使用Ficoll密度梯度离心方法分离循环肿瘤细胞,HMB45免疫组化染色B16CTCs阳性;体内致瘤实验显示B16CTCs可形成肿瘤,且肿瘤组织HE染色结果显示B16CTCs形成的肿瘤组织核大深染、异型性明显、可见病理性核分裂像。证实分离的细胞来源于B16黑色素瘤。3.CTCs对化疗药物敏感性降低:4T1CTCs表现为对表柔比星化疗药物敏感性降低（p<0.01或p<0.001）,B16CTCs表现为对顺铂化疗药物敏感性降低（p<0.05,p<0.01或p<0.001）。4.CTCs表现为体外增殖缓慢,体内肿瘤生长缓慢:与4T1原位细胞比较,4T1CTCs表现为慢的体外增殖、克隆形成和体内肿瘤生长能力（p<0.01或p<0.001）;4T1CTC-2体外增殖、克隆形成和体内肿瘤生长能力均较4T1CTC-1慢（p<0.05,p<0.01或p<0.001）;与4T1原位细胞比较,4T1CTC-1中G1期细胞多且CDK6表达低（p<0.05）。与B16亲本细胞比较,B16CTCs表现为慢的体外增殖、克隆形成和体内肿瘤生长能力,B16CTCs细胞中G1期细胞多且CDK6表达低（p<0.05或p<0.001）。5.CTCs表现为弱的侵袭迁移能力,但具有一定的肺转移能力:与4T1原位细胞比较,4T1CTCs表现为弱的体外侵袭能力和体内肺转移能力（p<0.01或p<0.001）;4T1CTC-2的体外侵袭迁移能力和体内肺转移能力均较4T1CTC-1强（p<0.01或p<0.001）。与B16亲本细胞比较,B16CTCs侵袭迁移能力弱（p<0.001）。6.悬浮培养对细胞EMT标记物无明显影响（p>0.05）,流体剪切力可以明显降低细胞上皮标记物E-cadherin和Ep CAM表达（p<0.01或p<0.001）,增加细胞间叶标记物Vimentin表达（p<0.05）。7.定量iTRAQ蛋白组学分析显示:与原位细胞比较,4T1CTC-1中有1483个蛋白下调,791个蛋白上调（fold-change<-1.5 or>1.5,p<0.05）;与原位细胞比较,4T1CTC-2中有179个蛋白下调,233个蛋白上调（fold-change<-1.5 or>1.5,p<0.05）;与4T1CTC-2比较,4T1CTC-1中有1473个蛋白下调,1006个蛋白上调（fold-change<-1.5 or>1.5,p<0.05）;4T1CTC-1中差异蛋白GO（生物学进程）主要富集在防御反应的正向调节,起始免疫反应的正向调节,41T1CTC-2中差异蛋白GO（生物学进程）主要富集在上皮细胞分化,细胞与细胞之间的连接和细胞对细胞因子刺激的反应。8.乳腺癌CTCs表现为强的血液存活能力:与4T1原位细胞和4T1肺脏转移细胞比较,4T1CTCs在血液中存活细胞数目多,表现为强的血液存活能力（p<0.05）、强的失巢凋亡抵抗能力和流体剪切力诱导凋亡抵抗能力（p<0.01）。9.4T1CTCs具有免疫逃逸表型:与4T1原位细胞和4T1肺脏转移细胞比较,4T1CTCs对CD4T淋巴细胞趋化能力强（p<0.05）,对CD8T淋巴细胞趋化能力弱（p<0.05）;与4T1原位细胞和4T1肺脏转移细胞比较,4T1CTCs中CD47表达增高（p<0.001）,PD-L1表达无明显差异（p>0.05）。10.4T1CTCs表现为高的基础自噬水平和低的凋亡水平（p<0.05或p<0.01）,且抑制4T1CTCs自噬水平可增加细胞凋亡率,抑制细胞血液存活（p<0.001）。4T1CTCs高表达MT2（p<0.01）,抑制MT2可以降低4T1CTCs自噬水平（p<0.05）、增加凋亡水平（p<0.05）和抑制细胞存活（p<0.001）;抑制MT2联合抑制细胞自噬明显抑制细胞存活（p<0.001）。结论:1.成功分离了4T1乳腺癌CTCs和B16黑色素瘤CTCs。2.4T1乳腺癌CTCs表现为不同EMT表型,提示4T1乳腺癌CTCs具有异质性。3.CTCs表现为对顺铂和表柔比星化疗药物敏感性降低、体外增殖和体内生长缓慢、体外侵袭能力和体内肺脏转移能力弱,但血液存活能力强的生物学特性。4.流体剪切力可诱导CTCs发生EMT。5.定量iTRAQ蛋白组学分析显示不同EMT表型CTCs在蛋白水平和功能富集存在明显差异。6.4T1CTCs在血液中的存活能力与细胞具有强的失巢凋亡抵抗能力、剪切力诱导凋亡抵抗能力和免疫逃逸表型有关,MT2通过调控细胞自噬和凋亡介导CTCs存活。
罗宏涛[6]（2020）在《LIF对食管鳞癌中不同LET射线辐射应答的作用及机制研究》文中认为背景与目的食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）对低线性能量传递（Linear energy transfer,LET）X射线中度敏感,放疗后局部控制率低,极易出现局部复发和远处转移。碳离子为高LET射线,具有优于低LET射线的物理学和放射生物学特性,对低LET X射线辐射不敏感或辐射抗拒肿瘤具有较好的治疗效果。白血病抑制因子（Leukaemia inhibitory factor,LIF）是一种多功能细胞因子,通过白血病抑制因子受体（LIFR）和糖蛋白（gp）-130传递信号,激活STAT3信号通路,刺激肿瘤的生长、增殖和转移,与化疗耐药和放疗抗拒相关。本研究拟采用低LET X射线和高LET碳离子射线辐照食管鳞癌细胞,分析LIF对食管鳞癌细胞经不同LET射线辐照后生物学行为的影响并探讨其发挥作用的分子机制,进一步为高LET碳离子治疗ESCC提供理论基础。方法1.X射线对ESCC细胞辐射生物学行为影响的研究:0、1、2和4 Gy X射线辐照ECA109和KYSE150细胞,采用克隆存活实验检测各剂量X射线对两种细胞存活情况的影响,CCK8法检测各剂量X射线对两种细胞在辐照后24、48和72 h增殖活性的影响,流式细胞术检测各剂量X射线对ECA109和KYSE150细胞辐照后24和48 h凋亡和细胞周期的影响,划痕和Transwell实验检测2 Gy X射线辐照ECA109细胞后48 h对细胞迁移和侵袭的影响,免疫荧光共聚焦实验检测2 Gy X射线辐照ECA109细胞后48 h对γH2AX蛋白的表达的影响,Western blot检测2 Gy X射线辐照ECA109细胞后48 h对Bax,Bcl-2和γH2AX蛋白表达的影响。2.ECA109细胞中辐射抗性差异蛋白分子的筛选:根据上一步实验结果,选用2 Gy X射线辐照后培养48 h和未被辐照过的ECA109细胞两组样本,利用TMT蛋白定量技术进行蛋白组学检测,结合生物信息学方法对所得的结果经过差异分析,筛选得到显着差异的LIF蛋白分子。3.ESCC放疗患者血清中LIF的临床意义:采用ELISA检测60例ESCC患者放疗前后血清LIF浓度变化,并与30例健康者血清LIF浓度对照,观察血清LIF浓度变化与ESCC患者临床病理特征、疾病预后之间的关系。4.LIF通过靶向STAT3在食管鳞癌细胞中生物学效应的探索:采用si RNA技术下调ECA109细胞中LIF分子后采用克隆形成实验,CCK8试验、凋亡实验、迁移和侵袭实验,观察LIF对ECA109细胞克隆形成、增殖、凋亡和转移生物学行为的影响;利用RT-PCR技术和Western blot检测ECA109细胞中LIF和STAT3的表达情况。5.LIF通过STAT3信号通路调控食管鳞癌细胞对碳离子的辐射应答效应及分子机制研究:0、1、2和4 Gy碳离子辐照ECA109细胞,采用克隆存活实验检测各剂量碳离子对ECA109细胞存活情况的影响,CCK8法检测各剂量碳离子辐照ECA109细胞后24、48和72 h对细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测各剂量碳离子辐照ECA109细胞后24和48 h对细胞凋亡和细胞周期的影响,划痕和Transwell实验检测碳离子辐照ECA109细胞后48 h对迁移和侵袭的影响,实时荧光定量PCR检测碳离子辐照后ECA109细胞LIF,STAT3,MMP2,和E-cadherin m RNA表达情况,Western blot检测碳离子辐照后ECA109细胞LIF,STAT3,MMP2和E-cadherin蛋白表达情况。结果1.不同剂量X射线对ECA109和KYSE150细胞的生物学行为影响具有差异,与0 Gy组比较:2 Gy X射线辐照后48 h,ECA109细胞的增殖无显着抑制（p>0.05）,而KYSE150细胞增殖被显着抑制（p<0.05）;ECA109细胞在4 Gy辐照后48h细胞周期发生阻滞（p<0.05）,而KYSE150细胞在2和4 Gy辐照后48 h均出现细胞周期阻滞（p<0.05）;ECA109细胞经4 Gy辐照后48 h细胞凋亡显着增加（p<0.05）,而KYSE150细胞在2和4 Gy辐照后48 h细胞凋亡均显着增加（p<0.05）;2 Gy X射线对ECA109细胞侵袭和迁移的影响无显着变化（p>0.05）;2 Gy组ECA109细胞γH2AX焦点差异有统计学意义（p<0.05）;Bax,Bcl-2和STAT3蛋白表达量变化无明显差异（p>0.05）。2.本研究选用2 Gy X射线辐照后48 h的ECA109细胞行蛋白组学检测分析,获得差异表达蛋白399个（215个下调,184个上调）,其中LIF的表达差异显着（p=0.0003）,并且通过GO和KEGG通路富集分析显示LIF参与STAT3信号通路。3.临床血清样本检测结果显示:ESCC患者血清LIF浓度放疗前后分别为0.5224±0.1983μg/ml和0.3861±0.1506μg/ml,均高于健康对照者（0.3233±0.0985μg/ml）（p<0.05）;ESCC患者血清LIF浓度与肿瘤T分期、N分期、临床分期、组织学分级具有相关性（p<0.05）;13例患者放疗后血清LIF浓度较放疗前升高,47例患者放疗后血清LIF浓度较放疗前降低,血清LIF浓度升高组和下降组在随访期内（36个月）局部复发率分别为69.2%（9/13）和34.0%（16/47）,（p=0.023）;两组患者肿瘤远处转移率分别为53.8%（7/13）和23.4%（11/47）（p=0.034）。两组患者1、2、3生存率分别为76.9%、46.2%、30.7%和85.1%、66.0%、46.8%（p=0.048）。4.敲低ECA109细胞中LIF结果显示:下调LIF可诱导ECA109细胞凋亡,抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,与对照组比较,差异显着（p<0.05）。同时,下调LIF可降低ECA109细胞中STAT3的表达量（p<0.05）。5.不同剂量碳离子辐照ECA109细胞结果显示:与0 Gy组比较,2和4 Gy碳离子可诱导ECA109细胞凋亡,阻滞细胞周期在G2期,抑制ECA109细胞增殖、迁移和侵袭能力（p<0.05）。转录和翻译水平检测结果显示:2和4 Gy碳离子可显着下调ECA109细胞中LIF、p-STAT3、STAT3和MMP2表达量,上调E-cadherin表达量（p<0.05）。结论1.2 Gy X射线对食管鳞癌ECA109细胞增殖和转移的抑制作用不显着,辐照后细胞中γH2AX表达显着上调,STAT3表达变化不显着。2.LIF在2 Gy X射线辐照后的食管鳞癌ECA109细胞中表达下调;血清LIF浓度与ESCC患者局部复发、远处转移和预后具有相关性。3.食管鳞癌ECA109细胞中低表达的LIF通过靶向STAT3分子,介导STAT3信号通路调控食管鳞癌ECA109细胞的生物学行为。4.高LET碳离子通过下调食管鳞癌ECA109细胞中的LIF,诱导STAT3信号通路中相关分子的表达,从而调控食管鳞癌ECA109细胞的增殖和转移。
袁日明[7]（2020）在《天然冰片纳米体系的设计及其在肿瘤治疗方面的应用》文中认为癌症作为非传染性慢性疾病,是威胁人类生命健康的三大杀手之一,已成为全人类亟待解决的公共卫生问题。其中,肺癌发病率和死亡率在近50年不断地迅速上升,已经被卫生部列为癌症防治的重点。靶向治疗和免疫治疗被认为是肺癌有效的治疗手段。其中,吉非替尼（Gefitinib,GFT）是有效靶向非小细胞肺癌（NSCLC）表皮生长因子（EGFR）的药物。然而,GFT产生的耐药性导致其癌症治疗效果减弱,同时引起机体毒性,最终影响GFT的临床使用。自然杀伤细胞（Natural Killer Cell,NK）免疫疗法对治疗NSCLC具有较高的潜力。但由于肿瘤微环境的影响,NK细胞对肿瘤的识别与杀伤能力下降,导致治疗效果不佳。因此,开发GFT和NK细胞免疫治疗的增敏剂是提高肺癌治疗效果的重要策略。近年来,人们发现天然冰片（Natural Borneol,NB）能增强抗肿瘤药物对癌症的治疗效果。然而,由于NB易升华、水溶性极差等缺点,NB的进一步应用受到了限制。目前,纳米技术在生物医药领域的进展飞快,为提高和拓展药物的药用价值提供了新策略。其中,水包油（Oil in water,O/W）纳米乳能有效提高脂溶性药物的溶解性,增强药物的细胞吸收和生物利用率。在此,我们采用简便的高压均质方法合成O/W冰片纳米粒子（NBNPs）,增强NB的稳定性和水溶性,并联合GFT以及NK细胞应用于肺癌的治疗。具体研究内容如下:1.合成水包油NBNPs纳米体系并探究其对抗NSCLC药物GFT的增敏作用。实验结果显示,NBNPs在A549非小细胞肺癌和WI38正常胚肺成纤维细胞之间具有良好的选择性杀伤作用。相比于NB,NBNPs更能增强GFT的细胞吸收和细胞毒性。蛋白组学结果显示,NBNPs能特异性识别A549肺癌细胞中的8种靶标蛋白,从而增强NBNPs在A549细胞和WI38细胞之间的选择性杀伤作用。而NBNPs对GFT的增敏作用主要通过特异性结合并抑制EHD1表达,诱导产生FADD凋亡信号,引起了癌细胞显着凋亡。安全性评价结果显示,NBNPs联合GFT治疗对机体并未出现明显的毒副作用。此外,NBNPs能降低GFT对肝脏的毒性。2.我们拓展了NBNPs在增敏NK细胞治疗NSCLC方面的研究。发现NBNPs能够增敏不同病人NK细胞的抗肿瘤活性,提高NK细胞在A549肿瘤球中的渗透能力。机制研究表明NBNPs与NK细胞联合使用会增强A549细胞中ULBP1和ULBP3的m RNA表达量,有利于提高免疫反应,促进NKG2D配体结合NK细胞的NKG2D受体,从而增强抗肿瘤效果。
刘金玉[8]（2020）在《疏肝凉血方调控免疫代谢抗乳腺癌的药理机制研究》文中研究说明乳腺癌发生发展与免疫状态密切相关,机体免疫监视功能下降,免疫抑制增强,促进肿瘤免疫逃逸,进而促进乳腺癌发展。免疫状态受代谢调控,其中,吲哚胺2,3双加氧酶1（Indoleamine-2,3-dioxygenase-1,IDO1）介导的色氨酸代谢通路在乳腺癌免疫逃逸中发挥重要作用。疏肝凉血方（Shugan-Liangxue Prescription,SLP）由柴胡、郁金、陈皮、丹皮、黄芪、甘草、槐花、紫草、莪术、丹参、夏枯草十一味中药组成,以“疏肝凉血、补虚扶正、活血化瘀”为治则,在乳腺癌临床治疗上取得了满意疗效。本课题基于前期研究,首先建立了乳腺癌大鼠免疫药理模型,用于方剂抗乳腺癌的免疫药效评价,并采用组学技术探索了促进乳腺癌免疫逃逸的代谢机制;其次,从IDO1介导的色氨酸代谢途径,探讨了 SLP抗乳腺癌免疫逃逸的药效及药理;最后,初步构建了体外模型,拟用于抗乳腺癌药的免疫药效评价及机制探索快速检测。第一部分乳腺癌免疫药理模型建立1.1大鼠乳腺癌免疫药理模型建立目的:在化学诱导性大鼠乳腺癌上,以完全弗氏佐剂（Complete freund’s adjuvant,CFA）刺激免疫,建立大鼠乳腺癌免疫药理模型,用于方剂抗乳腺癌的免疫药效评价及机制探索。方法:230只大鼠,对照组70只,其余160只一次性灌胃二甲基苯蒽（7,12-demethylbenz[a]anthracene,DMBA）诱导乳腺癌,d052造模大鼠按肿瘤评分均衡分为模型组及复方组,根据CFA致敏和发敏之间的梯度时间间隔,每组再分别分为7亚组（ni=10）,d052,054,058给予CFA致敏,按梯度时间间隔（25d-95d,k=0.8）各亚组分别发敏注射CFA,d056模型组灌胃羧甲基纤维素钠（Carboxy methyl cellulose,CMC）,复方组灌胃SLP;对照组同步给予等量生理盐水,灌胃CMC。实验终点检测肿瘤体积,取肿瘤组织定性评价病理类型,统计肿瘤浸润淋巴细胞数量,检测血清IL-12水平,以回归肿瘤体积和对数时间间隔得到的半数有效时间间隔（Median effective interval,EI50）作为最佳造模条件,以回归IL-12含量和对数时间间隔得到EI50 IL-12评价乳腺癌癌免疫监视状态。结果:乳腺癌病理特征为浸润性小叶癌,模型组EI50及其95%置信区间分别为33d和26d-41d,相关方程为Y=-0.05+0.95/（1+1015.97-100.52x）,R=0.97,复方组曲线较模型组右移;模型组El50 IL-12及95%置信区间分别为40d和25d-63d,相关方程为Y=0.25+0.73/（1+10-36.08+22.52X）,R=0.92,复方组曲线较模型组左移。结论:DMBA诱导大鼠乳腺癌,CFA放大免疫效应,CFA致敏和发敏的最适时间间隔为33d,IL-12曲线显示了乳腺癌免疫监视状态,复方组确认该模型可用于评价方剂抗乳腺癌的免疫效应。1.2免疫代谢参与乳腺癌免疫逃逸的病理机制目的:观察免疫代谢在乳腺癌免疫逃逸中的作用。方法:230只大鼠,对照组70只,其余160只一次性灌胃DMBA诱导乳腺癌,d052造模大鼠按肿瘤评分均衡分为模型组及复方组,根据CFA致敏和发敏之间的梯度时间间隔,每组再分别分为7亚组（ni=10）,d052,054,058给予CFA致敏,按梯度时间间隔（25d-95d,k=0.8）各亚组分别发敏注射CFA,d056模型组灌胃CMC,复方组灌胃SLP,对照组同步给予等量生理盐水,灌胃CMC。检测致敏和发敏间隔31d的各组大鼠肿瘤特征及浸润淋巴细胞,采用免疫组化（Immunohistochemical staining,IHC）检测肿瘤组织内的CD8、NKG2D、CCR7、foxp3表达,检测大鼠脾脏转录组学,蛋白组学,脂质代谢物组学,胆汁酸及氨基酸代谢改变,跨组学分析参与乳腺癌免疫逃逸的通路和标志物,差异标志物同免疫细胞标志分子进行相关分析,采用实时荧光定量RT-PCR、Western blot和IHC检测IDO1-AhR通路、CaN-NFAT通路及ERα、β的相关分子表达和钙调磷酸神经酶（Calcineurin,CaN）,IDO1酶活性,同免疫标志分子进行相关分析。结果:筛选出了多个脂质,胆汁酸,氨基酸差异代谢物,跨组学分析参与乳腺癌免疫逃逸通路,模型组IDO1介导的色氨酸代谢及CaN-NFAT通路激活,ERα表达上调,ERβ表达下调,IDO1、CaN与免疫逃逸标志分子成正相关,复方组证实了免疫逃逸机制可逆。结论:免疫代谢相关信号通路IDO1介导的色氨酸代谢通路)或致病代谢物诱导乳腺癌免疫逃逸;SLP调节免疫代谢,抑制乳腺癌免疫逃逸。第二部分疏肝凉血方抗乳腺癌免疫逃逸的药理作用及作用机制2.1疏肝凉血方抗大鼠乳腺癌免疫逃逸的药理作用目的:观察SLP抗乳腺癌免疫逃逸的药理作用。方法:doo1灌胃DMBA复制大鼠乳腺癌,灌胃橄榄油作为对照（ni=12）。d052.054.058造模大鼠用CFA致敏,d052将大鼠按肿瘤体积均衡随机分为8组（ni=12）:模型组、三苯氧胺（TAM）组、糖代谢组（al loxan）组、脂代谢（Met）组、胆固醇代谢（atorvastatin）组、疏肝凉血方低（SLPL）、中（SLPM）、高剂量（SLPH）组,d056每天灌胃给药,d085,087,091分别皮下给予CFA发敏,对照组给予同剂量生理盐水,每周测量肿瘤体积,d135处死大鼠,检测瘤重;IHC检测肿瘤组织Ki-67,脾脏CD8、CD206、NKG2D、NKG2A表达,Elisa检测血清中IL-12、IL-4含量。结果:Met组、atorvastatin组、SLPM和SLPH组显着抑制肿瘤生长和癌细胞增殖,抑瘤率分别为 72.96%,67.27%,74.92%,69.52%,Met 组、atorvastatin 组及 SLP中、高剂量组上调血清IL-12含量,下调IL-4含量,上调脾脏中CD8、NKG2D表达,下调CD206、NKG2A表达。结论:SLP能抑制免疫逃逸,增强免疫监视抗乳腺癌。2.2疏肝凉血方调控免疫代谢抗乳腺癌免疫逃逸的药理机制目的:探索SLP调控免疫代谢抗乳腺癌的药理机制。方法:d001灌胃DMBA复制大鼠乳腺癌,灌胃橄榄油作为对照（ni=12）。d052,054,058造模大鼠用CFA致敏,d052将大鼠按肿瘤体积均衡随机分为8组（ni=12）:模型组、TAM 组、alloxan 组、Met 组、atorvastatin 组、SLPL、SLPM、SLPH 组,d056 起每天灌胃给药,d085,087,,091分别皮下给予CFA发敏,对照组给予同剂量生理盐水,每周测量肿瘤体积,d135处死大鼠。Elisa检测大鼠血清中犬尿氨酸（kynurenine）含量,RT-PCR、WB和IHC检测脾脏IDO1、AhR、foxp3表达,生化仪检测血清葡萄糖（Glucose,GLU）、游离脂肪酸（Non-esterified fatty acid,NEFA）和胆固醇（Cholesterol,CHO）含量,并同免疫细胞标志分子进行相关分析。结果:SLP下调IDO1、AhR和foxp3的表达,降低kynurenine含量,SLP下调GLU、NEFA含量,脾脏NKG2A、NKG2D表达分别与GLU含量成正、负相关,foxp3、CD206表达与NEFA成正相关,CD8表达与CHO成负相关。结论:SLP通过抑制IDO1介导的色氨酸代谢激活,抑制免疫逃逸抗乳腺癌,同时抑制免疫逃逸功能与调控免疫糖、脂代谢密切相关。第三部分乳腺癌免疫监视效应速检的规范方法探索3.1原代乳腺癌-脾细胞共培养模型建立目的:建立原代脾细胞-乳腺癌细胞共培养模型,确定最佳接种密度和培养时间,拟用于调控免疫代谢抗乳腺癌候选药的药理机制研究。方法:分离CFA刺激免疫的乳腺癌大鼠中脾细胞和乳腺癌细胞,进行原代培养,分别设置癌细胞、脾细胞、癌-脾共培养组,按梯度细胞密度接种,培养梯度时间,实验终点检测培养基上清乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）,用相同条件的三组计算杀伤情况:LDH=（LDH共-LDH癌-LDH脾）/（LDH癌+LDH脾）,计算量效和时效的曲线下面积（Area under curve,AUC）,回归LDH活性AUC值的半数有效时间（Median effective time,ET50）和半数有效密度（Median effective inoculation density,ED50）作为最佳培养时间和接种密度,细胞爬片观察细胞状态。结果:共培养时间的ET50及95%置信区间分别为40h和14h-110h,相关方程为Y=0.12+0.80/（1+101056-1.60X）,R=0.93。共培养接种密度 ED50及 95%置信区间分别为 8×104个/mL和 5×103个/mL-1 ×106个/mL,相关方程为 Y=0.32+0.70/（1+1015.714.91X）,R=0.83。结论:成功建立原代脾细胞-乳腺癌细胞共培养模型,确定最适培养时间和接种密度分别为40h和8×104个/mL。3.2免疫代谢参与乳腺癌免疫逃逸体外模型初探目的:以糖代谢为例,初探体外免疫代谢参与乳腺癌免疫逃逸体外模型。方法:分离CFA刺激免疫的乳腺癌大鼠中乳腺癌细胞与脾细胞进行原代培养,分为癌细胞、脾细胞、癌-脾共培养组,分别加入梯度浓度2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose,2-DG）培养20h,实验终点检测上清LDH,IFN-γ变化,回归 IFN-γ含量半数有效浓度（Median effective concentration,EC50）作为 2-DG 的最适造模条件。结果:2-DG调节糖代谢促进免疫逃逸的EC50及95%置信区间分别为50mM和1×10-3mM-2×106mM,相关方程为Y=0.29+0.57/（1+10-2.94+1.75X）,R=0.59。结论:在原代乳腺癌-脾细胞共培养模型上,探索了免疫代谢参与乳腺癌免疫逃逸的体外模型。
庄齐[9]（2020）在《基于穿膜肽和细菌外膜囊泡的新型肿瘤疫苗的设计构建及其在肿瘤治疗中的探索》文中认为人类对抗肿瘤的历史已有几百年,所发展的肿瘤治疗手段也越来越多。传统的肿瘤治疗方法包括手术、放疗和化疗等。肿瘤免疫治疗是一种新型的肿瘤治疗手段,能够能通过诱发病人自身的抗肿瘤免疫反应来清除肿瘤。肿瘤疫苗是肿瘤免疫治疗的分支之一,近年来发展迅速,但是具有高抗肿瘤疗效的理想肿瘤疫苗仍有待进一步开发。为诱发有效的抗肿瘤免疫反应,达到更好的抗肿瘤效果,理想的肿瘤疫苗需要具有高免疫原性的抗原,有效的递送策略,以及高效的免疫佐剂。本论文据此设计了两种肿瘤疫苗,并对其抗肿瘤效果进行了评估。首先,肿瘤疫苗中的抗原作为外源性抗原,无法高效地引发能够直接杀伤肿瘤的CD8+T细胞免疫反应,是多种肿瘤疫苗疗效有限的主要原因之一。针对该问题,我们以鸡卵清白蛋白（Ovalbumin,OVA）为模式抗原,利用新型穿膜肽胞质定位内化肽 6（Cytosol localizing internalization peptide 6,CLIP6）与其偶联改变OVA的入胞形式。我们的工作表明,CLIP6的偶联能够显着提高髓源树突状细胞（Bone marrow derived dendritic cells,BMDCs）中 OVA 被主要组织相容性复合物 I（Major histocompatibility complex I,MHC I）提呈的效率,而且在小鼠黑色素瘤模型（Mouse melanoma cells,B16-OVA）中,CLIP6-OVA 做为预防型疫苗能够在一定程度上抑制肿瘤生长。其次,细菌外膜囊泡（Bacterial outer membrane vesicle,OMV）具有很强免疫刺激能力,但需要多次注射才能够抑制肿瘤生长,副作用风险较高。在前期工作中,我们发现单次注射沙门氏杆菌的外膜囊泡S.t ΔpG-OMV能致肿瘤变黑。因此,我们首先对该现象展开研究。实验结果表明,S.t ΔpG-OMV能够导致肿瘤淤血,进而致使肿瘤在近红外区的光吸收显着增加。机制研究表明,革兰氏阴性菌表面的脂多糖是导致肿瘤淤血的关键。基于此现象,我们进一步设计了基于S.tΔpG-OMV和光热治疗（Photothermal therapy,PTT）的肿瘤原位疫苗策略,即在不外加光热剂的情况下,通过注射S.tΔpG-OMV引发肿瘤部位淤血,以淤血富集的血红素为光热剂实现PTT;同时,利用PTT过程中破损的肿瘤细胞提供“原位”抗原,并利用S.t ΔpG-OMV的免疫刺激能力进一步增强抗肿瘤免疫反应。研究结果显示,在活体水平单次、低剂量注射S.t ΔpG-OMV原位疫苗未观察到明显的生物毒性,而且在小鼠结肠癌（Mouse colon cancer cells,CT26）和乳腺癌（Mouse breast cancer cells,4T1）模型中,该原位疫苗能够完全清除4T1和CT26皮下瘤,并在治疗120天后完全抑制CT26肿瘤的复发,显示出极佳的抗肿瘤效果。综上,本论文设计构建了两种新型肿瘤疫苗。两种疫苗均制备工艺简单,成本较低,且具有较高的生物相容性,具有进一步开发的潜力,为开发不同类型的肿瘤疫苗提供了新思路。
丁占岭[10]（2020）在《响应性纳米材料制备及生物应用研究》文中提出响应性纳米材料能够在刺激条件下发生结构和性质变化,从而可以进一步用于可控的药物递送、特异性检测诊断等生物医学研究领域。在响应性纳米材料的生物应用方面,根据刺激条件来源的不同,可以将响应性纳米材料分为生物内源性刺激（酶、氧化还原、pH和乏氧环境等）响应性纳米材料和外源性刺激（光、磁场和超声等）响应性纳米材料。现有的制备响应性纳米材料的方法包括纳米粒子功能化和两亲性分子组装。虽然目前已有很多响应性纳米材料被开发用于成像和药物递送等领域,但是如何根据临床需求制备出生物相容性更好且更“智能”的响应性纳米材料依然有很大的研究空白。本文致力于针对性的开发具有不同功能的新型响应性纳米材料,通过研究证实其响应性能,并评价其在肿瘤成像及药物负载等领域中的应用潜力。具体包括以下三个部分:（1）开发半胱天冬酶3/7（Casp3/7）响应性的纳米材料用于增强对凋亡肿瘤的磁共振成像（MRI）效果。通过结合固相多肽合成（SPPS）的方法,制备出能够对 Casp3/7 响应的小分子 Ac-Asp-Glu-Val-Asp-Cys（StBu）-Lys-CBT（1）。该小分子序列中Lys侧链上有可参与反应的氨基,通过酰胺缩合反应将小分子修饰到双羧基聚乙二醇（COOH-PEG-COOH）功能化的四氧化三铁纳米粒子（Fe3O4 NPs）上,制备得到具有酶响应性的单分散纳米材料Fe3O4@1 NPs。当Fe3O4@1 NPs被高表达Casp3/7的细胞摄取后,在细胞内的还原型谷胱甘肽（GSH）和Casp3/7的共同作用下,诱导Fe3O4 NPs形成交联的聚集体,从而缩短周围水中质子（1H）的横向弛豫时间（T2）,增强磁共振成像效果。通过设计酶切实验对Fe3O4@1 NPs的响应性能进行验证,并构建高表达Casp3/7的细胞模型和小鼠凋亡肿瘤模型对制备的响应性纳米材料的磁共振成像性能进行验证。（2）开发弗林蛋白酶（Furin）响应性的纳米材料对肿瘤进行精确双模态（1H和19F）磁共振成像。通过将含有19F的4-（三氟甲基）苯甲酸（TFMB）基元引入到短肽结构,再根据酶切底物的特征,制备出能够对Furin响应的分子TFMB-Arg-Val-Arg-Arg-Cys（StBu）-Lys-CBT（1）,将分子修饰到双羧基聚乙二醇（COOH-PEG-COOH）功能化的氧化铁纳米粒子（IONP）上制备得到具有弗林酶响应性的纳米材料IONP@1。由于顺磁性弛豫增强（PRE）效应的存在,纳米材料的19F信号最初处于“关闭”状态,IONP@1被高表达Furin的肿瘤细胞摄取后,Furin诱导IONP聚集,增强1H的T2加权MRI信号,同时含19F的肽段被剪切远离IONP,PRE效应减弱,19F NMR/MRI信号“开启”。通过构建体外酶切的模型和高表达Furin的细胞模型将IONP@1应用于弗林蛋白酶的活性检测,构建斑马鱼肿瘤模型用于证实IONP@1可以实现对肿瘤的精确双模态（1H和19F）磁共振成像。（3）开发能够光响应释放一氧化氮（NO）的可降解型纳米胶束用于负载阿霉素（DOX）实现协同抗癌。通过将间羟基苯甲醛与溴乙醇反应得到成醚产物,随后与对苯二胺反应合成席夫碱,然后将其用硼氢化钠（NaBH4）还原并用亚硝酸钠（NaNO2）进行亚硝化处理得到可释放NO的分子（NORM）。使用NORM作为结构单元,在六亚甲基二异氰酸酯（HDI）和聚乙二醇单甲醚（mPEG-OH）存在下,通过缩聚反应制备PEG-b-PNORM-b-PEG三嵌段共聚物。光响应性的N,N1-二亚硝基对苯二胺（DNP）衍生物被整合到两亲性三嵌段共聚物的中间嵌段,所以得到的三嵌段共聚物可以作为大分子NO供体,PEG-b-PNORM-b-PEG三嵌段共聚物具有光响应性,并且光触发的NO释放过程将DNP转化为醌二亚胺（QDI）衍生物,由于QDI基元的自发水解,使得所得聚合物能够降解。通过设计体外和体内实验,证实供体在可见光照射下能够触发NO释放过程。此外,制备出负载DOX的胶束后,通过实验证实NO释放触发的胶束解离过程,并对响应性纳米组装体在可见光照射下同时释放NO和DOX用于协同抗癌的性能进行验证。
二、肽段在肿瘤治疗应用中的展望（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肽段在肿瘤治疗应用中的展望（论文提纲范文）
（1）嵌合肽纳米载药体系的构建及其在肿瘤精准治疗中的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 肿瘤微环境概述 |
| 1.1.2 多肽材料概述 |
| 1.2 嵌合肽材料在肿瘤治疗中应用 |
| 1.2.1 在主动靶向药物运输中的应用 |
| 1.2.2 在特异性肿瘤药物释放中的应用 |
| 1.2.3 在药物靶向细胞亚器官运输中的应用 |
| 1.3 嵌合肽材料在肿瘤成像与诊断中的应用 |
| 1.3.1 嵌合肽材料在肿瘤诊断上的应用 |
| 1.3.2 嵌合肽材料在治疗响应评估上的应用 |
| 1.4 自组装多肽材料在肿瘤治疗与成像中的应用 |
| 1.4.1 自组装材料在新的生物效应方面的研究 |
| 1.4.2 自组装嵌合肽在改变药物理化性质中的研究 |
| 1.5 课题研究思路和意义 |
| 第二章 肿瘤响应的形貌转换嵌合肽在增强肿瘤内化和光动力治疗中的研究 |
| 2.1 实验目的及意义 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 嵌合肽PEAK的制备 |
| 2.3.2 PEAK-DMA的制备 |
| 2.3.3 紫外光谱、透射电子显微镜、粒径和Zeta电势测定 |
| 2.3.4 DMA脱离测定 |
| 2.3.5 测定活性氧(ROS)的生成 |
| 2.3.6 圆二色谱(Circular Dichroism,CD)分析 |
| 2.3.7 临界聚集浓度(Critical Aggregation Concentration,CAC)的测定 |
| 2.3.8 细胞培养 |
| 2.3.9 细胞摄取评估 |
| 2.3.10 细胞毒性评估 |
| 2.3.11 细胞早期凋亡评估 |
| 2.3.12 体内的荧光成像,组织分布和药代动力学 |
| 2.3.13 体内抗肿瘤评估 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 PEAK-DMA的合成与表征 |
| 2.4.2 肿瘤微酸介导PEAK-DMA形貌转变 |
| 2.4.3 形貌转变增强细胞摄取 |
| 2.4.4 体内肿瘤靶向成像和药代动力学 |
| 2.4.5 体内抗肿瘤研究 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 肿瘤响应性形貌转换嵌合肽在双阶段放大磁共振成像和精准光动力治疗中的研究 |
| 3.1 研究目的及意义 |
| 3.2 实验设备与材料 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Ppdf和 Pdf的合成 |
| 3.3.2 Ppdf-Gd和 Pdf-Gd的合成 |
| 3.3.3 紫外-可见光谱表征及ROS生成评估 |
| 3.3.4 圆二色光谱测量 |
| 3.3.5 透射电子显微镜和流体动力学尺寸测量 |
| 3.3.6 临界聚集浓度测定 |
| 3.3.7 体外细胞毒性评估 |
| 3.3.8 弛豫率测定 |
| 3.3.9 体内核磁共振成像 |
| 3.3.10 体内光学成像,组织分布及药代动力学 |
| 3.3.11 体内抗肿瘤治疗 |
| 3.3.12 系统毒性评估 |
| 3.3.13 统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 Ppdf-Gd的合成与表征 |
| 3.4.2 MMP-2 诱导Ppdf-Gd形貌转变 |
| 3.4.3 Ppdf-Gd形貌转变机制的研究 |
| 3.4.4 球到纤维的转变介导MRI放大 |
| 3.4.5 体内肿瘤靶向成像及抗肿瘤治疗 |
| 3.4.6 系统性毒性评估 |
| 3.5 总结 |
| 第四章 基于MNO_2-嵌合肽复合材料的光活性翻转策略在缓解PDT后肿瘤乏氧中的研究 |
| 4.1 研究目的及意义 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 MnO_2 纳米片的制备与表征 |
| 4.3.2 嵌合肽PPa-DP的制备与表征 |
| 4.3.3 MnO_2-嵌合肽复合物MPPa-DP的制备与表征 |
| 4.3.4 MnO_2 的降解研究 |
| 4.3.5 ROS测定 |
| 4.3.6 Mn~(2+)对PPa-DP光化学性质的影响 |
| 4.3.7 Caspase-3 介导PPa-DP聚集行为的测定 |
| 4.3.8 Caspase-3 介导PPa-DP光活性的淬灭和O2 消耗的降低 |
| 4.3.9 细胞摄取和胞内ROS生成评估 |
| 4.3.10 体外细胞毒性研究 |
| 4.3.11 胞内Caspase-3 介导PPa-DP的聚集研究 |
| 4.3.12 光学成像及体内组织分布 |
| 4.3.13 肿瘤氧气含量,HIF-1α及 VEGF评估 |
| 4.3.14 体内抗肿瘤治疗及组织学分析 |
| 4.3.15 统计学分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 PPa-DP和 MnO_2 的合成与表征 |
| 4.4.2 MPPa-DP的合成与表征 |
| 4.4.3 H_2O_2 触发的PPa-DP释放和O_2 生成 |
| 4.4.4 乏氧条件下MPPa-DP的毒性评估 |
| 4.4.5 Caspase-3 诱导PPa-DP光活性猝灭及氧气消耗降低 |
| 4.4.6 体内氧气提升及控制氧气消耗 |
| 4.4.7 体内抗肿瘤研究 |
| 4.5 总结 |
| 第五章 PH/凋亡双重响应再组装嵌合肽在核磁评估PH和治疗响应中的研究 |
| 5.1 研究目的及意义 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 PDDP的合成 |
| 5.3.2 理论模拟与计算 |
| 5.3.3 PDDP在不同pH及 caspase-3 酶下的荧光图谱 |
| 5.3.4 PDDP在不同pH和 caspase-3 酶下的紫外-可见吸收光光谱 |
| 5.3.5 傅里叶变换红外光谱 |
| 5.3.6 高效液相色谱分析 |
| 5.3.7 透射电子显微镜观察 |
| 5.3.8 动态光散射测试 |
| 5.3.9 弛豫率测试 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 PDDP的合成与表征 |
| 5.4.2 不同pH下 PDDP的红外图谱 |
| 5.4.3 HPLC图谱分析 |
| 5.4.4 分子模拟揭示PDDP在不同pH和 caspase-3 下的自组装情况 |
| 5.4.5 荧光和紫外光谱分析 |
| 5.4.6 TEM和动态光散射测试 |
| 5.4.7 弛豫率测试 |
| 5.5 总结 |
| 第六章 全文总结及展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）牛奶来源外泌体的糖组学及糖蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 外泌体的概述 |
| 1.1.1 外泌体的结构与组成 |
| 1.1.2 外泌体的形成机制 |
| 1.1.3 牛奶来源外泌体在肿瘤靶向治疗方面的应用 |
| 1.2 蛋白质糖基化概述 |
| 1.2.1 蛋白质糖基化意义 |
| 1.2.2 蛋白质糖基化的研究技术 |
| 1.2.3 蛋白质糖基化的现状及挑战 |
| 1.3 论文的研究意义及主要内容 |
| 1.3.1 论文的立题依据及意义 |
| 1.3.2 论文研究内容 |
| 第二章 牛奶来源外泌体的糖组学研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂及材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 牛奶来源外泌体的提取及表征 |
| 2.2.2 牛奶乳清蛋白及游离寡糖的提取 |
| 2.2.3 N-连接糖链的释放及衍生化修饰 |
| 2.2.4 O-连接糖链的释放及衍生化修饰 |
| 2.2.5 MALDI-TOF/TOF-MS解析糖组学 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 牛奶来源外泌体的表征 |
| 2.3.2 牛奶来源外泌体及乳清中的N-连接糖链 |
| 2.3.3 牛奶来源外泌体及乳清中的O-连接糖链 |
| 2.3.4 乳清中的游离寡糖 |
| 2.3.5 小结 |
| 第三章 不同乳汁来源外泌体的糖蛋白质组学研究 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 外泌体的提取与表征 |
| 3.1.2 N-连接糖肽的富集 |
| 3.1.3 LC-MS/MS解析糖蛋白质组学 |
| 3.1.4 数据处理 |
| 3.1.5 数据分析 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 牛奶来源外泌体糖蛋白的定性分析 |
| 3.2.2 牛奶来源外泌体糖蛋白的不均一性对比 |
| 3.2.3 牛奶来源外泌体糖蛋白的功能分析 |
| 3.2.4 外泌体糖蛋白鉴定方法的优化 |
| 3.2.5 小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A:附表 |
| 附录B:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）基于深度学习的肿瘤新生抗原预测方法研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写、符号清单、术语表 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 多肽与MHC分子相互作用及其复合物pMHC免疫原性的预测方法研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 数据收集 |
| 2.2.2 模型训练 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 氨基酸表征方式和深度学习模型的选择 |
| 2.3.2 模型的框架 |
| 2.3.3 不平衡数据的处理 |
| 2.3.4 模型性能的评估 |
| 2.3.5 模型在临床样本中的预测效果 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第三章 TCR与pMHC相互作用的预测方法研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 数据收集 |
| 3.2.2 模型训练 |
| 3.2.3 TCR-pMHC相互作用的亲和力鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 pMHC结合TCR的序列特征分析 |
| 3.3.2 A0201_GILGFVFTL限制性模型指导TCR亲和力优化 |
| 3.3.3 MHC分型限制性pMHC结合TCR的序列分析 |
| 3.3.4 HLA-A02:01分型限制性模型应用 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 肿瘤新生抗原预测方法的应用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 数据收集 |
| 4.2.2 软件工具 |
| 4.2.3 网络在线工具和数据库的的构建方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 一站式肿瘤新生抗原预测软件TSNAD V2.0的构建 |
| 4.3.2 TCGA大规模样本肿瘤新生抗原预测分析 |
| 4.3.3 肿瘤新生抗原数据库的构建 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 总结与展望 |
| 主要创新点及不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 肿瘤新生抗原研究进展 |
| 肿瘤新生抗原在肿瘤免疫治疗的应用 |
| 肿瘤新生抗原的鉴定方法 |
| 肿瘤新生抗原体内生理过程的研究 |
| 肿瘤新生抗原研究相关资源 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间主要研究成果 |
（4）酸敏感抗癌组合肽的设计、合成及抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 抗癌肽(anticancer peptides,ACPs) |
| 1.1.1 抗癌肽简介 |
| 1.1.2 抗癌肽的理化性质 |
| 1.1.3 抗癌肽的来源 |
| 1.1.4 抗癌肽的作用方式 |
| 1.2 抗癌肽使用存在的问题 |
| 1.3 多肽的改造 |
| 1.3.1 替换序列中的氨基酸 |
| 1.3.2 改造侧链 |
| 1.3.3 插入特定酶切位点 |
| 1.3.4 与受体靶向部分结合 |
| 1.3.5 结合化疗药物 |
| 1.3.6 根据肿瘤组织环境的pH差异提高选择性 |
| 1.3.7 结合阴离子肽 |
| 1.3.8 提高稳定性 |
| 1.4 阳离子抗癌肽LK |
| 1.5 立题依据 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验仪器及材料 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验细胞与动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 多肽的合成 |
| 2.2.2 多肽的纯化及结构鉴定 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 细胞毒性实验(MTT实验) |
| 2.2.5 碘化吡啶(PI)摄取实验 |
| 2.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放实验 |
| 2.2.7 扫描电子显微镜(SEM)实验 |
| 2.2.8 溶血实验 |
| 2.2.9 血清稳定性实验 |
| 2.2.10 二级结构测定 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 多肽类似物的设计与合成 |
| 3.2 多肽类似物的细胞毒性实验(MTT实验) |
| 3.2.1 多肽类似物与 Hela细胞在pH7.4与pH6.0 环境下的细胞毒性 |
| 3.2.2 多肽类似物与不同类型细胞在pH7.4 与pH6.0 环境下细胞毒性 |
| 3.3 碘化吡啶(PI)摄取实验 |
| 3.4 乳酸脱氢酶(LDH)释放实验 |
| 3.5 扫描电子显微镜(SEM)实验 |
| 3.6 圆二色谱(CD)实验 |
| 3.7 溶血实验 |
| 3.8 血清稳定性实验 |
| 第四章 实验结果讨论与展望 |
| 4.1 实验讨论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词中英文对照表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录一 相关肽段ESI-MS谱图 |
| 附录二 相关肽段RP-HPLC分析谱图 |
（5）乳腺癌循环肿瘤细胞生物学特性及其在血液中存活的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 乳腺癌研究现状 |
| 1.1.2 循环肿瘤细胞研究现状 |
| 1.1.3 金属硫蛋白MT2 在肿瘤中的研究现状 |
| 1.2 研究思路 |
| 1.3 技术路线 |
| 第二章 循环肿瘤细胞系的分离鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 4T1 乳腺癌原位肿瘤细胞和肺脏肿瘤转移灶细胞的分离和鉴定 |
| 2.3.2 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞的分离和鉴定 |
| 2.3.3 B16 黑色素瘤循环肿瘤细胞分离和鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 循环肿瘤细胞生物学特性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞的异质性 |
| 3.3.2 不同EMT表型的4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞的鉴定 |
| 3.3.3 短期传代次数对4T1CTCs EMT表型的影响 |
| 3.3.4 循环肿瘤细胞对化疗药物的敏感性研究 |
| 3.3.5 循环肿瘤细胞增殖、克隆形成能力和体内致瘤能力研究 |
| 3.3.6 循环肿瘤细胞侵袭迁移能力及肺转移能力 |
| 3.3.7 悬浮培养和流体剪切力对4T1CTCs EMT表型的影响 |
| 3.3.8 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞表现为强的血液存活能力 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 乳腺癌循环肿瘤细胞定量iTRAQ蛋白组学分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 不同EMT表型4T1CTCs的差异蛋白 |
| 4.3.2 不同EMT表型4T1CTCs的差异蛋白的GO富集分析 |
| 4.3.3 不同EMT表型4T1CTCs差异蛋白的蛋白-蛋白相互作用网络分析 |
| 4.3.4 不同EMT表型4T1CTCs差异蛋白的KEGG分析 |
| 4.3.5 间叶表型4T1CTCs的候选标记物 |
| 4.3.6 中间表型 4T1CTC-1 和间叶表型 4T1CTC-2 共同高表达蛋白分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 金属硫蛋白2(MT2)通过诱导CTCs发生自噬促进失巢凋亡抵抗和存活 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 4T1乳腺癌循环肿瘤细胞表现为强的失巢凋亡抵抗能力 |
| 5.3.2 乳腺癌循环肿瘤细胞表现为强的流体剪切力诱导凋亡抵抗能力 |
| 5.3.3 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞表现为免疫逃逸表型 |
| 5.3.4 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞通过增加自噬水平抑制凋亡水平促进细胞存活 |
| 5.3.5 4T1 乳腺癌循环肿瘤细胞通过 MT2 增加自噬水平促进细胞存活 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 一、主要结论 |
| 二、特色与创新 |
| 三、局限性与不足 |
| 四、展望 |
| 参考文献 |
| 研究成果 |
| 中英文缩略表 |
| 致谢 |
（6）LIF对食管鳞癌中不同LET射线辐射应答的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 食管癌现状与治疗进展 |
| 1.1.1 食管癌流行现状 |
| 1.1.2 食管癌治疗概述 |
| 1.2 食管癌放射治疗进展 |
| 1.2.1 线性能量传递 |
| 1.2.2 X线放射治疗食管癌现状 |
| 1.2.3 碳离子物理学和生物学特性概述 |
| 1.2.4 碳离子放射治疗食管癌研究进展 |
| 1.3 蛋白质组学研究 |
| 1.3.1 蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 |
| 1.3.2 蛋白质组学在食管癌中的应用 |
| 1.3.3 蛋白质组学与辐射抗性 |
| 1.4 STAT3信号通路 |
| 1.4.1 STAT3信号通路与恶性肿瘤的关系 |
| 1.4.2 STAT3信号通路与放射治疗的关系 |
| 1.5 研究思路和临床意义 |
| 第二章 X射线辐照对食管鳞癌细胞辐射应答的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 实验细胞 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 辐照处理 |
| 2.3.3 细胞克隆存活实验 |
| 2.3.4 细胞增殖实验 |
| 2.3.5 细胞周期检测 |
| 2.3.6 细胞凋亡检测 |
| 2.3.7 迁移和侵袭实验 |
| 2.3.8 免疫荧光实验 |
| 2.3.9 Western blot检测蛋白的表达变化 |
| 2.3.10 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 X射线对ECA109和KYSE150 细胞存活分数的影响 |
| 2.4.2 X射线对ECA109和KYSE150 细胞增殖的影响 |
| 2.4.3 X射线对 ECA109 和KYSE150细胞周期分布的影响 |
| 2.4.4 X射线对ECA109和KYSE150 细胞凋亡的影响 |
| 2.4.5 X射线对ECA109细胞迁移和侵袭的影响 |
| 2.4.6 X射线对ECA109 细胞DNA链损伤的影响 |
| 2.4.7 X射线对ECA109细胞中抗辐射相关蛋白的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 ECA109细胞中辐射抗性差异蛋白分子的筛选和鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 实验细胞 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验仪器和耗材 |
| 3.3 实验方法和步骤 |
| 3.3.2 蛋白质的抽提 |
| 3.3.3 SDS-PAGE电泳 |
| 3.3.4 FASP酶解 |
| 3.3.5 TMT标记 |
| 3.3.6 High PH RP分级 |
| 3.3.7 质谱分析 |
| 3.3.8 质谱鉴定 |
| 3.3.9 数据分析 |
| 3.4 生物信息学分析方法 |
| 3.4.1 Gene Ontology(GO)功能注释 |
| 3.4.2 KEGG通路注释 |
| 3.4.3 GO注释与KEGG注释的富集分析 |
| 3.5 结果 |
| 3.5.1 蛋白质质量定量检测 |
| 3.5.2 TMT标记和仪器质控 |
| 3.5.3 样本一致性评估 |
| 3.5.4 差异蛋白质的统计分析 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 食管鳞癌放疗患者血清中LIF浓度的临床意义 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 资料与方法 |
| 4.2.1 临床资料 |
| 4.2.2 治疗方法 |
| 4.2.3 主要仪器及试剂 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.2.5 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 临床样本特征及血清LIF浓度测定 |
| 4.3.2 食管鳞癌患者放疗前后血清LIF浓度与临床病理特征的关系 |
| 4.3.3 食管鳞患者放疗前后血清LIF浓度变化与局部复发及远处转移的关系 |
| 4.3.4 放疗后血清LIF浓度升高组和下降组生存率比较 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 LIF通过靶向STAT3 在食管鳞癌细胞中生物学效应的探索 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 实验细胞 |
| 5.2.2 实验试剂及耗材 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.3 实验方法和步骤 |
| 5.3.1 细胞转染试验 |
| 5.3.2 细胞培养 |
| 5.3.3 克隆形成实验 |
| 5.3.4 细胞增殖实验 |
| 5.3.5 细胞凋亡试验 |
| 5.3.6 细胞迁移和侵袭实验 |
| 5.3.7 RNA的提取及反转录 |
| 5.3.8 Western blot |
| 5.3.9 数据统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 下调LIF对细胞克隆形成的影响 |
| 5.4.2 下调LIF后对ECA109 细胞增殖的影响 |
| 5.4.3 下调LIF对 ECA109 细胞的凋亡影响 |
| 5.4.4 下调LIF对 ECA109 细胞转移的作用 |
| 5.4.5 RT-PCR检测LIF和 STAT3 的表达 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 LIF通过STAT3 信号通路调控食管鳞癌细胞对碳离子射线的辐射应答效应及机制研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与试剂 |
| 6.2.1 实验细胞 |
| 6.2.2 主要试剂 |
| 6.2.3 主要仪器 |
| 6.3 实验方法和步骤 |
| 6.3.1 细胞培养 |
| 6.3.2 辐照处理 |
| 6.3.3 细胞克隆存活试验 |
| 6.3.4 细胞增殖试验 |
| 6.3.5 细胞周期检测试验 |
| 6.3.6 细胞凋亡试验 |
| 6.3.7 细胞划痕实验和侵袭试验 |
| 6.3.8 细胞总RNA提取 |
| 6.3.9 RT-PCR试验 |
| 6.3.10 Western blot试验 |
| 6.3.11 数据统计分析 |
| 6.4 试验结果 |
| 6.4.1 碳离子对ECA109细胞克隆存活的影响 |
| 6.4.2 碳离子对ECA109细胞增殖的影响 |
| 6.4.3 碳离子对ECA109细胞凋亡的影响 |
| 6.4.4 碳离子对ECA109细胞周期阻滞的影响 |
| 6.4.5 碳离子对ECA109细胞迁移和侵袭的影响 |
| 6.4.6 碳离子对ECA109 细胞中LIF和 STAT3 相关分子转录水平的影响 |
| 6.4.7 碳离子对ECA109 细胞中LIF和 STAT3 相关分子翻译水平的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 研究不足与展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）天然冰片纳米体系的设计及其在肿瘤治疗方面的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症及其治疗 |
| 1.2 天然冰片及其应用 |
| 1.3 纳米技术在癌症治疗中的应用 |
| 1.4 NK细胞在癌症治疗的应用 |
| 1.5 选题意义和设计思路 |
| 1.6 主要创新点 |
| 第二章 天然冰片纳米体系对抗肺癌药物的增敏作用及其机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 天然冰片纳米体系协同NK细胞对肺癌的免疫治疗作用及其机制的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验试剂与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 总结及展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 在学期间的论文和专利 |
| 致谢 |
（8）疏肝凉血方调控免疫代谢抗乳腺癌的药理机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 实验部分 |
| 第一部分乳腺癌免疫药理模型建立 |
| 第一节 大鼠乳腺癌免疫药理模型建立 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二节 免疫代谢参与乳腺癌免疫逃逸的病理机制 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 疏肝凉血方抗乳腺癌免疫逃逸药理作用及作用机制 |
| 第一节 疏肝凉血方抗大鼠乳腺癌免疫逃逸的药理作用 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二节 疏肝凉血方调控免疫代谢抗乳腺癌免疫逃逸的药理机制 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 乳腺癌免疫监视效应速检的规范方法探索 |
| 第一节 原代乳腺癌-脾细胞共培养模型建立 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二节 免疫代谢参与乳腺癌免疫逃逸体外模型初探 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述部分 |
| 综述一 乳腺癌中西医防治进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 乳腺癌免疫治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三 肿瘤免疫动物模型构建的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）基于穿膜肽和细菌外膜囊泡的新型肿瘤疫苗的设计构建及其在肿瘤治疗中的探索（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 传统肿瘤治疗方法 |
| 1.2 免疫疗法 |
| 1.3 肿瘤疫苗 |
| 1.3.1 肽/蛋白疫苗 |
| 1.3.2 核酸疫苗 |
| 1.3.3 仿生疫苗 |
| 1.3.4 原位疫苗 |
| 1.3.4.1 免疫原性细胞死亡 |
| 1.3.4.2 基于放射治疗的原位疫苗 |
| 1.3.4.3 基于光学治疗的原位疫苗 |
| 1.3.4.4 基于化学治疗的原位疫苗 |
| 1.4 肿瘤疫苗改进策略 |
| 1.4.1 增强抗原的免疫刺激能力 |
| 1.4.1.1 新生抗原与个性化疫苗 |
| 1.4.1.2 核酸疫苗与个性化疫苗 |
| 1.4.2 提高抗原的交叉呈递效率 |
| 1.4.2.1 质子海绵效应 |
| 1.4.2.2 穿膜肽 |
| 1.4.3 增强免疫反应 |
| 1.4.3.1 铝盐佐剂 |
| 1.4.3.2 CpG寡脱氧核苷酸 |
| 1.4.3.3 细菌外膜囊泡 |
| 1.5 本研究的选题依据及内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 基于细胞穿膜肽CLIP6肿瘤疫苗的构建及抗肿瘤研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验药品及设备 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 CLIP6与OVA的偶联 |
| 2.3.2 SDS-PAGE |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 偶联效率的测定 |
| 2.3.5 抗原交叉呈递检测 |
| 2.3.6 细胞摄入机制探究 |
| 2.3.7 皮肤内CD11c~+细胞抗原摄入效率检测 |
| 2.3.8 抗原呈递细胞淋巴结迁移检测 |
| 2.3.9 CLIP6-OVA活体肿瘤预防实验 |
| 2.4 实验结果和讨论 |
| 2.4.1 肿瘤疫苗CLIP6-OVA的制备与表征 |
| 2.4.2 CLIP6的偶联对OVA入胞效率的影响 |
| 2.4.3 CLIP6的偶联对抗原交叉呈递效率的影响 |
| 2.4.4 注射部位皮肤内CD11c~+细胞对疫苗摄取效率的研究 |
| 2.4.5 CLIP6的偶联对抗原呈递细胞淋巴结迁移的影响 |
| 2.4.6 CLIP6-OVA作为预防型疫苗的肿瘤预防疗效探究 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于细菌外膜囊泡和光热治疗的原位疫苗策略研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验药品及设备 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.3.1 细菌外膜囊泡的制备 |
| 3.3.2 细胞培养与小鼠来源 |
| 3.3.3 细菌外膜囊泡形貌与粒径表征 |
| 3.3.4 细菌外膜囊泡的内毒素检测 |
| 3.3.5 细菌外膜囊泡的吸光度检测 |
| 3.3.6 肿瘤血管荧光染色实验 |
| 3.3.7 肿瘤的光声检测 |
| 3.3.8 细胞毒性测试 |
| 3.3.9 细菌外膜囊泡的生物分布研究 |
| 3.3.10 骨髓源树突状细胞成熟刺激实验 |
| 3.3.11 细胞因子分泌水平测定 |
| 3.3.12 单次注射细菌外膜囊泡引发的肿瘤升温能力检测 |
| 3.3.13 基于细菌外膜囊泡和光热治疗的肿瘤治疗实验 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 沙门氏杆菌外膜囊泡S.t ΔpG-OMV的制备与表征 |
| 3.4.2 S.t ΔpG-OMV引发肿瘤部位变黑现象的研究 |
| 3.4.3 S.t ΔpG-OMV引发肿瘤淤血的机制研究 |
| 3.4.4 S.t ΔpG-OMV的细胞毒性和生物毒性研究 |
| 3.4.5 S.t ΔpG-OMV的免疫刺激能力检测 |
| 3.4.6 单独使用S.t ΔpG-OMV的抗肿瘤效果评价 |
| 3.4.7 基于S.t ΔpG-OMV和光热治疗的原位疫苗的设计与抗肿瘤效果评价 |
| 3.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 论文总结 |
| 4.2 研究展望 |
| 攻读学位期间公开发表的论文 |
| 致谢 |
（10）响应性纳米材料制备及生物应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 响应性纳米材料简介 |
| 1.2 响应性纳米材料种类 |
| 1.2.1 生物内源性刺激响应性纳米材料 |
| 1.2.2 外源性刺激响应性纳米材料 |
| 1.3 响应性纳米材料制备方法 |
| 1.3.1 纳米材料改性 |
| 1.3.2 两亲性分子组装 |
| 1.4 响应性纳米材料的应用 |
| 1.4.1 响应性纳米材料用于成像 |
| 1.4.2 响应性纳米材料用于物质递送 |
| 1.5 本论文研究工作 |
| 参考文献 |
| 第二章 Casp3/7酶响应性纳米粒子用于增强凋亡肿瘤的T2成像效果 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 原料和试剂 |
| 2.2.2 样品合成 |
| 2.2.3 仪器与表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Casp3诱导Fe_3O_4@1NPs聚集 |
| 2.3.2 Fe_3O_4@1NPs与Casp3或凋亡的HepG2细胞共孵育发生体外聚集增强磁共振成像效果 |
| 2.3.3 Fe_3O_4@1NPs在凋亡肿瘤内聚集增强T_2加权的MR成像效果 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 弗林蛋白酶响应性纳米粒子用于~1H和~(19)F双模态成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 原料和试剂 |
| 3.2.2 样品的合成与表征 |
| 3.2.3 仪器与表征 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 弗林蛋白酶诱导IONP@1聚集和~(19)FNMR信号“开启” |
| 3.3.2 IONP@1在高表达弗林蛋白酶的细胞内聚集和“开启”~(19)F信号 |
| 3.3.3 IONP@1用于对斑马鱼肿瘤进行精确的~1H和~(19)F磁共振成像 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 光响应性可降解胶束用于一氧化氮和阿霉素协同递送 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 原料和试剂 |
| 4.2.2 样品的合成 |
| 4.2.3 仪器与表征 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 通过缩聚反应成功制备可释放NO的三嵌段共聚物 |
| 4.3.2 光触发NO释放和释放机理研究 |
| 4.3.3 PEG_(45)-b-PNORM_5-b-PEG_(45)三嵌段共聚物的自组装和光响应释放NO以及胶束解离 |
| 4.3.4 光触发NO在细胞内释放 |
| 4.3.5 光触发NO在小鼠皮下释放 |
| 4.3.6 光触发的NO和DOX协同释放改善治疗效果 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结和展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
四、肽段在肿瘤治疗应用中的展望（论文参考文献）
- [1]嵌合肽纳米载药体系的构建及其在肿瘤精准治疗中的研究[D]. 张金. 华中农业大学, 2021
- [2]牛奶来源外泌体的糖组学及糖蛋白质组学研究[D]. 陈文彦. 江南大学, 2021(01)
- [3]基于深度学习的肿瘤新生抗原预测方法研究[D]. 吴静成. 浙江大学, 2021(01)
- [4]酸敏感抗癌组合肽的设计、合成及抗肿瘤活性研究[D]. 鲍赫鑫. 兰州大学, 2021(09)
- [5]乳腺癌循环肿瘤细胞生物学特性及其在血液中存活的机制研究[D]. 金延玲. 兰州大学, 2021(09)
- [6]LIF对食管鳞癌中不同LET射线辐射应答的作用及机制研究[D]. 罗宏涛. 兰州大学, 2020(04)
- [7]天然冰片纳米体系的设计及其在肿瘤治疗方面的应用[D]. 袁日明. 暨南大学, 2020(03)
- [8]疏肝凉血方调控免疫代谢抗乳腺癌的药理机制研究[D]. 刘金玉. 北京协和医学院, 2020(05)
- [9]基于穿膜肽和细菌外膜囊泡的新型肿瘤疫苗的设计构建及其在肿瘤治疗中的探索[D]. 庄齐. 苏州大学, 2020(02)
- [10]响应性纳米材料制备及生物应用研究[D]. 丁占岭. 中国科学技术大学, 2020(01)