一、白介素6与化疗药物对人肺癌细胞生长影响的研究（论文文献综述）
宋晓萍[1]（2021）在《七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究》文中认为本实验室前期从七鳃鳗组织中分离纯化一种选择性识别并杀伤肿瘤细胞的免疫蛋白LIP（Lamprey Immune Protein）,其具有凝集素结构域（Jacalin＿like）和气单胞菌溶素结构域（Aerolysin correlation）,LIP蛋白通过识别乳腺癌细胞（MCF-7）膜表面Neu5Gc唾液酸修饰的糖型结构靶向肿瘤细胞,在细胞膜表面沉积进而杀伤肿瘤细胞。由于正常细胞表面没有Neu5Gc修饰的糖型结构,因此LIP蛋白对正常组织细胞（MCF-10A）没有较强或者很少的识别、结合和杀伤效果。肺癌是我国以及国际范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,晚期肺癌主要依靠药物治疗,在治疗过程中对正常细胞也产生杀伤作用等一系列药物副作用。由于药物副作用的存在使得肺癌治疗药物的选择成为临床医生的关注点之一,所以探究LIP对小细胞肺癌和非小细胞肺癌的识别和杀伤作用并揭示其作用机制至关重要。首先,使用LIP蛋白筛查23株不同组织来源的肿瘤细胞系,LIP对各组织来源的肿瘤细胞系有不同的识别能力和杀伤作用,说明LIP对肿瘤细胞杀伤具有特异性选择和一定的广谱性,而对正常组织细胞无结合和杀伤作用。通过高内涵成像分析系统和乳酸脱氢酶（LDH）方法检测LIP对人小细胞肺癌NCI-H446、人肺鳞癌细胞NCI-H520、人肺腺癌A549和正常肺上皮细胞L132的杀伤情况,细胞死亡率结果表明随着LIP浓度的增加,NCI-H446、NCI-H520、A549细胞的活力降低。A549细胞死亡率最低,为26.7%;NCI-H520细胞的死亡率最高,为61.3%。和临床常用的化疗药物顺铂,紫杉醇,5-Fu尿嘧啶比较,低剂量的LIP蛋白也可以达到高剂量化疗药物的杀伤效率,使细胞微团塌陷,破碎,不再聚集成团。同时发现LIP蛋白除单独应用对肿瘤细胞有作用外,与顺铂联合用药处理肿瘤细胞更能增加其对肺癌细胞的杀伤效果,随着浓度的增加,杀伤效率增加。细胞迁移实验结果显示,LIP显着抑制三种肺癌细胞的迁移,相反,它并没有抑制L132细胞的迁移。通过荧光探针、免疫荧光结合共聚焦显微镜对线粒体,内质网及细胞骨架进行观察,结果显示LIP促使肺癌细胞线粒体变短并皱缩成球形,线粒体数量明显减少,荧光消失;LIP引起内质网肿胀和损伤,导致空泡化,严重破坏细胞稳态,使细胞内容物外泄导致凋亡;LIP造成肺癌细胞骨架系统瓦解,微管解聚。采用Annexin V-FITC方法检测LIP对肺癌细胞凋亡的影响,结果显示LIP促使三种肺癌细胞磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）外翻。流式细胞术实验结果显示,2μM和4μM LIP处理L132细胞24 h后,细胞处于相对稳定状态。相同剂量LIP处理NCI-H446、NCI-H520、A549细胞24 h后,细胞凋亡率明显增高。同时,LIP破坏线粒体,降低线粒体膜电位。从共聚焦显微镜图像可以看出,LIP处理的三种肺癌细胞的活性氧（ROS）水平高于未处理的对照组,说明LIP介导肿瘤细胞的破坏与活性氧有关。为了探究LIP诱导肺癌细胞凋亡的机制,LIP处理NCI-H446、NCI-H520和A549细胞后,通过免疫印迹检测PARP1、GRP94、Bip、Caspase-12、Caspase-3、CHOP和p21的表达均显着上调且呈时间和剂量依赖性,明确内质网诱导的凋亡依赖于IRE-1、ATF-6和PERK通路,导致下游CHOP表达上调。在内质网应激抑制剂4-PBA作用48h后,PARP1、GRP94、Bip、Caspase-12、Caspase-3、CHOP和p21的表达水平显着降低。总之,七鳃鳗免疫蛋白LIP通过内质网应激信号通路介导肺癌细胞凋亡。本文建立肺癌小鼠荷瘤模型并在细胞瘤处直接注射LIP蛋白,能显着延缓肿瘤生长速度,肿瘤组织明显缩小,但是对小鼠正常组织细胞没有明显的副作用。通过免疫组化实验检测发现,LIP可以选择性识别人肺癌组织样本,而对癌旁组织无识别效果。
刘亚琪[2]（2021）在《糖代谢基因在肺腺癌组织中的表达及沙参麦冬汤干预的实验研究》文中认为目的探讨糖代谢基因GLUT1、HK2和LDHA m RNA在肺腺癌组织及对应的癌旁组织中表达的差异及与临床病理特征的相关性。在此基础上,探讨沙参麦冬汤含药血清对人肺腺癌A549和SPCA1细胞的抗癌作用及对人肺腺癌细胞糖代谢的影响,并探索其机制。为临床应用沙参麦冬汤治疗肺腺癌提供科学依据。方法1、选取手术切除的新鲜肺腺癌组织病例标本,每例分别取癌组织和对应的癌旁组织各一份,分为癌组织组和癌旁组织组,采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-q PCR）检测癌组织和对应的癌旁组织中葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）、己糖激酶2（HK2）和乳酸脱氢酶A（LDHA）m RNA的表达。并分析其与肺腺癌患者临床病理特征的相关性。2、利用GEPIA数据库对肺腺癌患者GLUT1、HK2、LDHA三个基因的表达进行生存分析。评估GLUT1、HK2和LDHA对肺腺癌患者预后的影响。3、制备无菌的沙参麦冬汤含药血清,利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）法测定沙参麦冬汤含药血清对人肺腺癌A549和SPCA1细胞增殖的影响。Annexin V-FITC流式双染法检测沙参麦冬汤含药血清对人肺腺癌A549和SPCA1细胞凋亡的影响。4、通过体外培养人肺腺癌A549和SPCA1细胞,用沙参麦冬汤含药血清干预48h后,利用RT-q PCR和Western blot法检测沙参麦冬汤含药血清对GLUT1、HK2、LDHA、HIF-1α基因的表达量及蛋白水平的影响。5、利用细胞划痕实验及Transwell侵袭实验评估沙参麦冬汤含药血清对人肺腺癌A549和SPCA1细胞迁移和侵袭的影响。6、利用葡萄糖检测试剂盒和乳酸检测试剂盒,检测沙参麦冬汤含药血清对人肺腺癌细胞葡萄糖消耗及乳酸生成的影响。结果1、36例肺腺癌组织中GLUT1的阳性表达率为86.11%（31/36）,在对应的癌旁组织中,阳性表达率为27.78%（10/36）,两者比较差异有统计学意义（?2=24.982,P=0.000）,且36例肺腺癌组织标本中GLUT1 m RNA的表达量明显高于癌旁组织,差异有统计学意义（P<0.01）。2、36例肺腺癌组织中HK2的阳性表达率为75.00%（27/36）,在对应的癌旁组织中,阳性表达率为44.44%（16/36）,两者比较差异有统计学意义（?2=6.986,p=0.005）。36例肺腺癌组织标本中HK2 m RNA的表达量明显高于癌旁组织,差异有统计学意义（P<0.01）。3、36例肺腺癌组织中LDHA的阳性表达率为80.56%（29/36）,在对应的癌旁组织中,阳性表达率为33.33%（12/36）,两者比较差异有统计学意义（?2=14.762,p=0.000）。36例肺腺癌组织标本中LDHA m RNA的表达量明显高于癌旁组织,差异有统计学意义（P<0.01）。4、GLUT1、HK2、LDHA在不同性别、年龄、有无淋巴结转移、不同分期的肺腺癌组织中的表达差别均无统计学意义（P>0.05）。5、利用GEPIA数据库对其收录的478名肺腺癌患者进行生存分析。结果显示,GLUT1、HK2、LDHA高表达的患者比低表达的患者预后更差,差异有统计学意义（p<0.05）。6、CCK-8法和Annexin V-FITC流式双染法检测沙参麦冬汤含药血清对人肺腺癌细胞增殖和凋亡的影响,结果发现,沙参麦冬汤含药血清可以抑制人肺腺癌A549、SPCA1细胞的增殖,促进其凋亡。7、RT-q PCR和Western blot结果显示,沙参麦冬汤含药血清可以下调GLUT1、HK2、LDHA m RNA的水平及蛋白的表达量。进一步研究发现,沙参麦冬汤还可以下调缺氧诱导因子HIF-1α的表达,表明沙参麦冬汤可能是通过调控HIF-1α信号通路来影响肺腺癌糖代谢进程,发挥其抗肿瘤的作用。8、细胞划痕实验及Transwell侵袭实验结果显示,沙参麦冬汤含药血清能明显抑制人肺腺癌A549、SPCA1细胞的迁移和侵袭,与空白组及对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。9、乳酸及葡萄糖检测结果显示,与空白组及对照组相比,沙参麦冬汤组能抑制人肺腺癌细胞葡萄糖消耗及乳酸生成,差异有统计学意义（P<0.05）。结论1、GLUT1、HK2、LDHA在肺腺癌组织中的表达高于相对应的癌旁组织。但与肺腺癌患者性别、年龄、是否有淋巴结转移、肿瘤分期等均无关。2、GLUT1、HK2、LDHA可能参与了肺腺癌的发生及进展,且高表达的GLUT1、HK2、LDHA与患者更差的预后有关。3.沙参麦冬汤有较好的抑制肺腺癌的作用,其抑制肺腺癌的机制可能与调控肿瘤细胞糖代谢有关。
张树玲[3]（2021）在《蛋氨酸脑啡肽（MENK）对肺癌生物学行为的调控及其作用机制的研究》文中指出目的:免疫治疗是近10年来肺癌治疗的一大突破,多种免疫检查点抑制剂目前已获批应用于肺癌,特别是晚期肺癌的临床治疗,为晚期肺部肿瘤患者带来了曙光。其作用机制在于唤醒免疫微环境中被封锁的淋巴细胞,发挥自身抗肿瘤免疫功能。然而尽管其疗效显着,部分患者可能达到“治愈”的效果,但免疫治疗的有效率仅约20-40%。究其原因,主要是各种原因导致的免疫细胞活力下降,机体抗肿瘤免疫力再次被封锁。因此,对于肺癌的治疗,我们需要进一步探索并研发新的有效药物,尤其是那种能够抑制肿瘤细胞生长的同时可增加机体免疫原性及免疫细胞活性,从而激发机体抗肿瘤免疫应答,甚至可能增强免疫检查点抑制剂的疗效及逆转其耐药问题。蛋氨酸脑啡肽（MENK）是一种由酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸五个氨基酸残基构成的内源性阿片样物质,主要来源是肾上腺产生的前激素和前脑啡肽演变而产生。在功能上,MENK作为阿片类物质受体的内源性配体,无药物依赖性和种属特异性,是将中枢神经系统和免疫系统连接起来的重要中介。阿片受体在免疫细胞和肿瘤细胞中均有表达,其中,免疫细胞包括:树突状细胞（dendritic cells,DCs）、巨噬细胞、T淋巴细胞、自然杀伤（natural killer,NK）细胞等具有经典阿片受体的表达,适宜浓度的MENK可与免疫细胞中的阿片受体结合,发挥显着的免疫调节作用,增强抗肿瘤免疫活性;而在许多肿瘤细胞如胰腺癌细胞、肠癌细胞、胃癌细胞等多种肿瘤细胞中存在非经典阿片受体的表达,是MENK发挥直接抗肿瘤作用的主要受体。然而,MENK对于肺癌的影响,目前尚无研究报道。既往有研究发现肺癌细胞如A549、H1975细胞中也存在阿片受体的表达,而且吗啡可通过与此受体抑制肿瘤细胞的生长。所以我们推测,MENK可能对肺癌细胞的生长具有抑制作用,但是其作用机制如何,以及是否能够改变肺癌细胞免疫原性及肿瘤微环境免疫状态,需要体内外实验进一步验证。研究方法:1、体外,用不同浓度的MENK（0、1、2.5、5、7.5、10、12.5 mg/m L）分别作用于人肺癌细胞A549和H1975,以及鼠源性肺癌Lewis 24,48,72,96 h;同时,用上述浓度的MENK作用于人正常支气管上皮细胞Beas-2B 24,48 h,采用CCK-8试剂盒检测MENK的抑制效果。选出6 mg/m L MENK 48h作为适宜的作用剂量和时间进行后续肺癌细胞功能学实验。6 mg/m L MENK作用于肺癌细胞48h后,行以下检测分析:与空白对照组比较,光学显微镜观察肺癌细胞的形态改变;克隆形成实验明确克隆形成能力的改变;流式细胞术和Hoechst 33258检查肺癌凋亡情况改变,流式技术检测肺癌细胞的细胞周期改变;划痕实验和transwell侵袭实验分别检测肺癌细胞转移和侵袭能力的改变;免疫荧光检测钙网蛋白（calreticulin,CRT）膜表达和高迁移率族蛋白-1（high mobility group box 1,HMGB1）核释放的改变。之后,收集空白组和MENK给药组的肺癌细胞,提取mRNA和蛋白,qRT-PCR法检测阿片生长因子受体（opioid receptor,OGFr）以及自然杀伤细胞组2D成员配体（Natural killer group 2,member D ligands,NKG2DLs）MICA、MICB、ULBP1、H60、REA-1的mRNA表达改变,Western blot法检测OGFr蛋白表达改变。流式检测A549细胞表面MICA、MICB、ULBP1的表达。2、信号通路研究,利用OGFr-si RNA有效序列包成慢病毒,构建OGFr稳定沉默的人肺癌细胞株。随后将肺癌细胞分成三组,包括si-NC组、si-NC+MENK组、siOGFr+MENK组,qRT-PCR及Western Blot检测Wnt/β-catenin通路相关因子:cyclin D1、c-myc、β-catenin,凋亡通路相关因子:Bax、Bcl-2、caspase-3,以及上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）进程相关标记物:E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2的mRNA水平和蛋白表达水平的差异。3、体内,构建人肺癌裸鼠皮下移植瘤模型。将A549细胞皮下注射于裸鼠后背部,之后将接种成功的裸鼠随机分成两组:MENK给药组（5 mg、10 mg/次,隔天一次）和阴性对照组（等体积的NS,隔天一次）。每日测量并记录裸鼠生命体征,动态监测裸鼠体重和皮下移植瘤体积变化。用药时间大约满3周后,采用颈椎脱臼法处死裸鼠,取出皮下肿瘤组织并测量大小及称重。制备肿瘤石蜡切片,做以下检测:HE检测组织病理,免疫组化检测组织内OGFr和Ki67表达,TUNEL法检测组织凋亡改变。4、体内,构建小鼠肺癌模型来进一步明确免疫细胞的变化,于C57BL/6小鼠右侧腋下皮下接种Lewis细胞,成瘤后,将小鼠随机分成两组:MENK给药组（10 mg/次,隔天一次）和阴性对照组（等体积的NS,隔天一次）,治疗3周。之后颈椎脱臼处死小鼠,取脾及肿瘤组织,流式检测CD8+T细胞、CD4+T细胞、NK细胞、DCs,以及表达Gz B和IFN-γ阳性的NK细胞得比例。取出皮下肿瘤称重,制备肿瘤石蜡切片,以备做HE检测组织病理,免疫组化检测OGFr、Ki-67、Gz B、IFN-γ、IL-10、IL-15等蛋白的表达,免疫荧光检测免疫原性细胞死亡标记物CRT、HMGB1以及各免疫细胞表面标志CD8、CD4等蛋白的表达。结果:1、体外实验结果显示,与对照组比较,MENK可明显抑制A549、H1975和Lewis细胞的增殖,其作用具有显着的浓度和时间依赖性,而对人正常支气管上皮细胞Beas-2B上无抑制作用。MENK可将肺癌细胞阻滞于细胞周期的G0/G1期;诱导肺癌细胞发生凋亡;降低肺癌细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力。MENK可上调OGFr表达,增加肺癌细胞表面CRT、NKG2DLs的表达和HMGB1的核释放。2、体外,沉默OGFr后,qRT-PCR及Western Blot实验结果提示:MENK可降低Wnt/β-catenin通路中cyclin D1、c-myc、β-catenin的mRNA和蛋白表达水平;MENK可调控Bcl-2/Bax/caspase-3通路相关蛋白和基因的表达,表现为MENK作用后,Bax和cleaved-caspase-3表达水平明显升高,而Bcl-2表达水平明显下降,但caspase-3的表达无明显变化;MENK可引起EMT进程相关标志物的改变,表现为于基因和蛋白水平上肺癌细胞表达的N-cadherin、Vimentin、以及MMP-2的水平明显下降,而Ecadherin的水平得以显着提升;沉默OGFr后,上述作用被明显削弱。3、MENK可抑制人肺癌裸鼠皮下移植瘤和小鼠Lewis细胞皮下移植瘤的增殖,并能够诱导移植瘤阻滞中肺癌细胞的凋亡。免疫组化实验结果提示:MENK治疗组裸鼠及小鼠肿瘤组织中OGFr表达水平明显上调,而Ki-67表达水平明显下调。HE和TUNEL染色结果均提示:MENK可诱导移植瘤组织中肺癌细胞的凋亡。4、体内,流式结果提示:MENK可增加肿瘤和脾脏组织中DCs、NK细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞的比例,同时,MENK可增加NKG2D阳性的NK细胞及CD8+T细胞亚群比例。其中NK细胞中NKG2D的表达阳性的细胞比例升高较为显着。NK细胞功能性实验进一步表明,MENK治疗组小鼠的肿瘤和脾脏组织中Gz B、IFN-γ阳性的NK细胞比例明显增加。免疫荧光结果提示:在MENK治疗组的小鼠移植瘤组织中,CRT和HMGB1蛋白的表达明显增加;CD8+、CD4+T细胞、NK细胞、M1型巨噬细胞、DCs的比例明显增加,而髓源性抑制细胞、M2型巨噬细胞比例明显下降。免疫组化结果提示:MENK治疗组小鼠肿瘤组织中IL-15、IL-21、Gz B、IFN-γ表达水平明显升高,而IL-10、TGF-β1表达水平明显下降,同时cyclin D1、c-myc、β-catenin蛋白的表达水平明显下降。结论:1、体内外实验结果均证实,MENK在适宜的剂量下可显着抑制肺癌细胞的增殖。2、MENK可通过细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,以及可能通过增加肿瘤细胞免疫原性及重塑肿瘤微环境免疫状态,发挥抗肺癌作用。3、MENK可显着上调肺癌细胞中OGFr的表达水平,与OGFr结合后触发抗肿瘤机制,包括调控NKG2DLs-NKG2D信号通路、Bcl-2/Bax/caspase-3信号通路、Wnt/β-catenin信号通路以及EMT进程。
薛松磊[4]（2021）在《脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响》文中研究说明脐带间充质干细胞,是来源于脐带组织间质华通氏胶的一种具有多能性的干细胞。由于其免疫原性低,易于获得组织用于培养,也无伦理争议,逐渐成为干细胞研究领域的研究热点。同时,近年来外泌体的研究也在逐渐展开,其特殊的膜结构,可靶向标记的特性,正在不断应用于各项临床研究中。已有研究表明,脐带间充质干细胞及其外泌体,可以用于多种临床研究中,包括创伤愈合、脊髓损伤、术后康复、神经系统疾病、自身免疫性疾病等。但是,脐带间充质干细胞及其外泌体在肿瘤治疗中的作用和功能,及其分子机制仍不甚明了。本研究以脐带间充质干细胞及其外泌体作为研究对象,通过与肿瘤细胞共培养和仅用外泌体处理方式,观察对10个肿瘤细胞系的体外表型和体内生长特性的影响,并利用高通量测序技术分析基因表达的变化,进而阐明脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞的生物学功能和作用,为该技术临床治疗方面的应用提供实验基础。1.脐带间充质干细胞的分离培养和特性探究本章节中,成功分离培养脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测分析,显示高表达PE标记的CD73、CD90和CD105,几乎不表达FITC标记的CD11b、CD34、CD45和HLA-DR,符合干细胞表面抗原表达特性。可以定向诱导分化为:成脂细胞、成骨细胞和成软骨细胞,同时,使用两种β-巯基乙醇法都可以获得神经元样分化的细胞,表明其具备多向分化能力。在组织工程学应用探索中,脐带间充质干细胞不但可以与聚乳酸膜共培养,并且可以正常贴附和生长,表明它可以用于组织工程学。随后在增殖潜能探索中,使用表观遗传学的试剂处理,结果显示处理后有效地提高了细胞传代数和获取量,其中地西他滨5-Aza-2’-Deoxycytidine（DAC）最佳处理方案是1.25μM处理3h,曲古抑菌素TrichostatinA（TSA）最佳的处理方案是50ng/mL处理12h。综上,本研究分离获取的脐带间充质干细胞,符合间充质干细胞的生物学特性和标准,可以用于进一步的生物学和医学研究。2.脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定本章节通过无血清培养基培养本实验室自主分离的人脐带间充质干细胞,获取外泌体,并进行了鉴定。通过差速离心法和试剂盒提取法从上清提取间充质干细胞外泌体。使用透射电镜扫描,结果样本中都观察到典型杯帽状形态的外泌体。NTA粒径分析显示两种方法都获得的外泌体,都符合外泌体30～150nm粒径阈值特征。WB检测外泌体特征性表达蛋白,结果显示外泌体特异表达Tsg101、CD9和CD63蛋白,符合外泌体的特性。综上所述,本研究成功获得脐带间充质干细胞外泌体,可以用于进一步的实验研究。3.脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响在本章节中,采用了 Transwell插件共培养和直接添加外泌体两种方式处理肿瘤细胞,研究脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响。在体外细胞学实验中,本研究评价10种肿瘤细胞处理后的增殖、迁移、侵袭的能力,以及细胞周期的改变。结果显示,对于人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7,都有促进增殖、迁移和侵袭,改变细胞周期的趋势,其中对MCF7迁移影响不显着;对于胃癌细胞系AGS和BGC-823,都有促进增殖、迁移和侵袭的趋势,其中对BGC-823细胞周期改变不显着;对人肠癌细胞系HCT116和SW480,都有促进增殖和侵袭,改变细胞周期的趋势,其中对HCT116迁移是抑制作用,SW480在共培养48h与对照组有显着差异;对于人肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2,都有促进增殖、迁移和侵袭的趋势,其中对SMMC-7721细胞周期改变不显着;对于人食管癌细胞系KYSE-150有促进增殖、迁移和侵袭,改变细胞周期的趋势;对于人肺癌细胞系A549有促进增殖和迁移,改变细胞周期的趋势,对侵袭影响不显着。筛选处理后肿瘤细胞表型特征改变明显,且成瘤性好的肿瘤细胞,用于裸鼠成瘤实验。结果显示,两种处理都不同程度促进肿瘤生长,其中对于食管癌细胞系KYSE150,干细胞共培养作用高于外泌体;对于胃癌细胞系AGS,外泌体处理对于促进肿瘤生长作用越来越显着,共培养则相反;对于肠癌细胞系HCT116两种处理趋势一致。综上,本研究获得了脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞影响的表型结果,其中HCT116表现出了促进增殖和侵袭,抑制迁移,改变细胞周期的表型。4.转录组测序检测脐带间充质干细胞及其外泌体对HCT116基因表达的影响在本章节中,本研究通过RNA-seq转录组测序技术,对肠癌细胞系HCT116进行基因表达检测和分析。首先,提取3个处理组细胞的RNA,即正常对照组HCT116、脐带间充质干细胞处理组HCT116-MSC、外泌体直接处理组HCT116-EXO,随后构建文库进行RNA-seq,并进行基因表达谱分析。数据分析分为三个组:HCT116-EXO相对于 HCT116,HCT116-MSC 相对于 HCT116,HCT116-EXO 相对于 HCT116-MSC。结果显示,3组分别筛选到1531个、186个和450个差异表达基因。进一步GO分析显示这些差异基因主要涉及的RNA转录调节、凋亡抑制、血管形成、厌氧反馈、细胞增殖、细胞迁移等生物学过程。同时,对这些差异基因KEGG富集分析结果显示这些基因被富集到轴突导向、白细胞跨内皮迁移、昼夜节律、IL-17信号通路、癌症中的MicroRNAs、HTLV-I感染、MAPK、细胞因子、Hippo、TNF、Rap1调节干细胞多能性的信号通路、p53等信号通路。在3个组别中,筛选出44个共表达的差异基因,进行GO和KEGG分析,结果显示这些基因集中于细胞厌氧反馈、细胞增殖、DNA复制、衰老、伤口反馈等生物学过程,富集于的破骨细胞分化、IL-17、癌症中的MicroRNAs、HTLV-I感染、糖尿病、HIF、缺氧诱导信号通路、细胞因子、p53等关键信号通路。进一步的利用String和Cytoscape进行差异基因的互作分析,发现BMP4、SERPINE1、JUN等基因,可能在脐带间充质干细胞及其外泌体对HCT116影响中起到关键作用。上述研究表明在HCT116细胞中,这些基因参与对细胞增殖、细胞迁移和细胞侵袭等相关通路调节,导致表型的改变。综上所述,本研究成功分离了脐带间充质干细胞及其外泌体。其对10种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭主要趋势是促进作用,同时都改变细胞周期。对HCT116细胞是促进增殖和侵袭,抑制迁移,改变细胞周期的作用。RNA-seq分析结果表明,脐带间充质干细胞及其外泌体处理HCT116后,筛选的差异基因涉及细胞厌氧反馈、细胞增殖、DNA复制、衰老、伤口反馈等生物学过程,影响了破骨细胞分化、IL-17、有碳代谢、癌症中的MicroRNAs、HTLV-I感染、糖尿病、HIF通路、缺氧诱导信号通路、细胞因子受体互作、线粒体自噬、p53等通路。通过String和Cytoscape对差异基因的互作分析,发现BMP4、SERPINE1、JUN等差异表达基因。
安妮[5]（2020）在《抑制Rac1减轻小鼠放射性肺损伤并增敏肺癌放疗的作用与机制》文中研究说明研究背景:放疗（radiation therapy,RT）至今仍是多种恶性肿瘤治疗的重要手段,其目标是彻底消除肿瘤或在降低肿瘤负荷的同时保留正常组织。40%的肿瘤患者会接受RT,用于治愈、局部控瘤或缓解症状。肺脏是胸部放疗最易损伤的器官之一,胸部放疗容易引起放射性肺损伤（Radiation-induced lung injury,RILI）,成为限制肿瘤患者胸部照射剂量的主要因素,是胸部放疗难以避免的并发症之一。RILI显着影响肺癌、乳腺癌、淋巴瘤或骨髓移植全身放疗患者的治疗,降低肿瘤控制概率（tumor control probability,TCP）并可能导致呼吸困难、肺纤维化,影响患者生存质量。近年来,得益于高精度放疗技术的进步、对RILI分子机制的深入了解,以及预防与治疗药物的不断发现,RILI的发病率有所下降,但是,仍然缺乏对RILI安全有效的防治手段。而且,许多针对RILI的防护药物往往也对肿瘤产生辐射防护的效果,限制了该类药物的临床应用。理想的辐射防护剂应对正常组织具有辐射防护作用,同时又不影响放射对肿瘤细胞的杀伤效果甚至能增加肿瘤的辐射敏感性。因此,能否找到这种具有“双向”作用的辐射防护剂或分子靶点也成为提高肿瘤放疗效果的关键所在。Ras相关C3肉毒毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate1,Rac1）,属于小分子鸟苷三磷酸酶（guanosine triphosphatases,GTPases）Rho家族。既往研究表明,Rac1参与氧化应激与DNA损伤过程、与TGF-β通路关系密切、参与上皮-间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,以上生物学过程均为放射性损伤的重要机制。因此,Rac1可能是介导放射性损伤的重要分子,抑制Rac1可能对放射性肺损伤存在保护效应。另一方面,研究表明,多种肿瘤细胞存在Rac1过表达或突变,Rac1存在癌症相关功能获得性（gain-of-function,GOF）突变,不仅参与肿瘤形成、进展、侵袭及血管形成等多个方面,还介导肿瘤细胞对放化疗及免疫治疗的抗性。抑制Rac1可抑制肿瘤生长、恢复许多病例对靶向治疗的敏感性。综上,Rac1可能在放射性肺损伤的发生发展中具有重要作用,同时又对肺癌放疗产生重要影响,因此,抑制Rac1可能同时具有对正常组织的辐射防护潜力,还可抑制肿瘤生长、增加肿瘤对放疗的敏感性,是非常有前景的理想辐射防护分子靶点,这一研究国内外均无相关报道。本文一方面针对Rac1在胸部放疗所致肺损伤中的作用进行研究,从动物和细胞两个水平观察抑制Rac1对放射性肺损伤的防护效果,另一方面验证其对肿瘤放疗的影响。并进一步通过转录组测序及分析,筛选并验证Rac1下游的作用分子,从而阐明Rac1与放射性肺损伤及肿瘤放疗关系的作用机制。研究目的:探索抑制Rac1对放射性肺损伤的防护作用及机制,验证抑制Rac1对正常肺组织与肿瘤细胞的差异效应,探索介导该差异效应的分子机制。研究方法:使用60Co放射源,构建放射性肺损伤小鼠模型,使用Rac1特异性抑制剂NSC23766和H&E染色、Masson染色方法,研究抑制Rac1对模型小鼠照射后肺组织肺炎、肺纤维化程度的影响,并通过免疫组织化学染色法研究抑制Rac1对模型小鼠照射后肺组织DNA损伤标志物磷酸化H2AX（γ-H2AX）、放射损伤标志物TGF-β和EMT标志物vimentin的表达影响。使用小鼠正常肺上皮细胞系MLE-12,使用Rac1特异性抑制剂NSC23766及构建Rac1敲除细胞系的方式,通过免疫蛋白印迹法（Western Blot,WB）研究放射后凋亡相关蛋白、细胞周期相关蛋白及DNA损伤相关蛋白表达变化,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率、PI/RNase染色法检测细胞周期分布、Ed U法检测细胞增殖活力,从细胞水平上验证抑制Rac1对放射性肺损伤的保护效应。通过转录组测序寻找抑制Rac1引起的差异基因表达,筛选抑制Rac1介导其效应的可能通路,实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q PCR）法验证转录组测序结果,从细胞水平上研究介导Rac1差异作用的分子机制。进一步利用小鼠肺癌细胞系LLC研究抑制/敲除Rac1对肿瘤细胞的辐射增敏效应。最后,构建裸鼠皮下荷瘤模型、小鼠肺部原位荷瘤模型,结合使用Rac1抑制剂NSC23766,进一步在体验证抑制Rac1对正常肺组织与肿瘤细胞的双向作用。研究结果:（1）Rac1抑制剂NSC23766可减轻小鼠放射性肺炎及肺纤维化;（2）抑制或敲除Rac1对MLE-12细胞的增殖活力无明显影响,可减少MLE-12细胞照射后凋亡、逆转MLE-12细胞照射后G2/M期阻滞、减轻MLE-12细胞照射后DNA损伤;（3）敲除Rac1可下调肿瘤蛋白p53诱导核蛋白1（Tumor protein p53-inducible nuclear protein 1,Trp53inp1）,过表达Trp53inp1可部分逆转敲除Rac1对MLE-12的辐射防护效应;（4）抑制或敲除Rac1可显着抑制LLC细胞增殖活力、增加LLC细胞照射后凋亡,对LLC细胞照射后周期阻滞无明显影响;（5）过表达Trp53inp1可协同敲除Rac1的促LLC凋亡效应,对小鼠肺癌细胞周期及增殖活力无明显影响;（6）肿瘤细胞LLC的Rac1表达显着高于正常肺上皮细胞MLE-12,且存在Rac1插入突变;（7）肿瘤细胞LLC的Trp53inp1表达显着低于正常肺上皮细胞MLE-12;（8）裸鼠皮下荷瘤及小鼠肺部原位荷瘤模型在体验证表明,抑制Rac1可显着抑制肿瘤细胞生长,同时对正常肺组织存在辐射防护效应。研究结论:抑制Rac1可减轻放射性肺损伤小鼠模型的放射性肺炎、肺纤维化,减少正常肺上皮细胞照射后凋亡、逆转照射引起的正常肺上皮细胞周期阻滞、减轻放射性DNA损伤,该效应部分通过下调Trp53inp1介导,过表达Trp53inp1可部分逆转抑制Rac1对正常肺上皮细胞的辐射防护效应。此外,抑制Rac1可显着增加小鼠肺癌细胞LLC对放射损伤的敏感性、显着抑制小鼠肺癌细胞生长。与正常肺上皮细胞相比,小鼠肺癌细胞Rac1过表达且突变、Trp53inp1表达显着降低,可能是介导抑制Rac1对正常细胞及肿瘤细胞差异效应的原因。
徐旭[6]（2020）在《基于网络药理学研究血府逐瘀汤治疗肺癌的作用机制》文中指出目的:运用网络药理学的方法,探究血府逐瘀汤治疗肺癌的作用机制。方法:通过中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）数据库查询血府逐瘀汤中的成分,并通过口服生物利用度（OB）≥30%,类药性（DL）≥0.18,筛选化合物,通过查阅国内外文献和Drug Bank数据库了解化合物的详细信息并进行确认核对。将核对后的化合物上传至Pharmmapper服务器并设置参数,对返回的靶点结果在Uniprot数据库、String数据库核对,最终得到血府逐瘀汤的有效靶点信息及蛋白互作网络图。从OMIM数据库、GAD数据库、CTD数据库中获得肺癌的相关靶点,并将三个数据库得到的靶点进行对比得到肺癌靶点。利用韦恩图得出血府逐瘀汤和肺癌的共有靶点。将靶点导入metascape数据库,设置物种为人类（sapiens）,得到相关数据和PPI图。使用DAVID数据库、KOBAS数据库和metascape数据库对共同靶点和信号通路进行GO富集分析和KEGG通路富集分析并得出相应图标和结果。结果:从血府逐瘀汤中共筛选得到226个活性成分,其中重要成分有β-谷固醇（beta-sitosterol）、豆固醇（Stigmasterol）、槲皮素（quercetin）、谷固醇（sitosterol）、赤霉素（Gibberellin A44）、Shinpterocarpin等。这些成分对应262个靶点,其中与肺癌相关的人源靶点258个,关键靶点为TP53、BCL2、AKT1。血府逐瘀汤可能通过TP53抑制肺癌细胞的生长、衰老、凋亡,通过BCL2靶点调节肺癌细胞的凋亡作用,通过AKT调节肺癌细胞的转移作用。通过DAVID数据库GO分析得出2833个生物学过程（Biological Process,BP）,1521个细胞组成（Cellular Component,CC）,2886个分子功能（molecular function,MF）。通过KEGG、CORUM等多个通路富集库分析显示1893条信号通路。肿瘤通路（hsa05200:Pathways in cancer）、白介素-4和白介素-13信号传导（R-HSA-6783783:Interleukin-4 and Interleukin-13 signaling）、信号传导（R-HSA-162582:Signal Transduction）、免疫系统（R-HSA-168256:Immune System）、白细胞介素的信号传递（R-HSA-449147:Signaling by Interleukins）等是比较重要的通路。而在肿瘤通路中的c AMP、MAPK、VEGF等多种信号通路在血府逐瘀汤治疗肺癌中起到主要作用。结论:本研究通过网络药理学证实:血府逐瘀汤可能通过TP53、BCL2、AKT抑制肺癌细胞的生长、衰老、凋亡、转移作用,可以通过hsa05200中的c AMP、VEGF、MAPK等多种信号通路作用于肺癌细胞的细胞周期阻滞、凋亡、浸润、生长、复发、转移。
李增政[7]（2020）在《补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选》文中提出背景:免疫力低下在祖国医学看来多属于肾阳虚的范畴,以温阳补肾固卫气的根本出发对治疗临床上免疫力低下的患者有较好的疗效,尤其是对白血病患者,可以减轻白血病患者因药物产生的副作用和免疫抑制。细胞免疫治疗是新兴的肿瘤治疗手段之一,其通过各种生物技术手段在体外对免疫活性细胞进行改造,扩增后再回输到患者体内,进而达到提高患者免疫力,同时抑制或杀死肿瘤细胞的目的。此外在现代医学治疗白血病中小分子抑制剂占了重要一席,尤其是酪氨酸酶抑制剂,自伊马替尼诞生以来大大改变了慢性粒细胞白血病的治疗方式。许多中药或有药用作用的植物药对白血病细胞具有一定的杀伤作用,尽管已经报道了很多有治疗效果的小分子,但诸多药物中存在的小分子对白血病细胞的作用我们仍然不清楚。前期的临床实践证明补阳中药方剂有助于提升肾阳虚患者免疫力和白血病预后的线索,但方剂中的主要活性成分和起重要作用的中药我们对此知之甚少。同时诸多药用植物在民间被用来抗肿瘤,但其中起抗肿瘤作用的活性分子我们也仍然不清楚。因此本课题围绕补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫细胞的调节及活性成分分析和新型小分子抗白血病细胞的筛选来开展。目的:（1）探索中药补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫系统的调节作用为临床用药提供基础研究数据。（2）通过对补肾回阳方中的主要活性成分单体解析使得对该方剂的认识更加深入。（3）筛选出药用植物中具有抗白血病细胞的新型天然小分子为后续工作打下基础。方法:（1）补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫细胞的调节作用:通过腹腔注射25mg/kg氢化可的松,建立肾阳虚小鼠模型,对照组每日腹腔注射等量生理盐水,各组连续给药10天后,检测肾阳虚模型组和对照组小鼠的一般体征、外周血象、以及T淋巴细胞亚群等指标。随后给予肾阳虚模型小鼠补肾回阳方0.25ml/天灌胃治疗,模型对照组和空白对照组用生理盐水灌胃,一天一次,连续给药15天。治疗结束后检测小鼠的一般体征、外周血的相关免疫细胞,和通过流式细胞术测定各组小鼠的外周血、骨髓和脾脏的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平;以及分离小鼠外周血单核细胞进行后期细胞因子诱导培养DC细胞,检测其体外扩增情况,最后进行数据统计分析。（2）补肾回阳方的活性成分法分析:将补肾回阳方的浓缩液和标准品进行高效液相色谱分析和液质色谱串联分析,通过对比标准品和数据库来探索补肾回阳方中的活性成分。（3）新型小分子抗白血病细胞作用的:将分离得到的新型小分子化合物进行CCK-8药敏实验,筛选对白血病细胞有抑制作用的小分子。结果:（1）补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫细胞的调节作用:中药灌胃治疗后,与模型对照组相比补肾回阳组小鼠的体重增长明显;外周血中白细胞和淋巴细胞水平明显上升;外周血、骨髓和脾脏中的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平明显提高;经过补肾回阳方灌胃治疗的肾阳虚模型小鼠,由外周血分离单核细胞经体外细胞因子诱导培养的DC细胞,细胞数量也明显高于模型对照组。（2）补肾回阳方的活性成分分析:结合标准品和数据库分析得到补肾回阳方中含有甘草苷、淫羊藿苷、次乌头碱三种物质,此外还得到与淫羊藿成分:异槲皮素、淫羊藿次苷II、淫羊藿苷A、淫羊藿次苷D2;炙甘草成分:甘草素、芹糖甘草苷、甘草黄酮C、甘草次酸;干姜成分:6-姜烯酚、6-姜辣素;肉桂成分:桂皮醛分子式和分子量一致的11种物质。（3）YWF-10、YHL-14、YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7、DX-15小分子对THP-1、Jurkat、KG-1三种细胞均有抑制作用,其中YHL-14、YWF-08两种小分子对32D细胞的抑制作用没有统计学差异（P>0.05）,但对KG-1、THP-1的抑制作用有统计学差异（P<0.01）,并且YWF-08对Jurkat细胞也有较强的抑制作用（P<0.001）。YWF-10、YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7五种小分子对Jurkat细胞的抑制率远高于对其他细胞的抑制率;相比于对32D细胞的抑制率Jurkat细胞的抑制率也远大于对32D细胞的抑制率。结论:（1）补肾回阳方可以提升肾阳虚小鼠外周血中的白细胞和淋巴细胞数量,可以提高外周血、骨髓和脾脏中的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平,以及可以提高DC细胞的体外诱导培养数量,证明补肾回阳方对肾阳虚小鼠具有增强和恢复免疫的功效。（2）补肾回阳方中含有甘草苷、淫羊藿苷、次乌头碱三种物质,此外含有与异槲皮素、淫羊藿次苷II、淫羊藿苷A、淫羊藿次苷D2、甘草素、芹糖甘草苷、甘草黄酮C、甘草次酸、6-姜烯酚、6-姜辣素、桂皮醛分子式和分子量一致的物质11种,其中淫羊藿和炙甘草的活性成分最多,鉴于前人的研究和本研究结果在补肾回阳方对免疫的正向调节作用中淫羊藿和炙甘草发挥了要作用。（3）YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7五种小分子对Jurkat细胞的抑制率远高于对其他细胞的抑制率;其中YHL-14、YWF-08两种小分子对32D细胞没有抑制作用,但对KG-1细胞和THP-1细胞有较强的抑制作用。
吴晓峰[8]（2020）在《选择性COX-2抑制剂联合EGFR-TKI对肺癌细胞增殖、免疫的影响及其机制的研究》文中认为目的将选择性COX-2（Cyclooxygenase-2,环氧化酶-2）抑制剂CLX（Celecoxib,塞来昔布）联合EGFR-TKI（Epidermal Growth Factor Receptor-Tyrosine Kinase Inhibitor,表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂）厄洛替尼作用于肺腺癌细胞株（HCC827）荷瘤裸鼠模型,检测肿瘤细胞内增殖相关因子:PCNA（Proliferating Cell Nuclear Antigen,增殖细胞核抗原）,COX-2,EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor,表皮生长因子受体）,免疫调节相关因子:TGF-β（Transforming Growth Factor-β,转化生长因子-β）,血清IL-6（Interleukin-6,白介素-6）,血清IL-8（Interleukin-8,白介素-8）,探究二者药物联合对肺癌细胞增殖,免疫方面的影响及机制。方法（1）将外购达标的24只（HCC827）荷瘤裸鼠模型随机分为4组,分别为:对照组,CLX组,厄洛替尼组,塞来昔布+厄洛替尼组（联合组）,每组给与不同的处理方式,具体分别为:对照组:经胃灌注1%tween80溶液;CLX组:经胃灌注等量CLX溶液;厄洛替尼组:经胃灌注等量厄洛替尼溶液;联合组:经胃灌注CLX溶液和厄洛替尼溶液,持续进行17天。（2）给药期间密切观察各组裸鼠的一般状况,如进食量,活动量、色泽及反应性等指标,每隔1天测量荷瘤裸鼠瘤径,第17天将荷瘤裸鼠处死,完整剥离瘤体,测瘤径和重量,计算离体移植瘤体积、抑瘤率。（3）用免疫组化法测各组荷瘤裸鼠模型内增殖相关因子:PCNA、COX-2、EGFR蛋白的表达含量。（4）.用ELISA法测各组肺腺癌HCC827裸鼠移植瘤血清中免疫因子IL-6,IL-8的表达含量,免疫组化法测细胞中免疫因子TGF-β的表达含量。（5）统计学方法:应用SPSS 25.0软件进行统计分析,计量资料采用均数±标准差（`x±s）表示,两组样本均数比较行t检验;多组样本间均数比较应用Oneway Anova法（单因素方差分析法）,认为P<0.05差异具有统计学意义。结果（1）依据测量结果和计算得出:CLX组、厄洛替尼组、联合组的瘤体抑瘤率分别为:33.18%、71.61%、94.20%,瘤重抑瘤率分别为34.78%、67.63%、91.93%。结果表明CLX组、厄洛替尼组、联合组的抑瘤率都大于对照组,差异有统计学意义（P﹤0.05）,此外两个单药组的抑瘤率明显低于联合组,差异有统计学意义（P﹤0.05）。（2）免疫相关表达结果（ELISA+免疫组化法）:CLX组血清IL-6,IL-8表达含量较对照组减低,差异有统计学意义（P<0.05）;CLX+厄洛替尼组血清IL-6,IL-8表达含量低于对照组、CLX组与厄洛替尼组,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫因子TGF-β于胞浆呈棕黄色阳性表达。CLX+厄洛替尼组中的TGF-β阳性表达,均显着低于其在对照组、CLX组及厄洛替尼组中的阳性表达,差异均有统计学意义（P<0.05）。（3）增殖相关表达结果（免疫组化法）:HCC827肺癌细胞内PCNA呈褐黄色阳性表达（胞核内）,COX-2呈褐黄色阳性表达（胞浆内）,EGFR于呈褐黄色阳性表达（胞核、胞浆内）。对照组内PCNA、COX-2的阳性表达比CLX组的阳性表达强度高,差异有统计学意义（P<0.05）。联合组中PCNA、COX-2、EGFR的阳性表达均显着低于其余3组,差别具有统计学意义（P<0.05）。结论（1）本动物实验表明CLX联合厄洛替尼可减弱细胞增殖因子COX-2、EGFR、PCNA的表达,抑制肺肿瘤细胞的生长增殖。（2）CLX联合厄洛替尼可下调细胞因子IL-6,IL-8,TGF-β的表达,发挥免疫调节功能,可能也参与抗肿瘤作用。（3）选择性COX-2抑制剂联合EGFR-TKI能够增强抗肺肿瘤作用,有望成为一类辅助性抗肿瘤药物。
张慧[9]（2020）在《斑蝥素对肺腺癌A-549细胞的放射敏感性影响的研究》文中研究指明目的研究斑蝥素对体外培养非小细胞肺癌A-549细胞的放疗增敏的作用,并初步探讨其机制。方法以非小细胞肺癌细胞株A-549为实验对象,CCK8法测定不同浓度,不同时间斑蝥素对A-549细胞的增殖抑制作用,求出作用24h的IC50和IC20;克隆形成实验分析斑蝥素与放射联合效应,利用单击多靶模型进行曲线拟合,获得细胞存活曲线及平均致死剂量D0,准阈剂量Dq,放射增敏比SER等参数;流式细胞技术分析斑蝥素与放射联合作用于A-549细胞的细胞周期及凋亡率;Western blot检测斑蝥素和射线照射不同组间凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax含量,初步探讨斑蝥素提高放疗敏感性机制。结果1、通过CCK8法证明斑蝥素对A-549细胞有生长抑制作用,且呈时间和剂量依赖性,作用24h的IC50为3.113μg/ml,IC20为0.362μg/ml。2、通过观察空白组,斑蝥素组,斑蝥素+放疗组细胞状态可以看出斑蝥素和射线均可以引起细胞凋亡。3、克隆形成实验显示斑蝥素和射线均可降低A-549细胞的克隆形成率,且放疗联合斑蝥素组的克隆形成率最低,Dq、D0均较单纯放疗组低,且SER为1.262,差异有统计学意义（P<0.05）,说明斑蝥素可以增强射线对肺癌A-549细胞的杀伤作用。同时证明在相同的药物浓度下随着照射剂量的提高,肺癌A-549细胞的凋亡明显增多。4、各处理组细胞的细胞周期和凋亡率结果表明,斑蝥素+放疗组G2/M期细胞比例较其他组明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）;细胞凋亡率斑蝥素组联合放疗组较其他组明显增多,差异亦有统计学意义（P<0.05）。5、Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax,斑蝥素+放疗组的Bcl-2蛋白明显减少,Bax蛋白明显增多,且较其他组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论1、斑蝥素对体外培养的肺腺癌A-549细胞有增值抑制作用,起作用与药物浓度与作用时间呈正相关性。2、斑蝥素对体外培养的肺腺癌A-549细胞有放射增敏作用。3、斑蝥素增加肺腺癌A-549细胞放疗敏感性的机制可能是阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡。
梁任隆[10]（2020）在《回生口服液经PD-1/PD-L1通路调控肺癌免疫逃逸的机制研究》文中指出目的:研究回生口服液是否通过调控程序性死亡受体1（Programmed death-1,PD-1）/程序性死亡配体-1（Programmed death-ligand 1,PD-L1）信号通路,抑制L ewis肺癌小鼠肺癌细胞免疫逃逸,恢复机体抗肿瘤免疫功能,促进肺癌康复;研究结果可为制定肺癌临床治疗与康复新方案提供实验依据。方法:1.70只健康C57BL/6J小鼠采用随机数字表随机分为空白对照组、模型组、顺铂组、回生口服液组、回生口服液+顺铂联合用药组。空白对照组正常饲养,其余四组建立Lewis肺癌模型。2.造模成功后,空白对照组、模型组每日给予生理盐水灌胃;回生口服液组每日给予回生口服液灌胃;顺铂组每日给予生理盐水灌胃,每周2次予顺铂注射液腹腔注射;联合用药组每日给予回生口服液灌胃,每周2次予顺铂注射液腹腔注射。共干预2周。3.治疗过程中观察记录各组小鼠一般情况,测量小鼠瘤体体积;干预结束后,剥取瘤组织,计算抑瘤率,透射电镜观察肺癌细胞超微结构;应用Westernblot法检测肺癌组织PD-L1、PD-1蛋白表达;流式细胞技术检测外周血CD4+T、CD8+T、CD4+CD25+CD127low/-Tregs占淋巴细胞比例。结果:1. 一般情况模型组肺癌小鼠在治疗过程中逐渐出现精神萎靡,反应迟钝,进食饮水减少,活动能力下降,喜扎堆生活,皮毛光泽度下降等现象;各组小鼠一般情况由好到差的程度对比为:空白对照组>回生口服液组>联合用药组>模型组>顺铂组,提示回生口服液有改善肺癌小鼠一般情况的作用。2. 各组药物治疗肺癌有效性检验（1）瘤体生长速度:经瘤块体积变化反应瘤体生长速度,从快到慢依次为模型组>回生口服液组>顺铂组>联合用药组。（2）瘤重及抑瘤率:与模型组比较,回生口服液组、顺铂组、联合用药组瘤重明显减轻（P<0.05）;抑瘤率有统计学意义（P<0.05）,联合用药组抑瘤率高于顺铂组及回生口服液组（P<0.05）。（3）透射电镜观察:模型组肺癌细胞核大、不规则,有假包体形成,但细胞器相对完整,线粒体无明显肿胀,未见明显凋亡。回生口服液组、顺铂组、联合用药组同样可见肺癌细胞核大、不规则,有假包体形成,但出现线粒体肿胀,细胞中可见自噬体及凋亡小体,并见许多细胞进入凋亡状态,联合用药组最为明显。3. 各组药物对肺癌细胞免疫逃逸关键靶点PD-1、PD-L1蛋白表达的影响（1）PD-L1蛋白:与模型组比较,回生口服液组及联合用药组PD-L1蛋白表达均下调（P<0.05）,顺铂组PD-L1蛋白表达上调（P<0.05）;回生口服液组PD-L1蛋白表达低于联合用药组（P<0.05）。（2）PD-1蛋白:与模型组比较,回生口服液组及联合用药组PD-1蛋白表达均下调（P<0.05）;顺铂组PD-1蛋白表达与模型组无统计学差异;与顺铂组比较,回生口服液组及联合用药组PD-1蛋白表达均下调（P<0.05）;回生口服液组PD-1蛋白表达低于联合用药组（P<0.05）。4. 各组药物对外周血CD4+T、CD8+T、CD4+CD25+CD127low/-Tregs比例的影响（1）CD4+T:与空白对照组比较,模型组、顺铂组及联合用药组CD4+T比例均下降（P<0.05）,回生口服液组与空白对照组无统计学差异;与模型组比较,顺铂组CD4+T比例无统计学差异,回生口服液组及联合用药组CD4+T比例升高（P<0.05）,且回生口服液组CD4+T比例高于联合用药组（P<0.05）。（2）CD8+T:与空白对照组比较,模型组、顺铂组CD8+T比例均下降（P<0.05）,联合用药组CD8+T比例升高（P<0.05）,回生口服液组CD8+T比例无统计学差异;与模型组比较,回生口服液及联合用药组CD8+T比例均升高（P<0.05）,且联合用药组升高比例最大,顺铂组CD8+T比例无统计学差异。（3）CD4+CD25+CD127low/-Tregs:与空白对照组比较,模型组、顺铂组、联合用药组Tregs比例均升高（P<0.05）,回生口服液组与空白对照组无统计学差异;与模型组比较,回生口服液组及联合用药组Tregs比例均下降（P<0.05）,顺铂组Tregs比例差异无统计学意义;联合用药组与回生口服液组无统计学差异。结论:1.回生口服液可抑制Lewis肺癌小鼠肺癌细胞增殖,促进肺癌细胞凋亡,改善Lewis肺癌小鼠一般生存情况;回生口服液与顺铂联合用药,可对顺铂治疗肺癌起增效减毒作用。2.回生口服液可能通过抑制PD-1及PD-L1蛋白表达,阻止PD-1/PD-L1信号通路激活,一方面提升CD4+T、CD8+T水平,恢复CD8+T对肺癌细胞识别及杀灭能力;另一方面下调CD4+CD25+CD127low/-Tregs水平,改善肺癌免疫抑制微环境,阻止肺癌细胞逃避免疫系统识别与杀伤,发挥调控肺癌细胞免疫逃逸的功效,达到治疗肺癌、促进肺癌康复的作用。
二、白介素6与化疗药物对人肺癌细胞生长影响的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、白介素6与化疗药物对人肺癌细胞生长影响的研究（论文提纲范文）
（1）七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肺癌的发病机制及临床表现 |
| 1.1.1 肺癌的发生 |
| 1.1.2 罹患肺癌的危险因素 |
| 1.1.3 肺癌的临床表现 |
| 1.2 肺癌的诊断 |
| 1.2.1 肺癌的辅助影像学检查 |
| 1.2.2 获取肺癌组织学或细胞学检查技术 |
| 1.2.3 肺癌的实验室血清学检查 |
| 1.2.4 肺癌的病理学评估 |
| 1.3 肺癌的治疗 |
| 1.4 肺癌的靶向治疗 |
| 1.4.1 非小细胞肺癌靶向药物 |
| 1.4.1.1 以表皮生长因子受体为靶点的药物 |
| 1.4.1.2 间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制药 |
| 1.4.1.3 ROS1 重排抑制药 |
| 1.4.1.4 血管内皮生长因子为靶点的药物 |
| 1.4.1.5 其他 |
| 1.4.2 非小细胞肺癌免疫治疗药物 |
| 1.4.3 SCLC靶向药物的现状 |
| 1.5 七鳃鳗LIP的发现及细胞毒作用 |
| 1.6 本研究目的及意义 |
| 第2章 七鳃鳗LIP蛋白对23 种肿瘤细胞杀伤活性比较分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组LIP蛋白的表达及纯化 |
| 2.2.2 重组LIP蛋白浓度测定 |
| 2.2.3 重组LIP蛋白活性鉴定 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 重组LIP蛋白细胞毒性测定 |
| 2.2.6 流式细胞仪对LIP蛋白杀伤肿瘤细胞定量分析 |
| 2.2.7 Western blot检测LIP蛋白在细胞膜表面的沉积 |
| 2.2.8 数据统计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 重组LIP蛋白的纯化 |
| 2.3.2 流式细胞仪检测LIP蛋白对肿瘤和正常细胞的识别 |
| 2.3.3 Western Blot检测LIP蛋白在细胞表面的沉积 |
| 2.3.4 LIP蛋白细胞毒性测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 LIP蛋白对三种肺癌细胞的生物学活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Operetta TM高内涵成像分析系统检测LIP蛋白对三种肺癌细胞的杀伤活性 |
| 3.2.2 荧光显微镜检测LIP对三种肺癌细胞微团杀伤活性 |
| 3.2.3 LDH检测LIP对三种肺癌细胞的杀伤活性 |
| 3.2.4 Operetta TM高内涵成像分析系统检测LIP联合顺铂对三种肺癌细胞的杀伤作用 |
| 3.2.5 细胞划痕实验检测LIP蛋白对三种肺癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.2.6 免疫荧光检测LIP蛋白对细胞骨架的影响 |
| 3.2.7 数据统计 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞杀伤活性探究 |
| 3.3.2 LIP蛋白与多种化疗药物对三种肺癌细胞杀伤活性比较探究 |
| 3.3.3 LIP蛋白与顺铂联合作用三种肺癌细胞探究 |
| 3.3.4 LIP蛋白对三种肺癌细胞迁移能力探究 |
| 3.3.5 LIP蛋白对三种肺癌细胞骨架的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 LIP蛋白对三种肺癌细胞线粒体膜电位及细胞凋亡的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 免疫荧光检测LIP蛋白对线粒体的影响 |
| 4.2.2 Annexin V-FITC检测LIP作用肺癌细胞后细胞凋亡情况 |
| 4.2.3 流式细胞仪检测LIP作用肺癌细胞后细胞凋亡情况 |
| 4.2.4 流式细胞术检测LIP蛋白作用后肺癌细胞线粒体膜电位变化 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞线粒体损伤探究 |
| 4.3.2 LIP蛋白诱导三种肺癌细胞凋亡检测 |
| 4.3.3 LIP蛋白通过影响线粒体膜电位变化抑制线粒体功能 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 LIP蛋白通过引起内质网应激激活细胞凋亡通路 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 主要材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 免疫荧光检测LIP蛋白对三种肺癌细胞内质网的影响 |
| 5.2.2 共聚焦监测LIP蛋白对三种肺癌细胞内ROS的影响 |
| 5.2.3 细胞蛋白提取及蛋白浓度定量 |
| 5.2.4 WesternBlot检测内质网应激及加入抑制剂后凋亡通路相关蛋白的表达 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LIP蛋白对三种肺癌细胞内质网的损伤 |
| 5.3.2 LIP蛋白作用三种肺癌细胞后ROS含量变化情况 |
| 5.3.3 三种肺癌细胞中内质网应激诱导的凋亡通路相关蛋白表达情况 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 LIP蛋白在荷瘤小鼠及人源肿瘤组织水平对瘤体的识别和抑瘤作用 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 主要材料 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 注射LIP蛋白对小鼠肺癌细胞瘤的影响 |
| 6.2.2 透射电镜观察鼠肺癌肿瘤组织 |
| 6.2.3 人肺癌肿瘤组织的保存处理 |
| 6.2.4 肿瘤组织包埋及冰冻切片的制备 |
| 6.2.5 人肺癌肿瘤组织的HE染色 |
| 6.2.6 人肺癌肿瘤组织的免疫组织化学染色 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 小鼠肺癌细胞瘤注射LIP蛋白后的变化 |
| 6.3.2 LIP蛋白促小鼠A549-Luc-C8 细胞瘤的细胞凋亡 |
| 6.3.3 LIP蛋白对荷瘤小鼠正常组织形态的影响 |
| 6.3.4 人肺癌组织的HE染色 |
| 6.3.5 LIP蛋白特异性识别人肺癌组织 |
| 6.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文情况 |
| 读博期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
（2）糖代谢基因在肺腺癌组织中的表达及沙参麦冬汤干预的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 GLUT1、HK2、LDHA在肺腺癌组织中的表达及临床意义 |
| 引言 |
| 1 研究内容与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 沙参麦冬汤对糖代谢基因的干预作用及机制研究 |
| 引言 |
| 实验一 沙参麦冬汤含药血清对肺腺癌细胞增殖的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 实验二 沙参麦冬汤含药血清对肺腺癌细胞凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 实验三 沙参麦冬汤对肺腺癌细胞GLUT1、HK2、LDHA表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 实验四 沙参麦冬汤对肺腺癌细胞迁移和侵袭的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 实验五 沙参麦冬汤对肺腺癌细胞糖代谢的影响及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录一 综述 恶性肿瘤糖酵解研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 肺癌的TNM分级 |
| 附录三 肺癌的分期 |
| 附录四 攻读博士期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）蛋氨酸脑啡肽（MENK）对肺癌生物学行为的调控及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:MENK体外抑制肺癌及其相关作用机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 细胞培养相关试剂 |
| 2.1.3 转染试剂 |
| 2.1.4 细胞功能性实验相关试剂 |
| 2.1.5 qRT-PCR实验主要试剂 |
| 2.1.6 Western Blot主要试剂和材料 |
| 2.1.7 免疫荧光相关试剂及材料 |
| 2.1.8 流式蛋白检测主要试剂及材料 |
| 2.1.9 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 试剂配制 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 实验分组(一) |
| 2.2.4 CCK-8检测细胞增殖能力 |
| 2.2.5 细胞形态学观察 |
| 2.2.6 克隆形成实验 |
| 2.2.7 细胞周期检测 |
| 2.2.8 流式细胞凋亡检测 |
| 2.2.9 Hoechst 33258染色检测凋亡 |
| 2.2.10 细胞划痕实验 |
| 2.2.11 Transwell细胞侵袭实验 |
| 2.2.12 免疫荧光实验 |
| 2.2.13 流式检测细胞表面相关蛋白的表达 |
| 2.2.14 qRT-PCR及Western blot检测各肺癌细胞系OGFr的表达 |
| 2.2.15 OGFr-siRNA转染及筛选 |
| 2.2.16 慢病毒转染及验证 |
| 2.2.17 敲减效果验证 |
| 2.2.18 实验分组(二) |
| 2.2.19 qRT-PCR检测mRNA水平 |
| 2.2.20 Western Blot检测各蛋白表达水平 |
| 2.2.21 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MENK对肺癌细胞增殖的影响 |
| 3.2 MENK对正常肺上皮细胞的影响 |
| 3.3 MENK可改变肺癌细胞的形态 |
| 3.4 MENK对肺癌细胞细胞克隆形成能力的影响 |
| 3.5 MENK对肺癌细胞细胞周期的调控 |
| 3.6 MENK对肺癌细胞凋亡的影响 |
| 3.7 MENK对肺癌细胞迁移和侵袭的影响 |
| 3.8 MENK对肺癌细胞中CRT及HMGB1表达水平的影响 |
| 3.9 MENK上调肺癌细胞中NKG2DLs的表达水平 |
| 3.10 MENK对肺癌细胞中OGFr表达的影响 |
| 3.11 OGFr-siRNA有效序列的筛选及沉默验证 |
| 3.12 OGFr沉默后,MENK对人肺癌细胞增殖、凋亡的影响 |
| 3.13 MENK对肺癌细胞中Wnt/β-catenin通路的影响 |
| 3.14 MENK对肺癌细胞中上皮间质转化相关因子表达的影响 |
| 3.15 MENK对肺癌细胞中Bax、Bcl-2和caspase-3表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:MENK体内通过重塑肿瘤微环境中免疫细胞浸润抑制肺癌增殖 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系和实验动物 |
| 2.1.2 相关试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 主要试剂的配制 |
| 2.2.2 细胞培养 |
| 2.2.3 实验分组 |
| 2.2.4 裸鼠肺癌细胞皮下移植瘤模型 |
| 2.2.5 小鼠皮下成瘤模型 |
| 2.2.6 HE染色 |
| 2.2.7 免疫组织化学 |
| 2.2.8 免疫荧光 |
| 2.2.9 流式检测部分免疫细胞的比例及功能情况 |
| 2.2.10 TUNEL凋亡检测 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 MENK抑制裸鼠及小鼠肺癌皮下移植瘤的增殖 |
| 3.2 MENK促进裸鼠及小鼠皮下移植瘤细胞的凋亡,抑制其增殖 |
| 3.3 MENK对肺癌移植瘤组织中Ki-67表达的影响 |
| 3.4 MENK上调肺癌移植瘤组织中OGFr的表达 |
| 3.5 MENK对肺癌移植瘤组织中CRT及HMGB1表达的影响 |
| 3.6 MENK对肿瘤微环境中免疫细胞浸润的影响 |
| 3.7 MENK对肿瘤微环境中细胞因子的影响 |
| 3.8 MENK对小鼠脾脏和肿瘤组织中部分免疫细胞的影响 |
| 3.9 MENK对cyclin D1, c-myc和β-catenin蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 非小细胞肺癌免疫治疗的临床进展与困惑 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 干细胞研究进展 |
| 1.1.1 干细胞的分类 |
| 1.1.2 干细胞的特性 |
| 1.1.3 干细胞的应用 |
| 1.2 间充质干细胞的研究进展 |
| 1.2.1 间充质干细胞的定义 |
| 1.2.2 间充质干细胞的特性 |
| 1.2.3 间充质干细胞的应用 |
| 1.3 脐带间充质干细胞及其外泌体的特性 |
| 1.3.1 脐带间充质干细胞的分离和鉴定 |
| 1.3.2 脐带间充质干细胞的生物学特性 |
| 1.3.3 脐带间充质干细胞外泌体的特性 |
| 1.4 间充质干细胞及外泌体的应用 |
| 1.4.1 在衰老和损伤性疾病治疗中的应用 |
| 1.4.2 在免疫缺陷和代谢性疾病中的应用 |
| 1.4.3 在癌症和肿瘤治疗中的应用 |
| 1.5 本研究的目的意义和主要内容 |
| 1.5.1 本研究的目的意义 |
| 1.5.2 本研究的主要内容 |
| 第2章 脐带间充质干细胞的分离和鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 脐带间充质干细胞的分离 |
| 2.3.2 脐带间充质干细胞的培养 |
| 2.3.3 诱导脐带间充质干细胞成骨分化 |
| 2.3.4 诱导脐带间充质干细胞成脂分化 |
| 2.3.5 诱导脐带间充质干细胞成软骨分化 |
| 2.3.6 诱导脐带间充质干细胞成神经元分化 |
| 2.3.7 BD流式细胞仪鉴定表面标记 |
| 2.3.8 脐带间充质干细胞在聚乳酸膜上生长 |
| 2.3.9 DAC和TSA处理脐带间充质干细胞 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 分离培养脐带间充质干细胞 |
| 2.4.2 脐带间充质干细胞表面抗原的鉴定 |
| 2.4.3 脐带间充质干细胞多向分化潜能分析 |
| 2.4.4 脐带间充质干细胞诱导为神经元细胞 |
| 2.4.5 脐带间充质干细胞在聚乳酸膜上生长 |
| 2.4.6 DAC和TSA处理对脐带间充质干细胞生长的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 脐带间充质干细胞外泌体的分离和鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂及耗材 |
| 3.2.2 实验器材 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 外泌体的分离 |
| 3.3.2 外泌体浓度测定 |
| 3.3.3 外泌体表面抗原鉴定 |
| 3.3.4 外泌体透射电镜检测 |
| 3.3.5 外泌体的粒径分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 外泌体电镜检测结果 |
| 3.4.2 外泌体粒径分析结果 |
| 3.4.3 外泌体蛋白鉴定结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 脐带间充质干细胞及外泌体对肿瘤细胞表型的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞目录 |
| 4.2.2 试剂及耗材 |
| 4.2.3 实验器材 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 共培养处理方法 |
| 4.3.2 外泌体添加方法 |
| 4.3.3 细胞增殖检测 |
| 4.3.4 划痕愈合实验 |
| 4.3.5 细胞周期检测 |
| 4.3.6 细胞侵袭实验 |
| 4.3.7 裸鼠成瘤实验 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞增殖影响 |
| 4.4.2 脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞迁移的影响 |
| 4.4.3 脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞周期的影响 |
| 4.4.4 脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞侵袭的影响 |
| 4.4.5 脐带间充质干细胞及其外泌体对小鼠成瘤的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞基因表达谱的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 肿瘤细胞的转录组测序 |
| 5.3.2 肿瘤细胞测序数据分析 |
| 5.3.3 转录组测序结果的验证 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 测序的RNA样品质量控制结果 |
| 5.4.2 测序数据与人基因组比对结果 |
| 5.4.3 RNA-Seq重复样本相关性分析 |
| 5.4.4 基因表达分析 |
| 5.4.5 差异表达基因筛选 |
| 5.4.6 差异表达基因聚类分析 |
| 5.4.7 细胞差异表达基因GO富集分析 |
| 5.4.8 细胞差异表达基因KEGG通路富集分析 |
| 5.4.9 共有差异表达基因分析 |
| 5.4.10 RNA-Seq结果验证 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）抑制Rac1减轻小鼠放射性肺损伤并增敏肺癌放疗的作用与机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、放射性肺损伤的发病率不容忽视,目前仍缺乏有效治疗手段 |
| 二、Rac1可能参与放射性损伤的主要发病机制 |
| (一)Rac1参与调控氧化应激过程 |
| (二)Rac1与TGF-β关系密切 |
| (三)Rac1与DNA损伤修复有关 |
| 三、Rac1参与肿瘤形成与进展的多个方面,参与肿瘤治疗抗性 |
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| (一)实验动物 |
| (二)实验细胞系 |
| (三)放射源 |
| (四)试剂 |
| (五)仪器 |
| 二、方法 |
| (一)动物实验 |
| 1、动物基本处理 |
| 2、放射性肺损伤小鼠模型 |
| 3、苏木精——伊红染色法(H&E染色) |
| 4、Masson染色 |
| 5、TUNEL染色 |
| 6、裸鼠皮下荷瘤 |
| 7、小鼠肺部原位荷瘤 |
| (二)细胞实验 |
| 1、细胞常规处理 |
| 2、CCK-8细胞增殖活力检测 |
| 3、流式细胞仪细胞凋亡检测 |
| 4、流式细胞仪细胞周期检测 |
| 5、流式细胞仪EDU法细胞增殖检测 |
| 6、蛋白质印迹法(Western Blot,WB) |
| 7、Rac1敲除细胞系构建 |
| 8、Trp53inp1 过表达细胞系构建 |
| 9、转录组测序 |
| 实验结果 |
| 一、抑制Rac1减轻小鼠放射性肺损伤 |
| 二、抑制/敲除Rac1可保护正常肺上皮细胞的放射性损伤 |
| (一)抑制Rac1减轻正常肺上皮细胞放射性损伤 |
| 1、抑制Rac1 对小鼠肺上皮细胞系MLE-12 的细胞活力无明显影响 |
| 2、抑制Rac1 减少MLE-12 细胞放射后凋亡 |
| (二)敲除Rac1 与药物抑制相似,可减轻MLE-12 细胞照射后损伤 |
| 1、Rac1 慢病毒干扰sh RNA载体构建与干扰效率筛选 |
| 2、敲除Rac1 可减少MLE-12 照射后细胞凋亡 |
| 3、敲除Rac1 可逆转照射引起的MLE-12 细胞周期阻滞 |
| 4、敲除Rac1 减轻MLE-12 细胞照射后DNA损伤 |
| (三)敲除Rac1相关差异基因筛选 |
| 1、敲除Rac1 与阴性对照组的有参转录组测序(RNA-seq) |
| 2、Rac1相关差异基因的筛选与验证 |
| (四)过表达Trp53inp1 可部分逆转敲除Rac1对MLE-12 的辐射保护作用 |
| 1、过表达Trp53inp1 可部分逆转敲除Rac1对MLE-12 照射后细胞凋亡的减少 |
| 2、Trp53inp1 过表达对MLE-12 细胞周期的影响 |
| 3、Trp53inp1 过表达对MLE-12 照射后DNA损伤的影响 |
| 三、抑制/敲除Rac1可增敏放射对小鼠肺癌细胞的损伤 |
| (一)抑制Rac1可增敏放射引起的小鼠肺癌细胞损伤 |
| 1、抑制Rac1促进小鼠肺癌细胞照射后凋亡 |
| 2、敲除Rac1 与给药相似,可增敏放射对LLC细胞的损伤效应 |
| (二)过表达Trp53inp1 对小鼠肺癌细胞的影响 |
| 1、过表达Trp53inp1 可协同敲除Rac1 的促凋亡效应,对小鼠肺癌细胞周期及增殖活力无明显影响 |
| 2、过表达Trp53inp1对LLC凋亡及周期相关蛋白的影响 |
| 四、抑制/敲除Rac1对正常肺上皮细胞与肺癌细胞差异作用的机制探讨 |
| (一)小鼠肺癌细胞Rac1过表达 |
| (二)小鼠肺癌细胞Rac1突变 |
| (三)肿瘤细胞Trp53inp1 表达量显着低于正常肺上皮细胞 |
| 五、在体验证抑制/敲除Rac1对肿瘤及正常肺组织的影响 |
| (一)敲除Rac1显着抑制裸鼠皮下荷瘤的肿瘤生长 |
| (二)敲除Rac1显着抑制小鼠肺部原位荷瘤的肿瘤质量 |
| (三)抑制Rac1可减轻未荷瘤对侧肺的放射性损伤 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 放射性肺损伤研究进展及与Rac1的关系 |
| 一、放射性肺损伤研究进展 |
| (一)简介 |
| (二)RILI的病理生理过程 |
| (三)RILI的病理生理机制 |
| (四)RILI的危险因素 |
| (五)RILI的临床诊断 |
| (六)RILI的干预手段与防治措施 |
| 二、Rac1用于防治放射性损伤的前景 |
| (一)Rac1可能参与放射性损伤的主要发病机制 |
| (二)Rac1参与肿瘤形成、进展及治疗抗性 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（6）基于网络药理学研究血府逐瘀汤治疗肺癌的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.肺癌的发病机制 |
| 2.中西医治疗肺癌的现状 |
| 3.中医治疗肺癌 |
| 4.血府逐瘀汤的研究和应用 |
| 第二章 资料与方法 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 中西医结合治疗肺癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 急性淋巴细胞白血病 |
| 1.1.2 慢性淋巴细胞白血病 |
| 1.1.3 急性髓细胞性白血病 |
| 1.1.4 慢性粒细胞白血病 |
| 1.1.5 AML和 CML中的白血病干细胞 |
| 1.2 免疫细胞概述 |
| 1.2.1 T淋巴细胞概述 |
| 1.2.2 B淋巴细胞概述 |
| 1.2.3 自然杀伤细胞概述 |
| 1.2.4 NKT细胞概述 |
| 1.2.5 树突状细胞概述 |
| 1.3 中药与免疫概述 |
| 1.4 补肾回阳方的介绍 |
| 1.5 肾虚型小鼠模型概述 |
| 1.6 新型小分子介绍 |
| 1.7 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.1.3 试剂和化学药品 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 相关实验试剂的配制 |
| 2.1.5.1 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制 |
| 2.1.5.2 ACK裂红液的配制 |
| 2.1.5.3 补肾回阳方的熬制与药液浓缩 |
| 2.1.5.4 细胞因子的配制与储存 |
| 2.1.5.5 其他化学试剂的配制 |
| 2.1.6 中药标准品配制 |
| 2.1.7 细胞完全培养基的配制 |
| 2.2 实验技术路线 |
| 2.3 动物实验 |
| 2.3.1 小鼠肾阳虚模型的建立 |
| 2.3.2 小鼠体征变化的记录 |
| 2.3.3 小鼠外周血的采集 |
| 2.3.4 小鼠外周血血常规的测定 |
| 2.3.5 外周血T淋巴细胞亚群的流式检测 |
| 2.3.6 补肾回阳方给药 |
| 2.3.7 补肾回阳方治疗后样本的采集与检测 |
| 2.3.7.1 摘眼球采血 |
| 2.3.7.2 血细胞分析 |
| 2.3.7.3 外周血T淋巴细胞亚群的检测 |
| 2.3.7.4 心脏采血 |
| 2.3.7.5 脾细胞和骨髓细胞的制备 |
| 2.3.7.6 脾细胞和骨髓细胞的T淋巴细胞亚群检测 |
| 2.3.8 DC细胞的体外诱导培养 |
| 2.3.8.1 分离外周血单核细胞 |
| 2.3.8.2 体外细胞因子诱导培养DC |
| 2.3.8.3 DC细胞的流式鉴定 |
| 2.4 补肾回阳方物质分析 |
| 2.4.1 高效液相色谱条件 |
| 2.4.2 质谱条件 |
| 2.5 新型小分子抗白细胞细胞的筛选 |
| 2.5.1 白血病细胞细胞系复苏 |
| 2.5.2 小分子的作用浓度 |
| 2.6 数据统计方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 肾阳虚模型小鼠的鉴定 |
| 3.1.1 造模后小鼠形态的变化 |
| 3.1.2 外周血血常规的变化 |
| 3.1.3 外周血T淋巴细胞亚群的检测 |
| 3.1.4 结论 |
| 3.2 补肾回阳方对肾阳虚小鼠模型的影响 |
| 3.2.1 补肾回阳方灌胃后小鼠体重的变化 |
| 3.2.2 补肾回阳方对小鼠外周血血象的影响 |
| 3.2.3 补肾回阳方对小鼠CD3~+细胞占比的影响 |
| 3.2.4 补肾回阳方对肾阳虚小鼠CD3-NK1.1~+细胞占比的影响 |
| 3.2.5 补肾回阳方对小鼠CD3+NK1.1+细胞占比的影响 |
| 3.2.6 补肾回阳方治疗后DC细胞的数量变化 |
| 3.2.7 结论 |
| 3.3 补肾回阳方的高效液相色谱实验结果 |
| 3.3.1 补肾回阳方高效液相色谱分析 |
| 3.3.2 补肾回阳方与标准品的高效液相色谱图对比。 |
| 3.4 补肾回阳方液质色谱联用仪分析 |
| 3.4.1 淫羊藿成分分析 |
| 3.4.2 炙甘草成分分析 |
| 3.4.3 干姜成分分析 |
| 3.4.4 肉桂成分分析 |
| 3.4.5 结论 |
| 3.5 抗白血病细胞小分子的筛选 |
| 3.5.1 小分子对32D细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.2 小分子对KG-1细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.3 小分子对THP-1细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.4 小分子对Jurkat细胞48 小时抑制率检测。 |
| 3.5.5 结论 |
| 第四章 讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 硕士研究生期间发表的论文 |
（8）选择性COX-2抑制剂联合EGFR-TKI对肺癌细胞增殖、免疫的影响及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 COX-2抑制剂联合EGFR-TKI对肺癌细胞增殖、免疫的影响及研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）斑蝥素对肺腺癌A-549细胞的放射敏感性影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与仪器设备 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 斑蝥素及其衍生物对非小细胞肺癌治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）回生口服液经PD-1/PD-L1通路调控肺癌免疫逃逸的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 回生口服液抑制Lewis肺癌小鼠肺癌细胞增殖有效性检测 |
| 1 实验材料 |
| 2 细胞复苏、动物分组、造模、给药 |
| 3 指标检测 |
| 4 统计学分析 |
| 5 实验结果 |
| 6 小结 |
| 第二部分 回生口服液影响免疫逃逸关键靶点PD-1、PD-L1蛋白表达的影响研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 细胞复苏、动物分组、造模、给药 |
| 3 指标检测 |
| 4 统计学分析 |
| 5 实验结果 |
| 6 小结 |
| 第三部分 回生口服液对CD4+T、CD8+T、CD4+CD25+CD127low/-Tregs水平的影响研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 细胞复苏、动物分组、造模、给药 |
| 3 指标检测 |
| 4 统计学分析 |
| 5 实验结果 |
| 6 小结 |
| 讨论 |
| 1 现代医学对肺癌的认识 |
| 2 中医学对肺癌认识 |
| 3 回生口服液治疗肺癌研究进展 |
| 4 PD-1/PD-L1信号通路激活导致肺癌免疫逃逸 |
| 5 回生口服液可能经PD-1/PD-L1信号通路抑制肺癌免疫逃逸 |
| 6 实验结果讨论 |
| 结论 |
| 特色与创新 |
| 问题及展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件1:综述 PD-1/PD-L1信号通路在肺癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件2:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
四、白介素6与化疗药物对人肺癌细胞生长影响的研究（论文参考文献）
- [1]七鳃鳗LIP蛋白对人肺癌细胞识别和杀伤作用机制的研究[D]. 宋晓萍. 辽宁师范大学, 2021(09)
- [2]糖代谢基因在肺腺癌组织中的表达及沙参麦冬汤干预的实验研究[D]. 刘亚琪. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [3]蛋氨酸脑啡肽（MENK）对肺癌生物学行为的调控及其作用机制的研究[D]. 张树玲. 中国医科大学, 2021
- [4]脐带间充质干细胞及其外泌体对肿瘤细胞表型的影响[D]. 薛松磊. 扬州大学, 2021(04)
- [5]抑制Rac1减轻小鼠放射性肺损伤并增敏肺癌放疗的作用与机制[D]. 安妮. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [6]基于网络药理学研究血府逐瘀汤治疗肺癌的作用机制[D]. 徐旭. 广西中医药大学, 2020(02)
- [7]补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选[D]. 李增政. 昆明理工大学, 2020(05)
- [8]选择性COX-2抑制剂联合EGFR-TKI对肺癌细胞增殖、免疫的影响及其机制的研究[D]. 吴晓峰. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [9]斑蝥素对肺腺癌A-549细胞的放射敏感性影响的研究[D]. 张慧. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [10]回生口服液经PD-1/PD-L1通路调控肺癌免疫逃逸的机制研究[D]. 梁任隆. 成都中医药大学, 2020(02)