一、MDV CVI988/Rispens弱毒株VP22基因克隆和序列分析（论文文献综述）
唐清秀,王宜平,叶正钦,李丕顺,纪春晓[1]（2021）在《马立克病病毒被膜蛋白VP22的研究进展》文中进行了进一步梳理马立克病病毒（MDV）感染鸡可导致外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官肿瘤和免疫抑制。VP22蛋白是α-疱疹病毒被膜蛋白特有的成分,它具有独特的蛋白转运能力,能够将与病毒复制有关的蛋白质以及核酸等物质转运到细胞中,并且能够通过抑制cGAS-STING信号通路来帮助病毒逃避宿主的天然免疫屏障,但是VP22是否与MDV的免疫逃逸有关还未见相关报道,仍有待进一步研究。本文主要从VP22的细胞核定位、蛋白转导以及免疫逃避等方面进行综述,加深对MDV病毒蛋白VP22的认识。
连雪[2]（2018）在《马立克病毒通过DNA损伤应答通路调控病毒复制的研究》文中指出马立克病（Marek’s Disease,MD）是由马立克病毒（Marek’s Disease Virus,MDV）引起的鸡恶性T淋巴细胞增生性肿瘤病,是危害世界养禽业的严重传染病之一。目前随着病毒进化,新的超强毒株出现,已造成鸡的免疫失败,因此,新的疫苗和防控策略亟待开发,这离不开对MDV病毒基因功能和致病机理的深入研究。此外,由于MDV与人类疱疹病毒相似的基因组成和生理特性,其可作为研究淋巴瘤发病机制和免疫调控的生物医学模型。综上所述,深入研究MDV致病分子机理,阐明疱疹病毒与细胞信号传导通路的相互作用机理,对MD的防控及人类肿瘤学研究都具有重要意义。本研究基于以上背景,开展了以下5个方面的研究:1.MDV感染引起细胞DNA损伤病原微生物感染可造成机体DNA损伤并激活DNA损伤应答通路（DNA Damage response,DDR）。本研究通过建立 CEF（Chicken embryo fibroblast）细胞的彗星试验,检测细胞内DNA损伤程度。收集Md5和CVI988感染1、2、3和4天的CEF细胞样品,发现MDV感染可引起DNA损伤,并随着感染时间的延长,含有DNA损伤的细胞逐渐增多,损伤程度逐渐加大,说明DNA损伤有可能与病毒复制产生的复制压力有关。通过Western-blot检测DDR的下游标志物p53和p21发现,MDV感染细胞中p53和p21的蛋白表达水平升高,说明MDV感染激活细胞中DDR通路。由此可见,MDV感染造成细胞内DNA损伤并激活DDR通路。2.DNA损伤应答通路对MDV复制的影响病毒感染细胞中DDR通路的激活是机体抵御病原体入侵的机制之一,相反,病毒也可以抑制DDR通路,以消除其对自身繁殖的不利影响。本研究通过使用特异性抑制剂分别阻断ATM、ATR或DNA-PK介导的DDR通路。Western-blot检测发现,当使用VE-821阻断CEF细胞内ATR通路后,MDV的VP22蛋白表达量升高,说明病毒复制增加。相反,使用DNA损伤药物羟基脲（Hydroxyurea,HU）处理细胞,激活细胞内ATR-Chk1通路时,MDV的VP22蛋白表达量下降,说明MDV的复制被显着抑制。进一步的研究发现,MDV感染早期12 h,激活细胞内的ATR-Chk1通路,pChk1水平升高,而感染16至24 h后,病毒感染细胞中pChk1水平低于对照组。当使用DNA损伤药物ETP激活ATR-Chk1通路时,MDV感染可阻断ETP引起的Chk1磷酸化。此外,Western-blot检测STAT3通路发现,MDV感染可激活STAT3磷酸化,且pSTAT3的上升与pChk1的下降存在对应关系。上述研究结果表明,MDV感染通过抑制Chk1的磷酸化,阻碍ATR-Chk1通路下游信号的转导,促进病毒自身的复制,而这一调控机制与STAT3通路的激活存在一定联系。3.MDV激活STAT3调控ATR-Chk1通路STAT3作为一种重要的核转录因子,在多种生理过程中起作用,包括胚胎发育、炎症、免疫、伤口愈合和肿瘤的发生。Western-blot检测Md5和CVI988感染3、6、12、24、48和72 h的CEF细胞样品,发现MDV在感染早期3 h即引起STAT3的705位酪氨酸和727位丝氨酸磷酸化激活,并随着感染时间增加,pSTAT3和STAT3含量逐渐升高。使用抑制剂Stattic阻断细胞内STAT3激活,可导致细胞内pChk1升高,并且在STAT3被抑制的情况下,MDV感染无法抑制Chk1磷酸化。Western-blot和RT-PCR检测Md5和CVI988感染细胞证实,使用抑制剂Stattic预处理CEF细胞后,抑制剂处理组与对照组相比,MDV的病毒蛋白VP22表达量下降、病毒基因VP22和pp38的mRNA水平下降,说明细胞内STAT3通路被抑制,导致MDV无法阻断ATR-Chk1通路,造成病毒复制减少。本研究表明,STAT3是MDV抑制ATR-Chk1通路的关键分子。4.细胞氧化应激反应调控MDV复制活性氧（ROS）会损害脂质,蛋白质和DNA,从而引起各种疾病,如衰老、癌症和退行性神经元疾病等。在致瘤病毒中,氧化应激反应与细胞癌变以及病毒再激活有关。本研究使用活性氧的细胞渗透性指示剂H2DCFDA测定Md5感染细胞中ROS的水平,通过荧光显微镜和流式细胞分析技术,发现Md5感染1 d后,实验组细胞与对照组相比ROS增加,随着感染天数增加,ROS在MDV感染细胞中逐渐积累。已有研究表明ROS作为信号分子,可提高细胞内NADPH氧化酶活性,从而激活JAK/STAT3通路。因此本研究使用NADPH氧化酶抑制剂 Apocynin（APO）和 Diphenyleneiodonium（DPI）处理 CEF 细胞,Western-blot检测Md5的复制发现,使用NADPH氧化酶抑制剂APO和DPI处理细胞,可抑制细胞内STAT3通路,使pChk1水平升高,MDV复制减少。RT-PCR检测也证实,抑制剂APO和DPI处理组中病毒基因VP22和pp38的mRNA水平低于对照组。上述研究结果表明,MDV感染可引起细胞内ROS积累,通过氧化应激反应,提高NADPH氧化酶活性,从而激活STAT3通路,导致ATR-Chk1通路的抑制,促进病毒增殖。而打破细胞氧化还原平衡,抑制NADPH氧化酶活性,病毒复制减少,这一发现证明ROS-STAT3在MDV感染中起到重要作用。5.丹顶鹤马立克病临床病例的分子生物学诊断MDV可以感染鸡形目、鸮形目、雁形目和隼形目。通过对南京红山动物园的丹顶鹤进行剖检和组织病理切片检查发现,发病丹顶鹤全身布满肿瘤结节,心脏和肝脏切片显示组织中存在大、中、小三型多形型淋巴样细胞,为肿瘤细胞典型特征。利用分子生物学诊断技术鉴定丹顶鹤组织样品,分别通过RT-PCR和PCR方法在两只疑似感染MDV鹤的羽毛、肝脏、肾脏,肌肉和脾脏等组织的cDNA和基因组中均检测到MDV基因Meq和gB的基因片段。从鹤的脾脏和肝脏组织中扩增获得Meq、VP22和L-Meq全长基因,测序后对其蛋白质序列进行同源性比对和进化树分析,证实丹顶鹤中发现的MDV为血清1型强毒株,说明MDV可感染鹤形目并导致肿瘤发生。虽然动物园中人工饲养的丹顶鹤可考虑通过疫苗接种,预防MDV感染,但是野生鹤群无法接种疫苗,一旦感染MDV,可能对这一濒危种群产生巨大影响,而其迁徙特性,也会造成MDV扩散的风险。
张言坤[3]（2018）在《鸡传染性贫血病毒感染对鸡马立克病疫苗免疫效力的影响》文中研究指明鸡马立克病（Marek’s Disease,MD）是由鸡马立克病病毒（Marek’s Disease Virus,MDV）引起的一种常见的具有高度传染性的淋巴组织增生性疾病。目前主要靠疫苗免疫预防,但是近年来,鸡群虽然接种了鸡马立克病疫苗CVI988/Rispens株或814株,但是马立克病仍有发生。研究发现发病鸡群常伴随鸡传染性贫血病毒（Chicken Infections Anemia Virus,CIAV）、禽网状内皮组织增殖症病毒（Reticuloendosiliosis Virus,REV）等免疫抑制病毒感染的现象,免疫抑制病能导致机体生长迟缓等影响,从而给家禽养殖业造成巨大的经济损失。其中CIAV感染对MDV爆发的影响越来越引起人们的重视,CIAV主要引起鸡的再生障碍贫血以及免疫抑制,可以水平传播。早在19世纪80年代就发现MD发病鸡中感染CIAV,并且CIAV可以在鸡MDV肿瘤细胞系MDCC-MSB1细胞中传代并引起细胞病变。本研究利用SPF鸡人工模拟CIAV感染对MD疫苗免疫抑制的作用,从不同的角度揭示了CIAV对MD疫苗的免疫效果的影响,为鸡马立克病的预防提供科学的理论依据。1.感染CIAV SD15株显着降低马立克病疫苗对马立克病病毒的免疫保护力将200只1日龄的SPF鸡随机分为5组,饲养在动物房的负压空气过滤隔离罩内。1日龄时,第1、2、3、4组每组鸡均以正常剂量腹腔注射MDV商品化疫苗CVI988/Rispens,同时,第2和3组每组以400 EID50/只的剂量口服CIAV SD15株。5日龄第3、4、5组每组鸡均以2000 PFU/只的剂量腹腔注射MDV超强毒GX0101。整个试验为期90天,每天观察并记录鸡的病变及死亡情况。结果显示马立克病疫苗CVI988/Ripens能够对在5日龄感染2000 PFU GX0101的SPF鸡提供较好的免疫保护,CVI988/Rispens能够降低GX0101感染鸡的致病性,但是CIAV的感染增加了CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒鸡的死亡率,第1、2、3、4、5组鸡的死亡率分别为0%、14.3%、42.9%、5.71%以及31.4%。CIAV的感染降低了MD疫苗的免疫效果,增强MDV野毒的致病性。MDV GX0101株攻毒后第0、5、9、16、23、30、37、44天称量各组鸡的体重。10日龄时免疫禽流感、新城疫灭活疫苗,免疫后的第21、28、35天检测在鸡体诱导产生的抗体水平,在GX0101攻毒后第9天和第16天每组随机选取五只鸡进行剖检,采集脾脏、法氏囊和胸腺测量免疫器官指数。结果表明,相比CVI988/Rispens免疫组,CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组,不同时间体重差异不显着（P>0.05）,而CVI988/Rispens免疫GX0101、CIAV攻毒组均显着降低（P<0.05）。CIAV的感染显着抑制鸡体AIV-H9、NDV灭活疫苗抗体的产生,相比CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组,CVI988/Rispens免疫和GX0101、CIAV感染组抗体水平均显着降低（P<0.05）,CIAV感染诱发强烈的免疫抑制,引起胸腺、法氏囊的萎缩以及脾脏的肿大。2.感染CIAV SD15株显着降低马立克病疫苗对马立克病病毒复制的抑制作用MDV超强毒GX0101是从中国分离的含有REV-LTR片段的重组MDV,第3、4、5组在GX0101攻毒后5、9、16、23、30天,每组各随机选取6只鸡采集抗凝血分离淋巴细胞提取DNA,利用本实验室建立的荧光定量PCR方法检测GX0101的拷贝数。结果显示CVI988/Ripens能够抑制GX0101在鸡体内的复制水平,GX0101感染组在攻毒后第23天淋巴细胞中GX0101病毒拷贝数达到高峰,CVI988/Rispens免疫GX0101感染组攻毒后第16天淋巴细胞中GX0101拷贝数达到高峰,CVI988/Rispens免疫GX0101、CIAV感染组攻毒后淋巴细胞GX0101拷贝数持续增加至30天。在感染后不同时间检测GX0101拷贝数,GX0101感染组均显着高于CVI988/Rispens免疫GX0101、CIAV感染组（P<0.05）,高于CVI988/Rispens免疫GX0101感染组。第3、4组在GX0101攻毒后0、5、9、16、23天,每组随机选取6只鸡采集抗凝血分离淋巴细胞提取RNA,针对性的选择了参与炎症反应的IL-6,具有免疫调节抑制作用的IL-18,具有抗病毒活性的IFN-γ,从细胞转录水平揭示感染CIAV影响MD疫苗CVI988/Rispens对MDV的免疫效果。IL-6,IL-18和IFN-γ的mRNA表达在GX0101攻毒5天后显着增加,然后再降低。MD疫苗的保护效力下降可能与后期的IL-18和IFN-γmRNA水平降低相关。当与CIAV感染时,对鸡IL-6的缺乏也可能导致MDV滴度增加和对MD的疫苗免疫性降低。CIAV感染明显降低了MD疫苗的免疫效果,增强MDV野毒的复制水平。CIAV或者其它免疫抑制病的感染可能是近年来中国MD频发的一个原因。
段伦涛[4]（2014）在《敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CV1988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较研究》文中指出马立克氏病是世界上唯一可以使用疫苗预防的肿瘤性疾病，它的预防给人类肿瘤疾病的研究建立了很好的模型。但是，随着MDV疫苗的不断使用，在免疫选择下马立克氏病病毒的毒力也在不断的增强，早期的HVT疫苗很难控制目前一些超强毒株的MDV，即使是在世界各国广发使用的CVI988/Rispens疫苗株免疫的鸡场，依然常见有MD的爆发，为了更好的控制MDV给养禽业带来的损失，世界各国科研工作者正在不断的研发MDV疫苗，如美国禽病肿瘤研究所构建的Md5△Meq能够提供针对Md5超强毒株的免疫保护作用，在此基础上，本实验室构建完成了bac-GX0101△M eq△K ana毒株并筛选到了一备用疫苗株，命名为SC9-1，本试验对SC9-1毒株的免疫保护作用进行了比较性研究。在敲除抗卡那霉素基因之前，苏帅等人已经比较了SC9-1毒株前身bac-GX0101△M eq株与CVI988/Rispens标准疫苗株之间针对Md5超强毒的免疫保护作用，结果bac-GX0101△M eq能够提供100%的保护力，而相同的条件下，CVI988/Rispens在SPF鸡上对超强毒Md5的保护力只有89%。而作为疫苗带有抗卡那霉素抗性的基因是不符合生物安全要求的，在敲除抗卡那霉素基因以后，bac-GX0101△M eq基因组序列发生改变后，它针对外源MDV感染的防治是否还是有效呢？本研究再次系统的的比较了SC9-1与商品化CVI988/Rispens疫苗间的免疫保护作用。苏帅等人使用的攻毒毒株为Md5毒株，但是本研究为了更全面的评价SC9-1毒株的免疫保护作用，选用了另一毒力稍弱的超强毒株GX0101。然后，本研究系统的比较了SC9-1毒株与标准疫苗株CVI988/Rispens对MDV超强毒GX0101攻毒的免疫保护作用。在实验设计方面选择了不含母源抗体的SFP鸡和含有母源抗体的海兰褐鸡作为实验动物，本实验将1日龄SPF鸡120只随机分成4组，每组30只，分别饲养在正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时，第1组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种SC9-1；第2组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种CVI988/Rispens；第3、4组为不免疫攻毒对照组。免疫接种5天后，第1、2、3组分别以2000PFU/只的剂量腹腔接种MDV GX0101。饲养至90日龄，记录死亡情况，对死亡鸡只剖检，并取疑似马立克特有病变脏器做病理切片。期间，检测不同免疫状态下病毒GX0101的增殖动态以及禽流感、新城疫灭活苗在鸡体诱导产生抗体的水平。对含有MDV母源抗体的海蓝褐鸡的试验方案与SPF鸡一致。经试验比较，SC9-1株对感染MDV GX0101的SPF鸡、海兰褐鸡均提供100%的免疫保护作用；CVI988/Rispens对SPF鸡、海兰褐鸡分别提供86.7%、93%的免疫保护作用。未免疫SPF鸡攻毒组死亡率为53.3%，肿瘤率为16.7%；未免疫海兰褐鸡攻毒组死亡率为36.7%，肿瘤率为6.67%；相比，空白对照组鸡只没有任何病变及死亡。荧光定量结果显示，淋巴细胞和羽毛囊DNA中，SC9-1免疫组鸡体内GX0101的病毒拷贝数显着低于CVI988/Rispens免疫组。血凝抑制试验结果显示，SC9-1免疫攻毒组鸡的产生的AIV、NDV抗体水平高于CVI988/Rispens免疫攻毒组。所以，SC9-1株免疫无论在SPF鸡还是含有MDV母源抗体的海兰褐鸡均能提供比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果。
苏帅[5]（2013）在《重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究》文中研究说明马立克氏病毒（Marek′s disease virus, MDV）是α疱疹病毒的成员，基因组为180kb左右的双股DNA，可引起鸡的淋巴细胞瘤。GX0101株MDV是国内外从鸡体内分离到的第一株整合有网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus, REV）长末端重复序列（Long terminal repeat, LTR）的重组野毒株。本实验室前期研究中已经构建了GX0101的细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome, BAC）克隆以及敲除REV-LTR的突变株GX0101LTR，证实REV-LTR插入片段显着增强了GX0101的横向传播能力。敲除肿瘤基因meq的突变株GX0101meq病毒不但丧失对SPF鸡的致病性，而且不再引起肿瘤以及胸腺和法氏囊萎缩。本学位论文在上述研究的基础上，进一步构建不同的突变株，并以此深入研究MDV相关的生物学活性和研发MDV的基因缺失疫苗。1完成了GX0101株MDV的全基因组序列分析自然重组病毒GX0101在致病性、免疫原性、横向传播能力等方面具有独特的生物学活性。为了对GX0101进一步的分子病毒学研究，本研究利用GX0101的BAC克隆结合高通量测序技术完成了对其全基因组的序列分析。GX0101全基因组长178101bp,其基因组的TRL、UL、IRL、IRS、US和TRS区分别长12758bp、113572bp、12741bp、12700bp、11695bp、13134bp。GX0101全基因组仅含有一个REV-LTR重组片段，位于其基因组US区的SORF1中，SORF2基因前267bp碱基处。与rMd5不同，GX0101含有一个SORF2基因。通过与已发表的近10株MDV的比较,发现GX0101与英国分离株C12/130的两个不同毒力的感染性克隆pC12/130-10和pC12/130-15同源性最高。除了GX0101比其它毒株多出REV-LTR片段外，在经比较的190个开放阅读框（Open reading frame，ORF）中，不同毒株间发生不同程度变异的有77个。在这77个ORFs中， GX0101与pC12/130-10、pC12/130-15两个克隆呈100%同源的ORF分别有50个和47个，但与RB1B、Md5、GA、814和CVI988等毒株却只有7-27个ORFs呈现100%同源性。GX0101基因组TRS区的MDV97.3-97.6开放阅读框中，有5个连续的217bp碱基的重复，显着多于其它不同毒株的拷贝数。GX0101基因组的IRS区的86.2-86.4开放阅读框中，存在3个相同的217bp的重复序列，而其它MDV仅含有1-2拷贝的重复。GX0101的全基因组序列的比较分析，将有助于阐明与MDV致病性、传播性相关的基因，也有助于揭示不同地域间MDV的遗传变异和演化关系。2构建了meq基因缺失性疫苗候选株SC9-1，在SPF鸡实验中显示出比国内外最广泛应用的CVI988/Rispens有更好的保护性免疫力重组病毒GX0101meq表现出良好的保护性免疫作用，但基因组中带有卡纳霉素抗性基因，不符合农业转基因生物安全条例，因此不能作为疫苗使用。本研究设计的“对flp重组酶的部分诱导结合多重筛选”的方法，敲除掉GX0101meq中的卡那霉素抗性基因，筛选到具有良好复制能力的SC9-1（GX0101meq kana）株MDV。将SC9-1株MDV接种SPF鸡和含有MDV母源抗体的海兰褐蛋鸡，既没有致肿瘤性，也没有呈现免疫抑制、生长迟缓等任何致病性，而且能够为免疫鸡提供比CVI988/Rispens更好的保护性免疫。多次重复SC9-1株MDV对SPF鸡的免疫保护试验，以500PFU/只的剂量感染MDV超强毒rMd5，SC9-1均提供100%的免疫保护，显着高于CVI988/Rispens的免疫保护（保护率80-90%）。将SC9-1感染性克隆DNA通过肌肉注射1日龄SPF鸡，14天后能从鸡的体内分离到SC9-1病毒。为进一步探讨SC9-1的BAC质粒作为DNA疫苗提供思路。SC9-1株MDV基因缺失疫苗已获得农业部环境释放的审批书，并在3000只海兰褐蛋鸡完成了6个月的环境释放试验，并且持续观察6个月，不仅符合农业转基因生物安全，而且呈现很好的免疫保护效果，是一株理想的新型疫苗株，并且已经转让给北京翎羽生物科技有限公司进行后续相关的生产性试验。制备的中试产品证明SC9-1能提供比国内外最广泛应用的CVI988/Rispens株疫苗更好的保护性免疫力3对GX0101和GX0101LTR混合感染鸡群后连续病毒鉴别定量跟踪试验证明，REV-LTR插入片段使GX0101提高横向传播性，是其成为流行毒株的竞争性选择压优势为了模拟自然感染传播模式，比较并证实GX0101相对于其突变株GX0101LTR在鸡群横向传播上的竞争性选择压优势,本研究比较研究了能够对GX0101和GX0101LTR病毒基因组作鉴别性定量的双重荧光定量PCR的引物、探针和反应体系,并且成功的用于动态比较鸡群共感染以上两种病毒后在连续传代过程中不同病毒病毒血症。结果表明，将GX0101、GX0101LTR同等剂量感染SPF鸡后，第一代用于接触感染的空白SPF鸡在接触感染14天时即可检测到感染GX0101，而在接触感染28天时才能检测到感染GX0101LTR；而第二代用于接触感染的鸡在接触感染21、28天均能检测到感染GX0101，在28天时仅有一只鸡检测到GX0101LTR；同样第三代用于接触感染的鸡在与第二代鸡接触感染21、28天均能检测到感染GX0101，而没有检测到GX0101LTR。将GX0101显着低于GX0101LTR（100PFU/只的GX0101和2000PFU/只的GX0101LTR）的病毒共感染SPF鸡群，同一个隔离罩饲养进行接触感染传播。连续2次传代后，虽然在一部分接触感染病毒的鸡（6/10）中仍能够检出GX0101LTR，甚至在个别鸡仍为优势毒株，但是接触感染病毒的鸡全部能够检出带有REV-LTR的GX0101,并且部分鸡（4/10）仅能检出GX0101，不能检出GX0101LTR。以上结果证明了在鸡群内自然感染和传播过程中，带有REV-LTR的GX0101相对于敲除其REV-LTR的GX0101LTR株在横向传播性上显示出明显的竞争性选择压优势。这可以解释为什么在鸡群中发生率很低的MDV与REV间的基因重组产生的整合有REV-LTR的GX0101能从极低的比例演变为从鸡群中易于分离到的流行株的生物学机制。4敲除GX0101株SORF2基因的生物学活性比较表明SORF2基因表达产物与MDV不同株的横向传播性密切相关REV-LTR片段具有真核启动子和增强子活性，能够增强位于其插入位点后的MDV基因的表达。GX0101基因组中的REV-LTR片段位于SORF2基因上游,其对SORF2基因的转录表达都可能有很大影响，为了深入研究重组病毒GX0101的SORF2基因功能，本研究在感染性克隆GX0101-BAC的基础上构建了SORF2基因缺失株GX0101sorf2。试验结果表明SORF2基因并非MDV复制以及致肿瘤必需基因，敲除掉SORF2基因的GX0101sorf2在细胞培养与GX0101的复制能力相同。与GX0101相比，GX0101sorf2对鸡的致死率以及致肿瘤率下降，但是差异不显着。GX0101sorf2横向传播的感染率低于GX0101。GX0101中的REV-LTR片段插入增强SORF2蛋白的表达，表明GX0101具有较强的横向传播能力可能与SORF2蛋白的大量表达这一分子机制相关。5插入ALV-LTR的重组MDV的构建及其生物学活性的比较研究ALV与REV一样同属于禽反转录病毒，在我国鸡群中普遍存在MDV与ALV的共感染。为了研究ALV-LTR片段在GX0101基因组重组位点上的稳定性，以及ALV-LTR片段的插入对MDV生物学活性的影响，并以此为模型研究ALV与MDV的重组病毒。本研究利用基于链霉素负筛选系统的同源重组方法将ALV-J中国分离株NX0101的LTR片段完全等位取代bac-GX0101的REV-LTR片段，构建了含有ALV-LTR片段的重组病毒GX0101-ALV-LTR。GX0101-ALV-LTR在细胞培养上具有与GX0101相似的复制能力，在细胞上连续传代20代，通过PCR验证，ALV-LTR都能在GX0101-ALV-LTR的基因组中稳定存在。将GX0101-ALV-LTR接种1日龄SPF鸡，接种后6-8周，PCR验证ALV-LTR能在GX0101-ALV-LTR基因组中稳定存在。通过接触感染的病毒基因组中ALV-LTR依然能够稳定遗传。攻毒90天，GX0101-ALV-LTR的死亡率和肿瘤率分别为55%和20%。相比GX0101LTR，间接免疫荧光以及Western Blot试验显示，GX0101-ALV-LTR的SORF2蛋白表达量显着增加；Northern Blot试验显示GX0101-ALV-LTR的SORF2、US1、US10基因转录量显着增加。GX0101-ALV-LTR是国内外第一株整合进ALV来源LTR的重组MDV,证实整合进MDV同一位点的ALV-LTR片段能与插入的REV-LTR片段一样稳定遗传，并显示类似的生物学特性。6用基因芯片技术比较分析了LTR插入片段对重组MDV中不同基因表达水平的影响利用定制的Agilent表达谱芯片，分析比较了带有REV-LTR的GX0101及其LTR敲除株GX0101LTR和ALV-LTR替代株GX0101-ALV-LTR在感染CEF细胞上的病毒不同基因的表达水平。结果表明，在GX0101与GX0101LTR病毒差异表达显着的基因中（P<0.05），75个MDV基因GX0101的转录水平显着增高，其中上调倍数大于10倍的共14个基因，而位于REV-LTR片段直接下游的SORF2、US1、US10基因上调倍数多达30倍以上，其中SORF2基因上调最为显着，高达399倍；GX0101的UL38基因转录降低，下调倍数为8.3倍。GX0101-ALV-LTR与GX0101非常类似，与GX0101LTR相比，同样位于ALV-LTR片段直接下游的SORF2、US1、US10基因上调倍数多达30倍以上，SORF2基因上调最为显着；GX0101-ALV-LTR的UL38基因转录下调倍数为6.7倍。利用Northern Blot以及Western Blot试验证实了插入LTR片段的重组病毒SORF2的转录子及表达蛋白均显着升高。这些比较研究结果将有助于进一步分析LTR插入片段赋予重组MDV显着升高的横向传播性究竟与MDV的那些基因表达产物相关。7用基因芯片技术比较分析了LTR插入片段对重组MDV感染的细胞基因组不同基因转录水平的影响利用定制的Agilent表达谱芯片，分析比较了带有REV-LTR的GX0101及其LTR敲除株GX0101LTR和ALV-LTR替代株GX0101-ALV-LTR对感染的CEF细胞基因组不同基因的表达水平的影响。对鸡41765个基因的表达差异进行了分析，结果显示，感染GX0101的CEF细胞基因与感染GX0101LTR相比，转录显着增高的有12个基因（差异倍数大于20倍），其中ChEST1024a11（GeneBank NO. BU288902.1）、SKOR2（GeneBank NO. XM001233569.2）上调倍数分别为190倍、165倍；转录显着降低的基因有4个基因（差异倍数大于20倍），其中ChEST445i1（GeneBank NO. CR390488.1）下调倍数为105倍。感染GX0101-ALV-LTR的CEF细胞基因与感染GX0101LTR相比，转录显着增高的有5个基因（差异倍数大于20倍），其中ChEST1024a11（GeneBank NO. BU288902.1）、SKOR2（GeneBank NO. XM001233569.2）上调倍数分别为203倍、83倍；转录水平下降基因的下调倍数均小于20倍。通过基因芯片表达谱筛选出的显着差异基因有助于进一步研究插入LTR片段的重组MDV病毒不同的生物学活性与宿主基因转录水平的相关性。本研究不仅进一步通过模拟自然感染模式证明REV-LTR插入片段显着提高了病毒GX0101在鸡群中的横向传播性，是其从极少数的突变株变为流行株的流行病学机制，也部分阐明了REV-LTR提高GX0101横向传播性的分子机制。还利用BAC克隆技术将GX0101改造成了一株保护免疫力优于CVI988/Rispens的新的疫苗候选株。
赵扬[6]（2013）在《马立克病毒新ORF的鉴定》文中认为马立克病（Marek’s disease, MD）是由马立克病病毒（Marek’s disease virus, MDV）引起的以单核细胞浸润为特征并诱发各个器官出现淋巴瘤的高度传染性疾病,并造成免疫抑制,引起继发感染,给养鸡业造成巨大的经济损失。随着MDV-1多个毒株基因全序列测序完成,人们对MDV-1的生物学特性有了进一步了解,同时推测出新的开放阅读框（Open Read Frame, ORF）,为从分子水平研究MDV的生物学特性拓宽道路。本论文以CVI988/Rispens基因组为基础着重鉴定部分MDV-1特有的新ORF是否为蛋白编码基因,为研究马立克病毒致病机制、致瘤机制、毒力致弱机制及其疫苗免疫机制等奠定基础。从推测的70个新ORF中选择能编码大于100aa的MDV-1特有的新ORF,有ORF1.0/ORF80.0、ORF5.6/ORF75.9、ORF89.5、ORF91.5和ORF97.3复合要求,通过DNAstar软件进行抗原性分析并设计引物扩增选定的新ORF。通过RT-PCR方法初步筛选能在接毒CVI988/Rispens的鸡胚成纤维细胞（Chicken Embryo Fibroblast,CEF）转录的新ORF,结果表明,在接毒CVI988/Rispens的CEF中只存在ORF5.6/ORF75.9、ORF91.5和ORF97.3的mRNA。将ORF5.6/ORF75.9、ORF91.5和ORF97.3扩增,并最终分别连接到表达载体PET-32a中,测序验证正确后转化表达宿主菌BL21,通过IPTG进行诱导表达,结果三个重组菌分别表达出分子质量约为33kDa、36kDa和31k Da的重组目的蛋白。以重组目的蛋白为免疫原,免疫家兔制备兔抗重组目的蛋白阳性血清,然后以兔抗重组蛋白阳性血清为一抗,通过间接荧光法（IFA）证实三个新ORF基因均能在CVI988/Rispens感染的CEF中表达。但Western-blot分析表明只有ORF91.5的重组目的蛋白能与鸡抗CVI988/Rispens P日性血清发生反应,而ORF5.6/ORF75.9和ORF97.3的重组目的蛋白均不能与鸡抗CVI988/Rispens阳性血清发生反应。为了进一步验证ORF5.6/ORF75.9和ORF97.3是否在鸡体中表达,本论文采集攻毒CVI988/Rispens7d,14d和21d的鸡的脾脏和肝脏,并提取总RNA,通过RT-PCR方法鉴定在鸡体中是否存在ORF5.6/ORF75.9基因的ORF97.3其结果表明mRNA。的ORF5.6/ORF75.9存在于14d的脾脏和肝脏及21d的脾脏,但21d的脾脏mRNA中的量明显减少,然而均未能检测到mRNA的ORF97.3mRNA。用生物信息学分析ORF5.6/ORF75.9、ORF91.5和ORF97.3,其存在于MDV-1,在HVT （the turkey of herpisvirus）、MDV-2及HSV （herpesvirus simple virus）没有出现相应的同源基因,用PROSITE工具进行蛋白质基序搜索,未发现任何蛋白质基序,用NCBI protein blast工具比对发现ORF5.6/ORF75.9和ORF91.5在MDV-1不同毒株中同源性非常高,而ORF97.3在不同MDV-1毒株中具有规律突变。本实验通过RT-PCR和间接免疫荧光第一次鉴定ORF5.6/ORF75.9、ORF91.5和ORF97.3为蛋白编码基因,同时通过Western-blot方法、RT-PCR检测新ORF在鸡体中的转录情况,简单分析了三个新ORF在鸡体和CEF细胞中的可能作用,为MDV-1生物学特性的进一步研究提供了宝贵的资料和数据。
黄海琼[7]（2013）在《表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组马立克病毒疫苗株的构建》文中进行了进一步梳理鸡传染性喉气管炎（Infectious Laryngotracheitis, ILT）是由鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus, ILTV）引起的急性呼吸道疾病。该病具有急性爆发和潜伏感染的特点,给养禽业造成巨大的经济损失。由于ILTV弱毒疫苗能引起潜伏感染,并且在鸡群中的传播会造成毒力返强,从而成为新的感染来源；因此,迫切需要研制安全、高效的新型ILT疫苗。本研究以马立克氏病毒（MDV） CVI988/Rispens疫苗毒株为载体,构建表达ILTV保护性抗原gB糖蛋白的重组病毒,并分别评价重组病毒对ILT和马立克氏病的免疫效果。本研究以CVI988/Rispens疫苗毒株基因组短独特区的sorf1和sorf2作为ILTV gB基因插入位点,以网状内皮增生症病毒（REV）的长末端重复序列（LTR）为启动子、绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报告基因,构建转移载体质粒pMDV-gB-GFP。用磷酸钙共沉淀法将pMDV-gB-GFP和CVI988/Rispens基因组DNA共转染鸡胚成纤维（CEF）细胞,获得带有EGFP标志的重组病毒；经有限稀释法纯化、筛选,获得带有EGFP标志的重组病毒rMDV-gB-GFP。用Cre重组酶去除rMDV-gB-GFP的EGFP基因,得到重组病毒rMDV-gB。经PCR、间接免疫荧光试验（IFA）和Western-blot试验鉴定,证明重组病毒rMDV-gB基因组中插入了ILTV gB基因,并能表达ILTV gB糖蛋白。本研究评价了rMDV-gB对ILTV强毒株攻击的免疫保护效果。将90只1日龄SPF鸡随机分成4组：rMDV-gB免疫组、rMDV-gB与ILTV弱毒疫苗联合免疫组、ILTV弱毒疫苗免疫组、攻毒对照组。前两组的试验鸡1日龄时分别颈部皮下接种5000空斑形成单位（PFU）的rMDV-gB;第二组和第三组的试验鸡于21日龄时接种1羽份的ILTV弱毒疫苗；42日龄时,各组试验鸡均用105EID50/鸡的ILTV强毒株攻击。观察试验鸡的症状表现,并于攻毒后第10天进行剖检和病理组织学检查。结果显示,在ILTV强毒株攻击后,rMDV-gB免疫组的保护率为65%,而ILTV弱毒疫苗组的保护率为41%,rMDV-gB的保护效力明显高于ILTV弱毒疫苗。本研究还发现,在1日龄雏鸡接种rMDV-gB后,再于21日龄接种ILTV弱毒疫苗,并不能提高对ILTV强毒株攻击的保护作用；表明1日龄雏鸡接种rMDV-gB后就能建立起针对ILTV的有效免疫力。本研究还评价了rMDV-gB对MDV RB1B超强毒株攻击的免疫保护效果。将60只1日龄SPF鸡随机分为3个试验组：rMDV-gB免疫组、CV1988/Rispens免疫组、攻毒对照组,每组20只试验鸡；rMDV-gB免疫组和CVI988/Rispens免疫组的试验鸡分别于1日龄时颈皮下接种5000PFU/鸡的相应疫苗；7日龄时,所有试验鸡经腹腔接种500PFU/鸡的MDV RB1B超强毒株。连续观察90天,记录各试验组鸡的发病和死亡情况。经统计,攻毒对照组90%的鸡死于马立克氏病,而rMDV-gB免疫组和CVI988/Rispens疫苗组的保护率均为100%,表明rMDV-gB可对MDV超强毒株的攻击能产生足够的保护。
张小荣[8]（2012）在《2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究及以马立克病毒为载体的基因工程疫苗研制》文中研究表明禽传染性支气管炎病毒（avian infectious bronchitis virus,IBV）属于冠状病毒科冠状病毒属中的γ-冠状病毒,由该病毒感染引起的疾病称为禽传染性支气管炎（avian infectious bronchitis,IB）,是一种对鸡危害非常严重的急性、高度传染性的病毒性呼吸道疾病,可导致鸡的增重和饲料报酬降低,也能引起蛋鸡产蛋量和蛋的品质下降等,因此具有重要的经济意义,免疫预防是目前控制该病的最为有效的手段。IBV的重要特点之一就是血清型众多,不同血清型之间交叉保护性较低甚至完全不能保护,因此在生产中必须选用与流行毒株血清型一致的疫苗才能取得良好的免疫保护效果。不同血清型的IBV具有典型的地域性流行特征,而且由于病毒基因组的突变和毒株间的重组使得新的血清型不断出现,使免疫预防日益复杂化。本研究的目的旨在通过系统的流行病学监测了解近年来不同基因型IBV在我国的流行状况,通过生物信息学分析阐明不同IBV基因型间遗传演化的规律和发展趋势,并针对流行的优势基因型毒株研制新型疫苗。1、2009-2011年间国内IBV流行病学监测与流行株的遗传进化分析2009-2011年间,共从国内主要养鸡省份分离到IBV流行毒株54株,其中肉鸡源毒株52株,蛋鸡源毒株2株。在肉鸡源毒株中我们发现存在较高比例的IBV与H9亚型AIV的混合感染（25/52）,发生混合感染的鸡群往往发病更为严重,且混合感染样品对接种的鸡胚表现出更强的致病性,该结果提示这两种病毒之间可能存在一定程度的致病协同作用。对所有分离毒株S1基因进行克隆和基因测序,共发现4种不同的S1基因长度,分别为1611bp、1617bp、1620bp和1626bp,说明S1基因中碱基的插入和缺失是一种非常普遍的现象。将54个分离株S1基因序列和近年来在国内及周边国家和地区流行的13个基因型共57个参考毒株的S1基因序列用Mega4.1软件进行遗传进化分析,结果显示54个分离株可以分为QX型（42株）、HN-08型（5株）、LSC/991型（2株）、TW-I型（2株）、Mass型（1株）、793/B型（1株）和CHⅢ型（1株）等7个基因型。在所有分离株中,QX型分离株数量最多,占总数的77.8%（42/54）。从进化树中还可以看出,QX型分离株又可以进一步细分为两个不同的基因亚群-Cluster Ⅰ（21株）和Cluster Ⅱ（21株）,经典的QX型参考毒株QXIBV和LX4株均属于Cluster Ⅰ亚群,而Cluster Ⅱ亚群中的毒株均在2010年才开始出现。为了更加系统地描述同期内国内不同基因型IBV的分布情况,我们将已经在GenBank发表全长S1基因序列的所有同时期分离株共296株合并进行遗传进化分析,结果显示,350个同时期分离株可分为19个基因型,其中11个基因型均能根据现有文献报道找到同源的参考毒株,根据各基因型中包含的毒株数量多少依次为：QX型（219株）、HN-08型（26株）、LSC/99I型（22株）、LDT3/03型（12株）、TW-I型（12株）、CH Ⅲ型（11株）、Mass型（10株）、LDL/971型（3株）、CH VI型（3株）、TW-Ⅱ型（2株）和793/B型（1株）,此外还有8个基因型未能归入已被正式命名的已知基因型,因此暂定名为未定型Ⅰ～未定型Ⅷ。从分型结果可以看出,我国流行的IBV基因型具有典型的地域性分布特征,大多数在周边国家和地区广泛流行的基因型在我国并未发现。为阐明国内不同基因型毒株之间的遗传演化关系,根据遗传进化和基因分型的结果,从不同基因型中选择代表性毒株,用RDP3.31软件对S1基因进行重组分析。结果显示当前国内流行的毒株中存在广泛的重组现象,不同基因型间的重组事件不仅导致同一基因型内部发生分化,出现了不同基因亚群,而且经过多次的同源重组后可能会导致新的基因型毒株的出现。综合不同基因型间发生的系列重组事件,可以推断：QX型、LSC/991型、793/B型、LDL/971型、TW-Ⅰ型和TW-Ⅱ型是目前在我国流行的所有基因型毒株的原型毒株,除此以外的新出现的基因型均是在这6个基因型的基础上经过一次或多次的同源重组而产生的变异株。2、Mass型H120活疫苗对当前流行的主要基因型代表毒株的免疫保护效力试验根据遗传进化分析的结果,从当前主要流行的三个IBV基因型中挑选出4个代表毒株：AH/2009/1（QX型Cluster Ⅰ亚群）、JS/2010/12（QX型Cluster Ⅱ亚群）、JS/2009/5（LSC/99I型）和JS/2010/6（HN08型）,分别用Mass型IBV活疫苗（H120株）进行免疫保护效力试验,以评价现有疫苗对流行毒株的免疫保护状况。结果显示H120疫苗株对不同基因型的IBV毒株免疫保护效力存在较大差异,对同属于Mass基因型的M41强毒株能够提供完全保护，且能显着降低攻毒后气管和肾脏的排毒率；对于QX型毒株AH/2009/1和JS/2010/12,基本达到临床保护标准,但试验鸡气管和肾脏带毒的比例远远高于M41攻毒组,说明局部免疫保护效果不是非常理想；对于HN08型的JS/2010/6株和LSC/991型的JS/2009/5株保护效果均不理想,攻毒后鸡群表现出较为严重的临床症状和相当高的气管和肾脏排毒率。该结果提示我们,现有疫苗已经不能对当前流行的主要基因型毒株提供良好的免疫保护,急需研究开发与流行毒株基因型一致的新疫苗用于该病的防控。3、以马立克病毒为载体研制QX型IBV基因工程疫苗本研究以MDV CV1988/Rispens疫苗毒株为载体,以其IRS-US间隔区作为插入位点,选择网状内皮组织增生症病毒（REV）基因组长末端重复序列（LTR）作为启动子,构建含QX型IBV分离株CK/CH/JS/06Ⅱ S1基因及报告基因EGFP的转移载体pUP-LTR-EGFP-S1-DOWN。将MDV基因组DNA与转移载体共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经同源重组获得重组病毒,通过多轮荧光筛选和纯化,最终获得的重组病毒命名为rMDV-EGFP-S1。进一步通过Cre重组酶介导的重组反应敲除EGFP报告基因,获得仅带有LTR启动子和S1基因的重组病毒,命名为rMDV-S1。通过PCR和间接免疫荧光试验（IFA）对重组病毒进行鉴定,结果表明S1基因完全按照预定方式正确插入到MDV基因组中并能够表达S1蛋白。将重组病毒在CEF上进行连续30代传代培养,经PCR和IFA试验鉴定,该重组病毒具有良好的遗传稳定性。重组病毒rMDV-S1。对QX型IBV强毒株CK/CH/JS/06Ⅱ的免疫攻毒保护效力试验结果显示,重组病毒按5×103PFU/羽的剂量免疫1日龄SPF鸡,免疫后4w攻毒,免疫组试验鸡发病率和死亡率分别为30%和5%,对照组则分别为100%和30%,经χ2检验差异显着（p<0.05）。排毒检测结果显示,免疫组气管排毒率在攻毒后部分时间点与对照组相比差异显着,攻毒后14d扑杀时肾脏排毒率差异极显着（p<0.01）。免疫组试验鸡攻毒后的增重未受明显影响,与对照组相比差异显着（p<0.05）。病理组织学检查结果显示与对照组相比免疫组试验鸡肾脏的病变程度相对较轻。所有结果均表明重组病毒对QX型强毒株的攻击能够提供良好的免疫保护。重组病毒对MDV强毒株RB1B的免疫攻毒保护试验结果显示,与亲本病毒CV1988/Rispens相比,对MDV本身的免疫保护效率未受明显影响,说明该重组病毒可以作为二联疫苗同时用于IB和MD两种疾病的免疫预防。
张晨飞[9]（2009）在《MDV-1 CVI988疫苗株VP22及UL13蛋白功能初步研究》文中进行了进一步梳理血清I型马立克氏病病毒（Marek’s disease virus serotype 1,MDV-1）的UL49基因和UL13基因分别和单纯疱疹病毒I型的UL49及UL13基因同源,各自编码大小约27.6kDa和57.1kDa大小的蛋白,在HSV-1中,这两种蛋白均为主要的被膜蛋白。VP22被发现在不存在其他病毒蛋白的情况下具备蛋白转导的功能,并且目前已经有很多研究表明VP22能够转运其它蛋白在细胞间扩散,使其在克服基因治疗和基因免疫的缺陷方面具有得天独厚的优势。而UL13作为病毒自身编码的丝/苏氨酸蛋白激酶,在病毒复制、组装、以及调节宿主细胞转录翻译方面发挥着重要作用。在HSV中,VP22是UL13的主要病毒蛋白底物,并且有研究发现VP22的磷酸化可能影响该蛋白的定位,而在MDV中还未有类似报道。目前关于MDV VP22及UL13的研究相对较少,究竟MDV VP22是否也能作为蛋白转运的工具?又有哪些蛋白能够被该蛋白转运?MDV VP22的转运功能是否能够增强机体针对目的蛋白的免疫应答水平?VP22的转导特性又如何?在MDV中,UL13是否能够磷酸化VP22?该磷酸化修饰对VP22又有何影响?这些都需要进一步的实验进行探索。本研究旨在通过对上述问题的探索,为VP22进一步走向应用打好基础。1. VP22转运异源蛋白的研究MDV VP22具有独立的蛋白转导功能,能够在细胞间高效转导,为进一步探索该蛋白作为蛋白转运工具的可行性,本研究构建了GFP、AIV-NP、BoIFN-γ、IBDV-VP2以及NDV-F基因与MDV-1 VP22融合表达的重组质粒,并将所获得的重组质粒在COS-1上进行瞬时表达以观察上述不同融合蛋白在COS-1细胞上的定位情况,从而评价VP22对这4种蛋白的转运能力。结果发现GFP、AIV-NP及BoIFN-γ在与VP22融合表达的状态下能够被VP22高效转运,而VP22对NDV-F的转运效率较低,对IBDV-VP2则完全不具备转运能力。此外,被VP22转运后的蛋白均定位在细胞核内。这些研究结果说明MDV VP22能够作为蛋白转运的载体,但对所转运蛋白具有选择性,并且VP22能够改变被转运蛋白原始的细胞定位。2. VP22增强机体针对目的抗原免疫应答水平的评价MDV VP22蛋白具备蛋白转运的功能,能够转运与VP22融合表达的GFP、AIV-NP、BoIFN-γ以及NDV-F等蛋白,为进一步评价VP22对这几种蛋白的免疫增强效果,本研究将pNP-VP22、pBoIFN-γ-VP22及pF-VP22的重组表达融合蛋白的质粒免疫Balb/c小鼠,4免后采取小鼠血清并分离小鼠淋巴细胞,通过ELISA、ELISPOT以及流式细胞法检测各组小鼠的免疫应答水平,结果发现,VP22能够特异性增强BoIFN-γ的细胞免疫水平,而对其体液免疫没有多大的影响。相反,NP蛋白的体液免疫水平却显着增强,但细胞免疫增强的效果不明显。而对于F蛋白,VP22几乎对其无任何的免疫增强的效果。上述结果显示,MDV-1 VP22具备增强机体针对目的抗原的免疫应答的功能,但免疫应答的类型可能会受到VP22蛋白转运方式的影响。3. VP22转导机制的研究MDV VP22蛋白具有独立的蛋白转导功能,能够作为蛋白转运的工具,但其转导及细胞定位的机制还未确定。我们早期的研究发现,在MDV感染的CEF中,VP22定位于细胞核,为进一步研究该蛋白的转导机制及细胞定位机理,分析该蛋白在表达过程中细胞定位的影响因素,本研究通过重组人腺病毒表达VP22蛋白,并对重组病毒表达的VP22的转导功能进行鉴定,结果发现将重组病毒感染的AD-293细胞裂解产物加至正常的MDBK细胞上,VP22能够进入几乎所有的细胞,说明重组病毒表达的VP22蛋白具有很强的蛋白转导功能。进一步鉴定VP22的细胞定位发现,在重组病毒感染的AD-293细胞中,VP22首先聚集于细胞核周围,随后以特殊的荧光粒子的形式散在于胞浆中,有别于AD-293细胞中瞬时表达的VP22及MDV感染的CEF中VP22的定位模式;同时我们也对Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的VP22的蛋白转导特性以及VP22转导的细胞广谱性进行了研究,发现该系统表达的VP22也具有蛋白转导的功能,并且其定位可能受到温度的影响,而瞬时表达的VP22的转导是细胞广谱性的,能够在多种细胞上实现蛋白转导的功能,并且定位在细胞核内。4. MDV-1 UL13序列对比分析及对VP22可能的磷酸化位点预测蛋白激酶是一类庞大的蛋白家族,尽管它们的结构、催化模式以及特异性底物都存在很大的差异,但它们的功能结构域却相当保守。MDV UL13是病毒编码的蛋白激酶,本研究通过DNAStar软件的MegAlin功能对比MDV不同毒株以及不同疱疹病毒属的UL13氨基酸序列,发现MDV不同毒株的UL13序列近乎相同,而不同疱疹病毒属的UL13及相应同源物的同源性很低,但在它们的激酶结构域内保守。通过CDTree软件绘制该蛋白的遗传分类图谱,发现它与黑腹果蝇的pelle蛋白的功能结构域属于相同进化分支,利用NCBI protein Blast功能检索MDV UL13保守结构域,发现MDV UL13也具有丝/苏氨酸蛋白激酶的激酶结构域,并且催化中心主要位于152-297氨基酸残基间,利用Cn3D 4.1软件分析Blast结果,建立UL13可能的结构模型,同时对比真核生物蛋白激酶的基序,发现UL13在激酶SubdomainⅦ的保守甘氨酸残基被丝氨酸替代,SubdomainⅧ的保守非极性脯氨酸残基被极性半胱氨酸残基替换。利用NetPhos 2.0 Server对VP22进行磷酸化位点预测,发现该蛋白存在多个丝/苏氨酸磷酸化位点,且主要集中在两端,提示MDV VP22很有可能也是UL13的磷酸化底物。5. UL13的原核和真核表达以及多抗血清的制备MDV UL13蛋白是病毒自身编码的蛋白激酶,具有类似真核细胞蛋白激酶的功能,并且在整个疱疹病毒科内都具有保守性,为研究该蛋白激酶的功能,本研究通过PCR方法从CVI988疫苗株基因组中扩增UL13基因,并将UL13基因片段克隆到杆状病毒转移载体pFastTMBac1中,再将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经过转座和蓝白菌落筛选及PCR鉴定,获得含UL13基因的重组穿梭载体。在脂质体的辅助下将重组穿梭载体转染Sf9细胞,通过PCR验证获得含UL13基因的重组杆状病毒,命名为rBac-UL13。同时,利用GENEART（www.gcua.de）分析UL13在大肠杆菌中表达时密码子的偏嗜性;通过DNAstar抗原性分析确定UL13的高抗原性片段,进行原核表达,并以切胶免疫方法免疫小鼠制备多抗血清,再以获得的多抗血清检测rBac-UL13重组毒感染的sf9细胞,证实了所获多抗血清含有特异性针对UL13的抗体,同时也证实了UL13在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达。
陈鸿军,秦爱建,宋翠萍,张晨飞,邓绪芳[10]（2008）在《MDV VP22的N1-18是发挥蛋白转导功能必需的序列》文中研究指明血清Ⅰ型马立克氏病病毒（MDV-1）CVI988/Rispens弱毒株的VP22蛋白缺失201TKSERT206。为了进一步证实该缺失对MDV-1VP22蛋白转导功能和效率的影响,本研究通过将不同缺失型的VP22与EGFP相融合,转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光方法,检测VP22的蛋白转导现象。结果发现,EGFP-VP22具有微管结合、核膜结合、核酸结合、蛋白转导等特性;CVI988VP22与GA株VP22的转导效率相当,且只有完整长度的VP22具有明显的转导功能,其中,N端1～18aa对VP22的核定位及其蛋白转导功能的发挥意义很大。这一发现为利用MDV-1VP22携带其他目的蛋白转导,增强目的蛋白免疫原性及其治疗性功能具有重要的指导价值。
二、MDV CVI988/Rispens弱毒株VP22基因克隆和序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、MDV CVI988/Rispens弱毒株VP22基因克隆和序列分析（论文提纲范文）
（1）马立克病病毒被膜蛋白VP22的研究进展（论文提纲范文）
| 1 VP22的介绍 |
| 2 VP22的功能 |
| 2.1 VP22的细胞核定位及其蛋白转导功能 |
| 2.2 VP22与MDV的复制与传播 |
| 2.3 VP22与疫苗的免疫原性 |
| 2.4 VP22与免疫逃避 |
| 3 展望 |
（2）马立克病毒通过DNA损伤应答通路调控病毒复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(Abbreviations) |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 马立克病毒的研究进展 |
| 1 马立克病毒的基本特征 |
| 1.1 马立克病毒的形态特征 |
| 1.2 马立克病毒基因组结构 |
| 1.3 马立克病毒与α-疱疹病毒同源的基因 |
| 1.4 马立克病毒特有基因 |
| 2. 马立克病毒的发病机理与宿主的免疫应答 |
| 2.1 早期溶细胞感染 |
| 2.2 潜伏感染 |
| 2.3 再次溶细胞感染 |
| 2.4 转化期 |
| 2.5 宿主的免疫应答 |
| 3. 病毒的流行病学研究进展 |
| 4. 马立克病的诊断 |
| 4.1 临床诊断 |
| 4.2 病毒抗原诊断 |
| 4.3 聚合酶链式反应诊断 |
| 5. 马立克病的防控 |
| 第二章 DNA损伤应答通路与病毒相互作用的研究进展 |
| 1. DNA损伤应答通路的基本特征 |
| 1.1 DNA损伤类型 |
| 1.2 DNA损伤应答通路 |
| 1.3 DNA损伤修复 |
| 2. DNA损伤应答通路与病毒的相互作用 |
| 2.1 病毒激活DNA损伤应答通路 |
| 2.2 病毒抑制DNA损伤应答通路 |
| 3. STAT3信号通路 |
| 3.1 STAT3信号通路的特征 |
| 3.2 STAT3信号通路与肿瘤发生 |
| 3.3 STAT3信号通路与病毒感染 |
| 4. 研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究部分 |
| 第三章 MDV感染引起细胞DNA损伤 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 质粒载体 |
| 1.3 病毒 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 溶液的配制 |
| 1.7 MDV病毒滴度的测定 |
| 1.8 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.9 彗星试验方法的建立 |
| 1.10 检测鸡p53和p21多克隆抗体的特异性 |
| 1.11 检测细胞内p53和p21水平 |
| 2. 结果 |
| 2.1 彗星试验检测细胞DNA损伤方法的建立 |
| 2.2 MDV感染引起CEF细胞DNA损伤 |
| 2.3 MDV感染引起细胞中p53和p21水平的变化 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 DNA损伤应答通路对MDV复制的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 质粒载体 |
| 1.3 病毒 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 溶液的配制 |
| 1.7 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.8 pcDNA3-2×Flag-Chk1和pcDNA3-Chk1真核表达载体的构建 |
| 1.9 检测DDR通路抑制剂对MDV感染的影响 |
| 1.10 检测ATR-Chk1信号通路对MDV复制的影响 |
| 1.11 检测MDV感染对细胞内Chk1磷酸化的影响 |
| 2. 结果 |
| 2.1 DDR通路调控MDV感染 |
| 2.2 ATR-Chk1通路对病毒感染的影响 |
| 2.3 MDV感染调控Chk1的磷酸化 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 MDV激活STAT3调控ATR-Chk1通路 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 溶液的配制 |
| 1.6 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.7 检测MDV感染细胞中STAT3磷酸化水平变化 |
| 1.8 检测STAT3通路在MDV感染抑制Chk1磷酸化中的作用 |
| 1.9 检测抑制STAT3通路对MDV复制的影响 |
| 2. 结果 |
| 2.1 MDV感染激活细胞内STAT3通路 |
| 2.2 MDV感染通过激活STAT3通路调控Chk1的磷酸化 |
| 2.3 抑制STAT3通路对MDV复制的影响 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 细胞氧化应激反应调控MDV复制 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 溶液的配制 |
| 1.6 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.7 细胞内ROS的检测 |
| 1.8 检测APO抑制剂对Md5复制的影响 |
| 1.9 检测DPI抑制剂对Md5复制的影响 |
| 2. 结果 |
| 2.1 MDV感染引起CEF细胞内产生ROS |
| 2.2 细胞内氧化应激反应调控MDV复制 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 丹顶鹤马立克病临床病例的分子生物学诊断 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 溶液的配制 |
| 1.6 临床丹顶鹤病例 |
| 1.7 临床组织切片HE染色 |
| 1.8 组织样本基因组的提取和病毒基因PCR检测 |
| 1.9 组织样本RNA的提取和病毒基因RT-PCR检测 |
| 2. 结果 |
| 2.1 丹顶鹤的临床剖检和组织学染色 |
| 2.2 丹顶鹤组织样本中MDV病毒基因的的检测 |
| 2.3 丹顶鹤组织样本中MDV病毒基因序列分析 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本论文创新点 |
| 科研成果 |
| 致谢 |
（3）鸡传染性贫血病毒感染对鸡马立克病疫苗免疫效力的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 马立克病的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 发病的机理与病理变化 |
| 1.1.3.1 早期增殖性阶段 |
| 1.1.3.2 病毒的潜伏感染阶段 |
| 1.1.3.3 第二次溶细胞感染期 |
| 1.1.3.4 转化和肿瘤形成 |
| 1.1.3.5 临床症状和病理变化 |
| 1.2 马立克病病毒分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 与致肿瘤相关的马立克病病毒特有基因 |
| 1.2.2 马立克病病毒的基因及相关蛋白 |
| 1.2.2.1 即时早期基因 |
| 1.2.2.2 早期基因 |
| 1.2.2.3 晚期基因 |
| 1.3 诊断技术 |
| 1.3.1 常规诊断 |
| 1.3.2 病毒分离 |
| 1.3.3 聚合酶链式反应技术 |
| 1.4 马立克病的防制措施 |
| 1.4.1 免疫机理 |
| 1.4.2 疫苗研究进展 |
| 1.4.3 新型疫苗 |
| 1.5 鸡传染性贫血病毒的发病机理和流行病学 |
| 1.5.1 发病机理 |
| 1.5.2 流行病学 |
| 1.6 影响马立克病疫苗免疫效力的因素 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞和试验动物 |
| 2.1.2 疫苗与病毒 |
| 2.1.3 主要试剂和仪器 |
| 2.1.4 其他试剂的配制方法 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 2.2.2 马立克病毒的增殖与定量 |
| 2.2.3 鸡传染性贫血病毒的定量 |
| 2.2.3.1 DNA试剂盒提取 |
| 2.2.3.2 斑点分子杂交 |
| 2.2.4 试验分组 |
| 2.2.5 SPF鸡的死亡率及肿瘤发生率的影响 |
| 2.2.5.1 病理学检测 |
| 2.2.6 体重和免疫器官指数的测定 |
| 2.2.7 NDV和AIV灭活疫苗的免疫和抗体水平的测定 |
| 2.2.7.1 红细胞凝集试验与血凝抑制试验 |
| 2.2.7.2 红细胞凝集试验步骤 |
| 2.2.7.3 血凝抑制试验步骤 |
| 2.2.8 GX0101的增殖动态 |
| 2.2.8.1 外周血淋巴细胞DNA的提取 |
| 2.2.8.2 荧光定量PCR扩增 |
| 2.2.9 不同细胞因子转录水平的影响 |
| 2.2.9.1 外周血淋巴细胞RNA提取 |
| 2.2.9.2 cDNA的合成 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒毒力的测定 |
| 3.1.1 GX0101毒株定量与检测 |
| 3.1.2 SD15毒株的定量 |
| 3.2 死亡率及肿瘤发生率 |
| 3.3 感染CIAV对SPF鸡生长性能的影响 |
| 3.4 对NDV疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 3.5 对AIV-H9疫苗免疫后抗体反应的抑制作用 |
| 3.6 感染CIAV对SPF鸡中枢免疫器官的影响 |
| 3.7 GX0101在鸡体内的增殖结果 |
| 3.7.1 荧光定量PCR批内重复性 |
| 3.7.2 GX0101增殖动态 |
| 3.8 细胞因子的转录水平 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 攻读学位期间发表论文情况 |
（4）敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CV1988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 马立克式病毒（MDV）的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 发病机理及病理变化 |
| 1.1.3.1 早期增殖性-限制性感染 |
| 1.1.3.2 病毒的潜伏感染阶段 |
| 1.1.3.3 溶细胞感染的第二阶段 |
| 1.1.3.4 淋巴瘤的形成 |
| 1.1.4 MDV的诊断技术 |
| 1.1.4.1 观察临床资料和机体病变 |
| 1.1.4.2 肿瘤组织学、细胞学以及组织化学诊断 |
| 1.1.4.3 病毒学检测 |
| 1.2 马立克式病毒（MDV）分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 MDV 的基因组结构 |
| 1.2.2 MDV 的基因及相关蛋白 |
| 1.2.2.1 即时早期基因（IE 基因） |
| 1.2.2.2 早期基因 |
| 1.2.2.3 晚期基因 |
| 1.2.2.4 Meq 基因 |
| 1.2.2.5 v-IL8 |
| 1.2.2.6 1.8kb 基因家族 |
| 1.2.2.7 pp38/pp24 |
| 1.3 禽反转录病毒与 MDV 之间基因重组的研究进展 |
| 1.3.1 MDV 与 REV 之间的基因重组 |
| 1.3.2 MDV 与 ALV 之间的基因重组 |
| 1.4 重组 MDV 研究中克隆载体系统介绍 |
| 1.4.1 质粒(plasmid) |
| 1.4.2 粘粒 |
| 1.4.3 细菌人工染色体技术(bacterial artificial chromsomeo ,BAC) |
| 1.5 重组 MDV 病毒 SC9-1 的构建 |
| 1.6 MDV 疫苗的研究进展 |
| 1.6.1 疫苗免疫机制 |
| 1.6.2 疫苗的种类 |
| 1.6.2.1 常规使用的疫苗 |
| 1.6.2.2 新型 MDV 疫苗 |
| 1.7 本研究的意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物与 SPF 饲养设施 |
| 2.1.2 疫苗 |
| 2.1.3 病毒 |
| 2.1.4 主要试剂和仪器 |
| 2.1.5 其他试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备 |
| 2.2.2 MDV 病毒的增殖与定量 |
| 2.2.3 AIV 与 NDV 病毒的鸡胚扩增 |
| 2.2.4 重组毒株 SC9-1 的人工接种 |
| 2.2.5 NDV 和 AIV 疫苗免疫鸡 |
| 2.2.6 红细胞凝集试验与血凝抑制试验 |
| 2.2.6.1 红细胞凝集试验步骤 |
| 2.2.6.2 血凝抑制试验步骤 |
| 2.2.7 接种 GX0101 后鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
| 2.2.8 病理学检测 |
| 2.2.9 淋巴细胞 DNA 与羽毛囊上皮细胞 DNA 的提取 |
| 2.2.10 检测 SPF 鸡免疫 SC9-1 后 GX0101 接种病毒的增殖动态 |
| 2.2.11 检测 MDV GX0101 的荧光定量 PCR 方法的建立 |
| 2.2.11.1 荧光定量 PCR 检测 GX0101 的可行性 |
| 2.2.11.2 荧光定量 PCR 引物的设计 |
| 2.2.11.3 荧光定量 PCR 反应体系及反应条件 |
| 2.2.12 检测 MDV GX0101 的荧光定量 PCR 标准曲线的制备 |
| 2.2.12.1 PCR 扩增 Meq、LTR |
| 2.2.12.2 质粒 pMD-meq、pMD-LTR 的构建 |
| 2.2.12.3 Meq 和 LTR 基因的荧光定量标准曲线绘制 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 重组 MD 病毒 SC9-1 与毒株 GX0101 的细胞定量结果 |
| 2.3.2 各组 SPF 鸡免疫后攻毒 GX0101 的死亡率及肿瘤发生率 |
| 2.3.3 各组海兰褐鸡免疫后攻毒 GX0101 的死亡率及肿瘤发生率 |
| 2.3.4 GX0101 在免疫鸡体内的增殖动态 |
| 2.3.4.1 检测 MDV GX0101 的荧光定量 PCR 标准曲线 |
| 2.3.4.2 SC9-1、CVI988/Rispens 免疫 SPF 鸡后 GX0101 的增殖动态 |
| 2.3.4.3 SC9-1、CVI988/Rispens 免疫海兰褐鸡后 GX0101 的增殖动态 |
| 2.3.5 SPF 鸡免疫 SC9-1、CVI988/Rispens 后灭活油苗诱导抗体水平比较 |
| 2.3.6 海兰褐鸡免疫 SC9-1、CVI988/Rispens 后灭活油苗诱导抗体水平比较 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 已发表的论文 |
（5）重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究（论文提纲范文）
| 符号说明及缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 马立克氏病病毒（MDV）的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 病理生物学 |
| 1.1.4 诊断技术 |
| 1.2 MDV 分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 MDV 基因组结构 |
| 1.2.2 MDV 结构蛋白及相关基因 |
| 1.3 禽反转录病毒与 MDV 基因重组的研究进展 |
| 1.3.1 MDV 与 REV 间的基因重组 |
| 1.3.2 MDV 与 ALV 间的基因重组 |
| 1.3.3 REV 与 MDV 基因重组的机制 |
| 1.3.4 带有 REV-LTR 的重组 MDV 野毒株 GX0101 流行病学意义 |
| 1.4 BAC 技术和同源重组技术在 MDV 研究中的应用 |
| 1.4.1 细菌人工染色体载体系统(BAC) |
| 1.4.2 利用 BAC 构建 MDV 感染性克隆 |
| 1.4.3 基于 MDV BAC 感染性克隆的同源重组技术 |
| 1.5 基因芯片技术在 MDV 研究中的应用 |
| 1.5.1 基因芯片的简介 |
| 1.5.2 基因芯片的应用 |
| 1.6 MD 疫苗研究进展 |
| 1.6.1 常规致弱疫苗 |
| 1.6.2 新型基因工程疫苗 |
| 1.7 本研究的目的及意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 常规分子克隆试剂 |
| 2.1.2 细胞培养相关试剂 |
| 2.1.3 荧光定量相关试剂 |
| 2.1.4 多克隆抗体制备相关试剂 |
| 2.1.5 Agilent 表达谱芯片相关试剂 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 相关疫苗及抗原 |
| 2.1.8 相关病毒及菌种 |
| 2.1.9 病毒增殖与鉴定相关试验材料 |
| 2.2 常规试验操作方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备 |
| 2.2.2 MDV 的拯救、鉴定 |
| 2.2.3 MDV 的增殖、定量 |
| 2.2.4 MDVBAC 质粒的大量制备及电转化 |
| 2.2.5 重组蛋白的纯化以及SDS-PAGE 蛋白质电泳 |
| 2.2.6 淋巴细胞的分离以及DNA 的提取 |
| 2.2.7 病毒RNA 的提取以及反转录 |
| 2.3 自然重组马立克氏病毒 GX0101 的全基因组序列的测定和比较分析 |
| 2.3.1 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 质粒的制备 |
| 2.3.2 GX0101 感染性克隆GX0101-BAC 的测序 |
| 2.3.3 GX0101 的全基因组分析 |
| 2.4 以 GX0101 构建 meq 基因缺失疫苗候选株及其安全性免疫保护效果的比较研究 |
| 2.4.1 利用同源重组技术构建 SC9-1(GX0101Δmeq kana)株 MDV |
| 2.4.2 利用同源重组技术构建SC9-2(GX0101 meq kana BAC)株MDV |
| 2.4.3 SC9-1、SC9-2 株MDV 的拯救、鉴定 |
| 2.4.4 SC9-1、SC9-2 株MDV 在细胞上的复制水平 |
| 2.4.5 SC9-1、SC9-2 株MDV 对SPF 鸡的安全性 |
| 2.4.6 SC9-1 株MDV 在鸡体内的增殖水平 |
| 2.4.7 SC9-1、SC9-2 株MDV 对SPF 鸡的免疫保护效果 |
| 2.4.8 SC9-1 株MDV 对海兰褐蛋鸡的免疫保护效果 |
| 2.4.9 SC9-1 株MDV 对SPF 鸡感染低剂量rMd5 的免疫保护效果 |
| 2.5 GX0101 在自然感染传播过程中竞争性选择压优势的模拟分析 |
| 2.5.1 用于区分MDVGX0101 和GX0101 LTR 的荧光定量PCR 探针设计 |
| 2.5.2 双重荧光定量PCR 探针标准曲线的制备 |
| 2.5.3 接种相同剂量GX0101 和GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 2.5.4 接种不同剂量GX0101 和GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 2.6 缺失 GX0101 SORF2 基因的重组病毒的构建及其生物学活性比较 |
| 2.6.1 鼠抗MDVSORF2 蛋白多克隆抗体制备 |
| 2.6.2 敲除SORF2 基因的重组病毒GX0101Δsorf2 的构建 |
| 2.6.3 间接免疫荧光试验鉴定重组病毒GX0101Δsorf238 |
| 2.6.4 Western blot 对重组病毒GX0101Δsorf2 以及SORF2 蛋白特异性鉴定 |
| 2.6.5 GX0101Δsorf2 在CEF 细胞上的复制能力的检测 |
| 2.6.6 GX0101Δsorf2 的致病性试验 |
| 2.6.7 GX0101Δsorf2 在鸡体内的的病毒血症的检测 |
| 2.6.8 GX0101Δsorf2 对SPF 鸡体液免疫应答的影响 |
| 2.6.9 GX0101Δsorf2 和GX0101 横向传播能力比较 |
| 2.7 插入 ALV-LTR 的重组 MDV 的构建及其生物学活性的比较研究 |
| 2.7.1 插入ALV-LTR 片段的重组MDV 的构建 |
| 2.7.2 重组MDVGX0101-ALV-LTR 的拯救 |
| 2.7.3 GX0101-ALV-LTR 在细胞上的复制能力 |
| 2.7.4 间接免疫荧光鉴定GX0101-ALV-LTR SORF2 蛋白的表达 |
| 2.7.5 GX0101-ALV-LTR 在CEF 细胞培养的稳定性鉴定 |
| 2.7.6 GX0101-ALV-LTR 的致病性检测及鸡体内的稳定性鉴定 |
| 2.8 LTR 插入片段对重组病毒的病毒基因表达以及重组病毒对宿主基因表达的影响 |
| 2.8.1 不同CEF 细胞感染不同重组病毒的总RNA 提取 |
| 2.8.2 样品的RNA 的放大和荧光标记 |
| 2.8.3 Agilent 表达谱芯片杂交 |
| 2.8.4 Agilent 表达谱芯片扫描 |
| 2.8.5 Agilent 表达谱芯片结果的质控检测 |
| 2.8.6 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 的病毒基因差异表达的分析 |
| 2.8.7 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 对宿主基因表达的差异性分析 |
| 2.8.8 GX0101 重组REV-LTR 片段对其重组位点后的基因转录水平的影响 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 GX0101 的全基因组序列的测定和比较分析 |
| 3.1.1 GX0101 的基因组结构以及与其它不同株 MDV 的系统进化关系 |
| 3.1.2 从 GX0101 全基因组水平比较分析 REV-LTR 插入片段 |
| 3.1.3 相对其它毒株 GX0101 基因组中缺失的片段 |
| 3.1.4 相对其它毒株 GX0101 基因组中增加的片段 |
| 3.1.5 GX0101 基因组的开放阅读框和单核苷酸多态性 |
| 3.1.6 GX0101 与英国分离株 C12/130 感染性克隆的基因组差异比较 |
| 3.2 以 GX0101 构建 meq 基因缺失疫苗候选株及其安全性免疫保护效果的比较 |
| 3.2.1 SC9-1、SC9-2 疫苗候选株的构建和鉴定 |
| 3.2.2 SC9-1、SC9-2 株 MDV 拯救鉴定结果 |
| 3.2.3 SC9-1、SC9-2 株 MDV 在细胞上的复制能力 |
| 3.2.4 SC9-1 株 MDV 在鸡体内的增殖水平 |
| 3.2.5 SC9-1、SC9-2 株 MDV 对 SPF 鸡的安全性 |
| 3.2.6 SC9-1、SC9-2 株 MDV 对 SPF 鸡的免疫保护效果 |
| 3.2.7 SC9-1 株 MDV 对海兰褐蛋鸡的免疫保护效果 |
| 3.2.8 SC9-1 株 MDV 对 SPF 鸡感染低剂量 rMd5 的免疫保护效果 |
| 3.2.9 SC9-1 疫苗候选株中试产品与 CVI988/Rispens 疫苗的保护性免疫力 |
| 3.3 GX0101 在自然感染传播过程中竞争性选择压优势的模拟分析 |
| 3.3.1 区分 MDV GX0101 和 GX0101 LTR 的荧光定量 PCR 探针具有良好的特异性 |
| 3.3.2 双重荧光定量 PCR 探针标准曲线的制备 |
| 3.3.3 接种相同剂量 GX0101 和 GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 3.3.4 接种不同剂量 GX0101 和 GX0101 LTR 后两种病毒在鸡的接触传播性比较 |
| 3.4 缺失 GX0101 SORF2 基因的重组病毒的构建及其生物学活性的研究 |
| 3.4.1 SORF2 融合目的蛋白的表达纯化及分析鉴定 |
| 3.4.2 间接免疫荧光(IFA)鉴定高效价多克隆抗体特异性 |
| 3.4.3 GX0101Δsorf2 的 PCR 鉴定结果 |
| 3.4.4 间接免疫荧光鉴定 GX0101Δsorf2 的结果 |
| 3.4.5 Western blot 对重组病毒 GX0101 sorf2 以及 SORF2 蛋白的特异性鉴定 |
| 3.4.6 GX0101Δsorf2 在 CEF 细胞上的复制能力 |
| 3.4.7 GX0101Δsorf2 与亲本病毒 bac-GX0101 在鸡体内的病毒血症比较 |
| 3.4.8 GX0101Δsorf2 对 SPF 鸡的致病性 |
| 3.4.9 GX0101Δsorf2 对鸡体体液免疫应答的影响 |
| 3.4.10 GX0101Δsorf2 对鸡体重的影响 |
| 3.4.11 GX0101Δsorf2 和 GX0101 横向传播能力的比较 |
| 3.5 插入 ALV-LTR 的重组 MDV 的构建及其生物学活性的比较 |
| 3.5.1 不同重组 BAC 克隆质粒的 PCR 鉴定 |
| 3.5.2 拯救的重组病毒 GX0101-ALV-LTR 在细胞培养上形成的病毒蚀斑 |
| 3.5.3 插入 ALV-LTR 片段对重组 MDV SORF2 基因的转录和表达影响 |
| 3.5.4 GX0101-ALV-LTR 在细胞上复制性能 |
| 3.5.5 GX0101-ALV-LTR 基因组中 ALV-LTR 片段稳定性的鉴定 |
| 3.5.6 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡体重的影响 |
| 3.5.7 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡抗体水平的影响 |
| 3.5.8 GX0101-ALV-LTR 对 SPF 鸡的致死率和致肿瘤率 |
| 3.6 LTR 插入片段对重组病毒的病毒基因表达以及重组病毒对宿主基因表达的影响 |
| 3.6.1 样品总 RNA 的提取和质检结果 |
| 3.6.2 Agilent 表达谱芯片结果的质控检测结果 |
| 3.6.3 Agilent 表达谱芯片扫描数据归一化结果 |
| 3.6.4 重组病毒GX0101、GX0101-ALV-LTR 与GX0101 LTR 的病毒基因差异表达的分析结果 |
| 3.6.5 感染 GX0101、GX0101-ALV-LTR、GX0101 LTR 鸡的显着差异表达基因的分析结果 |
| 3.6.6 Northern blot 技术对重组病毒 SORF2、US1、US10 基因的鉴定结果 |
| 3.6.7 荧光定量 PCR 检测重组病毒 SORF2、US1、US10 基因表达结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
（6）马立克病毒新ORF的鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 目录 |
| 第一章 文献综述及选题目的和意义 |
| 1 马立克病研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 病毒形态 |
| 1.1.2 血清型分型 |
| 1.1.3 MDV理化性质 |
| 1.2 马立克病毒基因组的研究进展 |
| 1.2.1 全基因测序情况 |
| 1.2.2 已经鉴定的主要基因及其编码蛋白的基本功能 |
| 1.2.3 MDV-1强弱毒株之间的主要差异性基因 |
| 1.3 流行病学和致病机理 |
| 1.3.1 流行病学 |
| 1.3.2 致病机理 |
| 1.4 临床症状、病理变化及疾病的诊断与防控 |
| 1.4.1 临床症状 |
| 1.4.2 病理变化 |
| 1.4.3 疾病的诊断与防控 |
| 2 选题的目的及意义 |
| 第二章 试验部分 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 鸡胚和实验动物 |
| 1.2 病毒、宿主菌及菌体 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 新ORF初步筛选及引物设计 |
| 2.2 CVI988/Rispens复苏及病毒PFU的测定 |
| 2.2.1 CEF的制备 |
| 2.2.2 复苏CVI988/Rispens |
| 2.2.3 PFU的测定 |
| 2.3 新ORF基因的初步鉴定 |
| 2.3.1 总RNA的提取 |
| 2.3.2 总RNA反转录为cNDA |
| 2.3.3 PCR反应 |
| 2.4 新ORF的克隆测序 |
| 2.4.1 胶回收 |
| 2.4.2 克隆载体的构建及测序 |
| 2.5 新ORF的原核表达 |
| 2.5.1 表达载体的构建 |
| 2.5.2 表达重组菌的构建及表达条件的筛选 |
| 2.5.3 大量表达及纯化 |
| 2.6 兔抗重组目的蛋白和鸡抗CVI988/Rispens高免血清的制备 |
| 2.6.1 兔抗重组目的蛋白高免血清的制备 |
| 2.6.2 鸡抗CVI988/Rispens高免血清蛋白的制备 |
| 2.7 间接免疫荧光 |
| 2.8 Western-blot检测新ORF在鸡体中的免疫原性 |
| 2.9 RT-PCR方法检测ORF5.6/75.9和ORF97.3在鸡体的转录情况 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CVI988/Rispens复苏结果及PFU测定 |
| 3.2 RNA质量检测及RT-PCR结果 |
| 3.3 新ORF基因克隆测序和表达载体构建结果 |
| 3.4 表达重组菌诱导条件筛选及目的蛋白的纯化结果 |
| 3.5 间接免疫荧光 |
| 3.6 Western-blot结果 |
| 3.7 ORF5.6/ORF75.9和ORF97.3基因在鸡体中的转录情况检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 新ORF的初步筛选 |
| 4.2 RT-PCR、间接免疫荧光和Western-blot方法 |
| 4.3 三个新ORF的鉴定情况 |
| 4.4 MDV-1具有免疫原性的蛋白 |
| 4.5 MDV-1重复长区 |
| 4.6 新ORF生物信息学 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介及攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（7）表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组马立克病毒疫苗株的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 传染性喉气管炎病毒概况综述 |
| 1. ILTV的流行病学 |
| 2. ILTV的基因组结构 |
| 3. ILTV基因工程疫苗的研究进展 |
| 3.1 基因工程缺失疫苗 |
| 3.2 病毒活载体疫苗 |
| 3.3 DNA疫苗 |
| 第二章 表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组马立克病毒疫苗株的构建 |
| 1. 材料 |
| 1.1 细胞、菌株和质粒 |
| 1.2 病毒和鸡胚 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2. 方法 |
| 2.1 ILTV安徽合肥分离株gB基因的克隆鉴定几序列分析 |
| 2.2 转移载体质粒pMDV-gB-GFP的构建 |
| 2.3 转移载体质粒pMDV-gB-GFP的鉴定 |
| 2.4 重组病毒rMDV-gB的构建及纯化 |
| 2.5. 重组病毒的增殖与效价测定 |
| 2.6 重组病毒rMDV-gB的免疫保护试验 |
| 2.7 试验数据的统计学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 ILTV gB基因的克隆鉴定 |
| 3.2 gB基因的测序结果 |
| 3.3 转移载体质粒pMDV-gB-GFP的构建 |
| 3.4 转移载体质粒pMDV-gB-GFP的鉴定 |
| 3.5 CVI988/Rispens DNA和转移载体质粒共转染CEF细胞 |
| 3.6 重组病毒rMDV-gB病毒的鉴定 |
| 3.8 rMDV-gB病毒对ILTV强毒株的免疫保护效力 |
| 3.9 rMDV-gB病毒对MDV的免疫保护效力 |
| 4. 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究及以马立克病毒为载体的基因工程疫苗研制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 文献综述 禽传染性支气管炎研究进展 |
| 参考文献 |
| 第一章 2009～2011年间国内部分地区IBV分子流行病学研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Mass型H120活疫苗对不同基因型IBV流行毒株的免疫保护效力试验 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 表达QX型IBV S1蛋白的重组马立克病毒构建与免疫效力试验 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（9）MDV-1 CVI988疫苗株VP22及UL13蛋白功能初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一、疱疹病毒VP22 和UL13 蛋白研究进展 |
| 一、概述 |
| 二、VP22 的生物学特性 |
| 三、UL13 的研究进展 |
| 四、展望 |
| 综述二、细胞穿透肽（CELL-PENETRATING PEPTIDES,CPPS）及VP22 蛋白转导功能的研究进展 |
| 一、细胞穿透肽（CPPS） |
| 二、CPPS 的应用 |
| 三、VP22 蛋白转导功能 |
| 四、VP22 的应用 |
| 五、展望 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章、MDV-1 CV1988/RISPENS 株VP22 蛋白转运异源蛋白的研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二章、MDV-1 VP22 增强机体针对目的抗原免疫应答水平的评价 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章、VP22 转导机制的研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第四章、MDV-1 UL13 序列对比分析及对VP22 可能的磷酸化位点预测 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第五章、MDV UL13 的原核和真核表达以及多抗血清的制备 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在读博士期间（2006-2009）发表论文目录 |
（10）MDV VP22的N1-18是发挥蛋白转导功能必需的序列（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞、病毒和细菌: |
| 1.1.2 载体及主要试剂: |
| 1.2 VP22真核表达载体的构建 |
| 1.3 不同片段VP22的选择和不同片段VP22 N端融合EGFP载体的构建 |
| 1.4 不同固定液和不同水化时间对VP22的影响 |
| 1.5 双检测系统的建立 |
| 1.5.1 罗丹明染色和EGFP双检测: |
| 1.5.2 EGFP和RFP双重指示作用: |
| 2 结果 |
| 2.1 不同片段VP22的PCR扩增效果 |
| 2.2 VP22在COS-1细胞中的暂态表达和不同固定剂对VP22的影响 |
| 2.3 不同VP22片段与EGFP融合表达情况 |
| 2.3 甲醇固定转染的COS-1及水化结果 |
| 2.4 抗体染色检测VP22的蛋白转导功能 |
| 3 讨论 |
| 3.1 VP22在细胞内的定位与蛋白转导功能的关系 |
| 3.2 VP22蛋白转导功能的特点 |
| 3.3 甲醇造成的转导“假象”与VP22本身性质有直接关系 |
| 3.4 MVP22的PTD不能单独发挥转导作用 |
| 3.5 MVP22的功能区分布 |
四、MDV CVI988/Rispens弱毒株VP22基因克隆和序列分析（论文参考文献）
- [1]马立克病病毒被膜蛋白VP22的研究进展[J]. 唐清秀,王宜平,叶正钦,李丕顺,纪春晓. 中国兽医科学, 2021(02)
- [2]马立克病毒通过DNA损伤应答通路调控病毒复制的研究[D]. 连雪. 南京农业大学, 2018
- [3]鸡传染性贫血病毒感染对鸡马立克病疫苗免疫效力的影响[D]. 张言坤. 山东农业大学, 2018(08)
- [4]敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CV1988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较研究[D]. 段伦涛. 山东农业大学, 2014(12)
- [5]重组马立克氏病毒及其突变株生物学活性的比较研究[D]. 苏帅. 山东农业大学, 2013(05)
- [6]马立克病毒新ORF的鉴定[D]. 赵扬. 四川农业大学, 2013(03)
- [7]表达鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的重组马立克病毒疫苗株的构建[D]. 黄海琼. 扬州大学, 2013(04)
- [8]2009-2011年国内传染性支气管炎病毒分子流行病学研究及以马立克病毒为载体的基因工程疫苗研制[D]. 张小荣. 扬州大学, 2012(07)
- [9]MDV-1 CVI988疫苗株VP22及UL13蛋白功能初步研究[D]. 张晨飞. 扬州大学, 2009(12)
- [10]MDV VP22的N1-18是发挥蛋白转导功能必需的序列[J]. 陈鸿军,秦爱建,宋翠萍,张晨飞,邓绪芳. 微生物学报, 2008(01)