一、猪伪狂犬病病毒潜伏感染检测方法研究进展（论文文献综述）
顾阳[1]（2020）在《PRV强毒株的分离及其gB、gD基因的遗传进化分析》文中研究指明猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）又称为奥耶斯基病（Aujeszky’s disease,AD）,是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种烈性传染病,育肥期猪呈现体温升高、呼吸道感染症状;哺乳期幼仔感染后通常具有较高致死率;怀孕母猪表现繁殖障碍、流产、死胎、木乃伊胎等。PRV宿主广泛,但猪是已知的唯一自然宿主,也是引起其他动物感染的重要排毒者和疫源,给整个养猪业带来巨大损失。近年来,我国很多地区经过经典疫苗株免疫接种的猪场再次出现猪伪狂犬病疫情,经初步研究发现其为PRV变异毒株感染导致,并且病料样本g E阳性率较高。我国之前大部分猪场使用的是敲除g E基因的Bartha-K61等疫苗,这表明传统的经典疫苗已不能对当前PRV感染提供有效保护,因而找出当前流行毒株的变异程度及野毒的感染情况是当务之急。由于常规的血清学检测方法无法区分疫苗免疫接种动物和野毒感染动物,已知g E基因是野毒感染的标志基因;g H基因是PRV内高度保守和病毒复制所必须的基因,因此根据Gen Bank中猪伪狂犬病毒（PRV）g H、g E基因序列,设计合成2对特异性引物,通过对退火温度等条件进行优化,建立了鉴别PRV强毒与疫苗弱毒的双重PCR方法。特异性分析表明,从强毒株基因组中扩增出2条大小为429bp和355bp的特异性片段,从弱毒株基因组中仅扩增出1条大小为355bp的特异性片段,而扩增猪圆环病毒2型和猪细小病毒基因组结果均为阴性。敏感性分析表明所建立的鉴别PRV强毒与疫苗弱毒的双重PCR方法的最低有效检测量为1×102 TCID50/0.1ml。对采自河南省郑州、许昌、濮阳、焦作、洛阳等地市以及山西省文水、河北邯郸的348份PRV疑似病料组织样品进行双重PCR检测,检测病原只需3 h～4 h。该方法具有较高的特异性、敏感性及可重复性,能够区分基因缺失疫苗接种与野毒感染,为PRV野毒的筛查以及PRV的快速检测提供技术支持。从河南、山西和河北收集的5份疑似PRV病料组织匀浆液,经无菌处理后接种于ST细胞,提取每一代收获的细胞病毒液DNA,PCR扩增、电泳,结果均为阳性。将培养至第7代的细胞病毒液接种于6周龄小鼠,攻毒48 h后小鼠开始出现死亡,62 h时全部死亡,而对照组小鼠168 h后仍无发病和死亡现象。表明所获得的5株分离株为PRV强毒株,将其命名为XC、SX-1、SX-2、HD1和HD2。以XC株为例,进行理化特性试验,结果表明其具有PRV理化特性。XC株在ST细胞上的一步生长曲线结果显示,感染ST细胞后第4-12 h时XC株病毒效价逐渐增长,第36 h达到最高峰(TCID50/m L为10 7.49),之后病毒效价开始降低。这与PRV在ST细胞上的生长动力规律相吻合。本试验成功分离5株PRV野毒株,为PRV的分离鉴定及控制猪伪狂犬病的流行提供了理论依据。参照Gen Bank中发表的g B和g D基因序列,使用引物设计软件设计2对引物,对实验室分离的5个PRV流行株（XC、SX-1、SX-2、HD1和HD2）的g B和g D基因进行PCR扩增、克隆、测序及其核苷酸与氨基酸序列分析。结果显示,分离出来的5株流行株虽然来自不同地区,但核苷酸和氨基酸的同源性均较高,对比国内早些年流行株Ea、Fa、SC等,本试验的5个分离毒株g B基因的氨基酸序列,共出现5处共同突变,此5处位点都与国内近年流行毒株的氨基酸保持一致;国内与国外毒株比对发现20多处突变。推导g D基因氨基酸序列发现,相对于国内早年流行株,在278位处国外毒株（除Becker和NIA3外）和国内近些年流行变异株出现了氨基酸位点缺失;相对于国外毒株（除Becker和NIA3外）,包括5个分离毒株在内的国内毒株共发生了8处位点共同突变。研究结果表明5个分离毒株与国外流行毒株由于地理隔离的存在差异较大,不同地区PRV毒株的感染和流行情况并不相同;5个分离毒株与2011年之前国内流行毒株亲缘关系较远,表明2011年以来我国PRV流行毒株发生了变异,可以推断出我国在2011年之后可能是由于出现了PRV变异毒株而导致不同地区PR疫情的发生;遗传进化树结果表明,这些分离的毒株与之前的经典毒株如Bartha-K61等亲缘关系较远,这也解释了为何我国近年各地已经免疫的猪场还是有PRV感染发生。
廖少山[2]（2020）在《PRV激活三叉神经节细胞NF-κB信号通路的探究》文中认为伪狂犬病（Pseudorabies,PR,又名Aujeszky’s disease,AD）,是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病,该病是危害养猪业的主要传染病之一,每年造成巨大的经济损失。伪狂犬病病毒（PRV）属于疱疹病毒科中的α疱疹病毒亚科,在PRV的潜伏感染期,动物体内检测不到病毒粒子,也不向外排毒,但在相应应激因素的刺激下,潜伏感染的PRV可被激活,可重新产生感染性病毒粒子,导致动物发病,并向外排毒。关于PRV潜伏感染的建立、维持及激活机制尚不明确,控制和根除伪狂犬病所面临的主要障碍是PRV的潜伏感染问题。现有报道显示,猪体外接种PRV可导致神经节细胞的激活,猪神经节细胞的活化主要表现为形态的变化、炎症因子的分泌以及细胞的增殖,而NF-кB信号通路是病原感染引起神经节细胞分泌炎症因子的关键信号通路,病毒激活NF-κB信号通路,NF-κB信号通路的活化会启动很多炎症因子的表达,继而激活宿主的免疫系统;细胞因子方面,病毒感染免疫细胞后造成细胞死亡,导致很多细胞因子的释放,如IL-1、IL-6和IL-8以及TNF-α、INF-α和INF-β。PRV通过何种信号通路激活TG细胞,其分子机制仍不清楚。为了进一步帮助更好地解决上述问题,本研究开展了PRV激活小鼠三叉神经节细胞（TG）NF-кB信号通路的探究,其相关研究内容如下:1、PRV感染小鼠三叉神经节细胞的研究本研究采用胰蛋白酶、DNA酶、胰蛋白酶和胶原蛋白酶的组合消化成年小鼠三叉神经节制备TG细胞,培养1～3 d贴壁,5～6 d生长成熟,TG细胞尼氏染色为蓝色,第7～8 d开始衰老死亡,11～12 d全部死亡。通过分离培养观察鉴定,小鼠TG细胞的正常形态是个体较大,边缘有许多的类似神经元细胞突触的结构,但突触的形状、大小各有不同,细胞边缘成不规则的齿轮状,细胞核一般在细胞的中心位置,TG细胞衰老的过程是呈现出细胞先出现周边逐渐变亮、变小,核的颜色变深,最后是突触断裂、消失和细胞变圆变亮而死亡。研究结果表明:采用该培养方式能够成功分离培养出小鼠TG细胞,而且生长良好,形态稳定,但不能消化传代和冻存,只能原代培养。用PRV感染TG细胞,观察发现TG细胞被PRV感染后期均能出现相应的细胞病变效应（CPE）,研究发现:在接毒PRV 48 h后开始出现CPE,72 h内细胞开始死亡,与对照组的正常TG细胞相比较,接毒组死亡时间提前2～3 d,而对照组Vero细胞接毒后24 h后就出现CPE现象,48 h内细胞几乎全部死亡,而TG细胞出现CPE和死亡的现象要晚约36 h,而且病变时间较长,这个可能与TG细胞的自我潜伏、复制保护机制有关,与实验预期结果相符。病变开始是TG细胞的突出结构断裂、消失,细胞体积缩小,细胞核变大、核颜色变深、位置边移,细胞的轮形逐渐变圆,随后出现细胞周边变亮和逐步死亡的现象。采用细胞间接免疫荧光技术研究发现:使用两种荧光观察同一个位置,然后两个荧光图片合并,两种荧光所显示的位置相同,分别在第24 h和第48 h都检测到了相应的荧光,在接毒后第48 h比第24 h的荧光明亮更明显,说明PRV感染TG细胞后,PRV能迅速进入TG细胞,而且能在TG细胞内快速复制增殖。进一步通过检测TG细胞培养液中5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）的含量来检测PRV对TG细胞生长的影响,研究发现:对照组中的BrdU含量在生长期间持续升高,达到峰值7.85 pg/m L后逐渐下降,BrdU含量达到峰值的时间是156 h,是TG细胞培养第6～7d的样子,与TG细胞成熟时期相符合。而接种PRV病毒液的实验组的BrdU含量在接毒120 h时立刻下降,而且下降幅度大,接毒PRV后的第12 h,实验组检测值从6.67 pg/mL突然下降到2.81 pg/mL,说明此时的TG细胞分裂速度迅速减慢,甚至有可能是停止分裂,当到达144 h时,BrdU含量降到最低,同时又开始迅速增加,原因可能是TG细胞接毒后期,TG细胞受到PRV的破坏,TG细胞通透性增加或破裂,BrdU陆续释放到细胞外而导致BrdU在感染PRV的后期又有升高的现象。对照组的后期（第8～11 d细胞死亡时）也检测到含量BrdU有反弹上升的现象。2、PRV对三叉神经节细胞NF-кB通路影响的研究将小鼠TG细胞培养至第5 d后接PRV,并设空白对照组,分别在接毒感染后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取样,用IL-Valukine TMM ELISA方法检测IL-1和IL-6的含量变化,IL-1和IL-6都是NF-κB信号通路激活的下游因子,特别IL-1是该通路的标志性炎症因子,通过测量IL-1的含量来推知NF-κB信号通路激活情况。实验结果表明,在接毒36 h时,IL-1的含量开始明显升高,在感染60 h时IL-1的含量达到峰值10.55 pg/mL,实验组IL-6的含量在24 h就达到了峰值165.109 pg/mL,而且对照组中的IL-1和IL-6含量基本没有变化,同时也设计Vero细胞接毒实验进行比较,Vero细胞接毒后24 h IL-1的含量达到峰值9.161 pg/mL,说明TG细胞感染PRV以后产生的IL-1的反应较慢,大约晚36 h,可能是与PRV病毒在神经元细胞的潜伏机制有关,IL-1是细胞炎症因子,IL-1含量达到峰值的时间与细胞开始大量凋亡时间相吻合。实验证明PRV能在感染后期激活TG细胞的NF-κB信号通路,并能通过激活该通路来调节细胞的凋亡。通过合成MyD88和TRIF的siRNA,再利用脂质转染法分别把siRNA转染到培养好的小鼠TG细胞内,分别沉默MyD88和TRIF基因,同时设计空转染组进行对照,转染后24～36 h开始接毒PRV,接毒后第3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取样,直至接毒细胞大部分细胞死亡,取完后用IL-1 ValukineTMELISA方法检测IL-1的含量变化,以峰值为参考比较沉默效果,MyD88基因沉默效果分别为21.67%、18.60%和39.52%,TRIF基因沉默效果分别是9.55%和5.86%。进一步进行MyD88基因和TRIF基因同时沉默实验,双沉默效果为27.12%和33.08%。实验结果显示:MyD88基因沉默效果要比TRIF基因的沉默效果好,平均沉默效果高出18.89%,说明MyD88是NF-кB通路激活的途径,NF-кB通路激活是通过MyD88活化途径来激活的。3、PRV对细胞NF-кB通路影响研究的体内验证选择成年小鼠12只,实验组与对照组分别6只,实验组小鼠一次性脑内接活PRV病毒液10μL,同时对照组脑内注射PRV神经元细胞培养液10μL,脑组织接毒后第24h和48 h分别取3只小鼠脑组织,测量脑组织中IL-1的含量变化,实验结果显示:对照组小鼠脑组织的IL-1含量变化不大,实验组中小鼠脑组织的IL-1含量明显升高。按照上述方法取样进行荧光定量PCR检测实验,每个样品分别做3个复孔,根据公式2一△△ct计算每个样本mRNA的相对表达量,以0 h的结果为参照,对照组24 h转录上调2.35倍,对照组48 h上调4.78倍,接毒组24 h及48 h分别上调了5.82倍和11.61倍,接毒组的p65转录因子含量明显升高,说明PRV感染TG细胞后对p65转录因子的产生起到了直接作用。按照上述方法取样进行Western Blot实验,待测样品上样量均为10μL,总蛋白上样量在20～50μg/孔,通过WB实验得到化学发光图,再利用photoshop软件读出各个印迹的平均灰度值,根据内参蛋白和p65表达蛋白之间的灰度值比例关系计算出p65表达蛋白的相对含量,接活PRV组24 h、48 h时,p65蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的比值明显低于对照组和接毒前组的值,比值分别是接毒0 h为1.386、对照组24 h为1.381、对照组48 h为1.379、实验组24 h为1.277、实验组48 h为1.141,接毒组的曲线斜率明显变化,可以说明接毒组中的NF-κB p65蛋白表达量明显升高。小鼠体内验证实验结果与体外实验一致,更进一步验证了本研究结果的可靠性。综上所述,PRV感染TG细胞后,能够迅速进入TG细胞内增殖,并能够使TG细胞产生相应的CPE,同时对TG细胞的生长有很强的抑制作用,该研究进步一证实了该TG细胞的病变与PRV感染有直接的关系。PRV能在感染TG细胞后期激活NF-κB信号通路,而且NF-кB通路激活途径是通过MyD88途径而实现的,该研究不仅可以为深入阐明PRV致病与免疫机理奠定基础,为进一步揭示猪伪狂犬病病毒潜伏感染及其致病机理提供了新的线索,也可为其它疱疹病毒类似科学问题的揭示提供借鉴。
张晓阳[3]（2020）在《山东规模猪场伪狂犬病野毒感染状况调查及阳性猪场的安全生产措施》文中研究表明伪狂犬病（Pseudorabies,PR）又称奥耶斯基氏病（Aujeszky’s Disease,AD）,是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）感染引起猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的烈性传染病,是严重危害全球养猪业的重要疫病。虽然我国一直致力于伪狂犬病的净化,但是在非洲猪瘟存在的大背景下,猪价暴涨,国内规模化猪场都舍不得淘汰野毒感染母猪,并且许多猪场将三元商品猪转为母猪饲养,这大大增加了PRV gE抗体的阳性占比数量。为了探究通过优化免疫程序和严格的生物安全措施阻断PRV传播商品猪,实现PRV野毒阳性种猪场商品猪的安全生产。首先对山东省部分规模化猪场PRV感染状态,自山东不同地区规模化猪场各阶段猪群采集了血清5038份,跟踪了2018年山东省各地区规模化猪场不同猪群的PRV gE抗体。检测结果显示gE抗体阳性数量为2267份,总体阳性率45.00%;其中6胎次以上母猪gE抗体阳性率最高,为70.09%;其次为3-4胎次母猪,阳性率为59.14%;阳性率最低的是16周龄育肥猪,阳性率为18.99%。表明山东省各地区规模猪场普遍存在PRV野毒感染,PRV感染压力较大。本研究选择母猪PRVgE抗体全为阳性、公猪PRVgE抗体全为阴性的某二元母猪场作为试验场,通过对试验场疑似病例剖检及组织病理学观察可见PR典型病例的病变,通过病毒分离得到一株PRV病毒,命名为“SD-H”;通过gE基因测序,与参考序列同源性分析表明SD-H株与欧美毒株核苷酸及氨基酸同源性较小,与国内毒株核苷酸及氨基酸同源性较高;通过建立遗传进化树发现SD-H株为变异毒株。该场生产母猪群gE抗体阳性率为100%,通过对日常流产猪的检测发现,存在4.5%异常母猪排毒的情况,占大群比例的0.05%;而通过对哺乳仔猪睾丸液检测发现大约有4.16%的窝次存在PRV垂直传播的情况,和试验批次脐带血的带毒情况检测基本一致,将抗原阳性的母猪和初生仔猪剔除猪群单独隔离饲养。采取两点式生产方式,对生产母猪、公猪、哺乳仔猪及保育育肥猪全阶段实施合理的疫苗免疫和生物安全措施。通过隔离抗原阳性猪、调整优化免疫程序和严格的生物安全措施,尽管PRVgE抗体阳性母猪群生产的商品仔猪因母源抗体的缘故前期PRVgE抗体全为阳性。但从30日龄至160日龄PRVgE抗体逐渐转为阴性,可以免于商品猪的PRV野毒感染。这说明,优化免疫程序和严格的生物安全措施可以阻断商品猪感染PRV,使本批商品猪最终以阴性状态出栏。
朱贵阳[4]（2020）在《信阳市规模化种猪场伪狂犬病控制与净化关键技术研究与应用》文中研究表明伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的一种急性传染病,以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状,可感染多种家畜。伪狂犬病病毒为双链DNA病毒,属于疱疹病毒科α亚科（Herpesviridae,subfamily Alphaherpesvirinae）,水痘病毒属（Varicellovirus）。猪是PRV的原发感染宿主,PRV能在感染耐过猪体内建立终身潜伏感染,潜伏感染猪是伪狂犬病的潜在传染源,因此,阻止PRV建立潜伏感染和清除潜伏感染的带毒猪对净化PR至关重要。近年来,母猪伪狂犬病野毒感染阳性率比较高,为了防止仔猪感染而带毒转阳,本研究拟从紧急接种效果,仔猪伪狂犬病母源抗体消长规律和仔猪野毒感染时间节点等方面综合考虑,确定首免时间,优化免疫程序,从而培育出阴性后备猪,为实现伪狂犬病控制与净化奠定基础。试验一PR诊断与临床紧急接种效果研究为了研究伪狂犬病疫苗紧急接种免疫效果,选择疑似伪狂犬病的病例采集病料做PCR检测、测序、PRVg E基因的遗传进化分析和家兔感染试验。对采集的血液样本做PRVg E抗体阻断ELISA试验。PCR检测、抗体检测和家兔感染试验结果显示,各阶段发病猪只均为PRVg E野毒感染。毒株序列分析结果显示,分离株与国内毒株HN1201、QYY和JS-2012等毒株在同一分支,亲缘关系较近,与国外毒株Becker、Kaplan和Kolchis等在两个不同的分支,亲缘关系较远。将受PRV威胁健康猪只紧急接种PR活疫苗后,没有新病例再出现。结果表明,受PRV威胁的健康猪群紧急接种伪狂犬疫苗可有效阻止PRVg E野毒感染和扩散。试验二PR免疫程序优化研究为了优化种猪场免疫程序,对母猪临产时采血及所产仔猪在7、14、21、28、32、45、60、80和120d时采血,试验场仔猪做了滴鼻免疫效果对比试验。测定中和抗体效价、PRVg B和PRVg E抗体,以研究母猪接种猪伪狂犬病疫苗（SA215株）后所产仔猪母源抗体消长规律和仔猪PRVg E野毒感染时间节点。结果显示,母猪抗体水平均较高,中和抗体平均滴度为8log2,全部仔猪均获得高水平的母源抗体,随着日龄增长抗体水平呈下降趋势,21d母源抗体滴度为4.67log2,28d为5log2,32d为3.33log2（<4log2）,45d为3.67log2（<4log2）。仔猪PRVg B抗体阳性率在7d、14d、21d、28d和32d均为100%,以后随着日龄增长PRVg B抗体阳性率水平呈下降趋势,45d为67%,60d为33%。仔猪0d滴鼻免疫效果优于不滴鼻免疫,后备猪的PRV野毒感染率会下降,抗PRV感染能力提高。综合考虑仔猪PRV母源中和抗体消长规律和仔猪野毒感染时间节点与转阳率,确定仔猪接种猪伪狂犬病活疫苗免疫程序为:滴鼻免疫日龄0d,剂量1头份,首次肌注免疫日龄21d,剂量1头份,二次肌注免疫日龄60d,剂量1头份。试验三规模化种猪场伪狂犬病控制与净化关键技术的应用为了进一步验证规模化种猪场伪狂犬病控制与净化关键技术的应用效果,选择五个不同种猪场进行验证和推广。通过规模化种猪场伪狂犬病控制与净化关键技术的集成应用,解决了PRV引起种猪群的呼吸道疾病,控制了PRV感染后引起公猪群、后备母猪群和经产母猪群的繁殖障碍性疾病,降低了PRVg E野毒感染率,阻止了后备猪群PRVg E野毒感染转阳,进而通过淘汰阳性经产母猪,补充阴性后备猪,从而达到控制与净化伪狂犬病的目的,PR的控制与净化效果显着。
丁国杰[5]（2020）在《猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失疫苗候选毒株的构建及其免疫原性分析》文中认为伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的传染病。猪是PRV重要的原发宿主,各种年龄猪均可感染发病。自2011年以来,PRV流行毒株的毒力明显增强,疾病流行范围扩大,经典疫苗毒株接种后免疫保护效果不够理想,猪只发病后的死亡率显着提高,给我国养猪业造成了巨大经济损失。因此,摸清现地流行毒株特性,寻求免疫原性好的疫苗候选毒株对科学防治本病具有重要意义。本研究采集黑龙江五常、黑河、大庆、绥化等部分地区经伪狂犬病疫苗免疫后疑似猪伪狂犬病发病猪的病料,对其进行病毒分离和鉴定。取病死仔猪脑组织经细胞分离培养、电镜形态学鉴定、免疫荧光分析、PCR鉴定和核酸序列测定,共分离到4株PRV毒株,分别命名为PRV-WC01、PRV-HH01、PRV-DQ01和PRV-SH01。对分离毒株的g C、gE基因序列进行了遗传变异分析,结果显示所分离获得的4株PRV与近几年报道的PRV流行毒株同源性较高,处于同一个分支中,而与经典株PRV同源性较低,处于不同的分支中;毒力实验测定结果显示,PRV-WC01株对56日龄仔猪的LD50为10-3.17/mL;将病毒含量为108.50TCID50/mL的PRV-WC01株病毒液经0.1%甲醛灭活,加入MONTANIDETM ISA201 VG佐剂制备免疫原,接种21日龄仔猪。经过2次免疫,在2免后21d用PRV WC01株以10×LD50/头的剂量进行攻毒。免疫保护率为100%,表明该毒株作为免疫原,具有较好的免疫原性,对流行毒株具有完全的免疫保护作用。以PRV-WC01为亲本毒株,根据PRV Bartha-K61株的基因缺失位点,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建了PRV gI和gE双基因缺失突变体。通过病毒蚀斑计数和荧光定量PCR针对PRV各基因的sg RNA编辑效率筛选,以获得高效基因编辑的sg RNA。针对PRV基因组中的gE基因和gI基因,分别设计了多个sg RNA,通过病毒蚀斑计数方法,筛选出了针对gE基因和gI基因编辑的sg RNA。为了提高Cas9基因在细胞中表达量以获得更高的基因敲除效率,通过慢病毒系统构建了稳定敲除PRV gE和gI双基因的Vero细胞株。首先通过酶切连接和同源重组,获得了慢病毒转移质粒Lenti CRISPR V2-sg RNA gE/gI。将质粒转染Vero细胞,以PRV-WC01感染转染细胞,经18h收集病毒液,提取病毒核酸,测序鉴定已构建质粒的基因编辑功能。随后通过慢病毒三质粒系统共转染293T细胞包装慢病毒,三质粒包括转移质粒Lenti CRISPR V2-sg RNA gE/gI,包装质粒p MD2.G以及表达Gagpol蛋白的辅助质粒ps PAX2。完成包装的慢病毒采用PEG慢病毒纯化试剂进行纯化浓缩,然后感染Vero细胞,用嘌呤霉素加压筛选获得稳定敲除gE和gI基因的细胞系。通过PCR扩增和Western blot验证获得的细胞系基因组中整合了CRISPR/Cas9系统并能正常表达Cas9蛋白,构建获得了包含gE和gI的两个高效sg RNA以及表达Cas9蛋白的Vero细胞系gE/gI-Cas9-Vero。利用该细胞系通过病毒传代的方式实现了病毒基因的缺失编辑,该方法与传统的瞬时转染质粒进行病毒基因编辑相比较,基因编辑效率可提高13%,经过传代培养,基因编辑的病毒占总病毒的80%左右。将编辑的病毒在Vero细胞上进行蚀斑克隆,通过PCR鉴定挑选未扩增出特异性条带的蚀斑克隆病毒为缺失病毒,从缺失病毒中选取1株进行多轮蚀斑纯化,经过基因测序和蛋白水平的检测,获得了1株缺失gE和gI的PRV,该毒株命名为PRV-WC01 Del-gE/gI。对获得的PRV-WC01 Del-gE/gI进行了生长特性分析,结果显示该病毒在Vero细胞上的早期生长较亲本毒株PRV-WC01略低,PRV-WC01 Del-gE/gI和PRV-Bartha-K61株在蚀斑形态和大小上没有明显差异,略小于PRV-WC01亲本毒株;小鼠致病性实验显示,PRV-WC01Del-gE/gI与亲本株相比,虽然延缓了小鼠的死亡时间,但仍可致小鼠死亡。将PRV-WC01 Del-gE/gI株的细胞培养滴度为108.00TCID50/mL病毒液经0.1%甲醛灭活,加入MONTANIDETM ISA201 VG佐剂制备免疫原,接种21日龄仔猪。经过2次免疫,在2免后21d用WC01株以10×LD50/头的剂量进行攻毒,同时设置Bartha-K61活疫苗免疫攻毒组。结果表明,灭活的PRV-WC01 Del-gE/gI抗原和Bartha-K61活疫苗均能够诱导产生特异性抗体和中和抗体。WC01 Del-gE/gI免疫原组比Bartha-K61活疫苗组产生针对PRV-WC01株的中和抗体高16倍,PRV-WC01株强毒攻击免疫猪后,Bartha-K61组猪只表现为持续高温,甚至出现惊厥和共济失调。并且1头猪死亡。WC01 Del-gE/gI组猪只除了一过性体温升高外,无其他临床症状,对PRV-WC01强毒攻击产生100%临床保护。感染14 d剖杀剩余存活的实验猪,对组织病毒载量以及器官病理变化进行了检测。结果均表明,与Bartha-K61免疫组相比,灭活的PRV-WC01 Del-gE/gI抗原免疫组各组织病毒基因组拷贝数较Bartha-K61免疫组低103-104。剖检后观察各组织器官没有眼观的病理病变。以上结果进一步证明灭活的PRV-WC01Del-gE/gI株免疫原与Bartha-K61传统疫苗相比,能对现地流行毒株提供更好的免疫保护作用。综上,本研究在免疫猪群中分离到PRV流行毒株WC01株,利用慢病毒包装系统构建了包含gE和gI基因的sg RNA以及Cas9蛋白的稳定表达细胞系gE/gI-Cas9-Vero,通过在gE/gI-Cas9-Vero上接种PRV-WC01株病毒,并经多次细胞克隆纯化筛选获得了双基因缺失株PRV-WC01 Del-gE/gI;对该毒株的生长特性、毒力特性以及免疫原性进行了测定,为该毒株作为潜在的灭活疫苗候选毒株提供了理论依据和物质基础。
李岩[6]（2020）在《猪伪狂犬病病毒流行株的分离鉴定及免疫原性分析》文中认为伪狂犬病（Pseudorabies,PR,又名Aujeszky’s disease）是一种大多数哺乳动物（包括众多的家畜和野生动物）以及一些禽类的急性、烈性、高度接触性的传染病,是一种能感染神经系统的疾病,感染后几乎所有的动物会出现发热、瘙痒、脑脊髓炎等症状以及死亡。猪是该病的自然宿主,也是感染后唯一可存活的宿主。猪伪狂犬病是影响全球猪养殖业的主要的传染病之一,给世界各国的猪养殖业造成的经济损失十分巨大。因此,世界各国对此病十分重视,并开启和实施了根除伪狂犬病的计划,取得了阶段性的胜利,如美国、德国、瑞典、丹麦、英国等国家,实现了家养猪群中伪狂犬病的净化。自2011年起,猪伪狂犬病出现新的变异株,该病在全球,尤其是我国,引起新一轮的暴发,此后,有着不少的PRV变异毒株被分离和鉴定。黑龙江省是一个养猪大省,部分地区也存在猪伪狂犬病的流行,在黑龙江省进行伪狂犬病毒的分离,有助于了解病毒的流行情况,研发以流行毒株制备的疫苗,为疫病的防控提供帮助。本研究从黑龙江哈尔滨市周边已经进行伪狂犬疫苗普免的养猪场中采集疑似猪伪狂犬病流产仔猪的颌下淋巴结、脾脏等组织,经PCR鉴定为存在伪狂犬病毒的感染。然后将病料接种Vero细胞进行病毒的分离,并采用PCR鉴定、血清中和试验、直接免疫荧光法测定以及负染电镜的观察进行分离病毒的鉴定,并对分离毒株的致病性、生长特性等做了进一步的研究;对分离株的g E基因进行了克隆、测序以及序列分析,通过g E基因来了解分离株的分子特点;还对分离株的免疫原性和抗原差异性进行了分析,以及对分离株制备的灭活疫苗进行了初步的应用。研究结果表明病料接种细胞后,出现典型的伪狂犬病毒细胞病变,如圆缩、拉网、细胞融合等细胞病变,PCR鉴定结果为PRV阳性、病毒能被伪狂犬病毒阳性血清所中和、病毒接种的细胞直接荧光反应有阳性信号以及电镜观察,均证明分离的病毒为PRV,并将此分离株命名为Hrb-2018株;该分离株接种家兔、小鼠以及断奶仔猪后,感染动物全部死亡,并均表现出典型的伪狂犬病临床症状,表明该分离株有较强的致病力;病毒的一步生长曲线表明,分离株的最高病毒含量要高于经典株,病毒含量达到峰值的时间也较经典株的时间短,表明分离株具有更强的细胞适应能力。所扩增的g E基因ORF全长1737bp,编码578个氨基酸,与参考毒株的核苷酸同源率在98.3%～99.7%,氨基酸同源率在97.7%～99.3%。构建的遗传进化树表明,分离株与国内2011年之后分离的毒株在一个小的进化分支上,亲缘关系最近;与国内较为经典的分离株如EA株等处于一个较大的进化分支内,其亲缘关系较近;同属于基因II型。与国外的分离株,如Becker株,则处于两个不同的大的进化分支上,亲缘关系较远,表明所分离株确为变异株。进一步对g E基因推到的氨基酸进行分析,分离株在第48位、492位各插入1个D天冬氨酸,以及488位V-I的变化,符合2011年后PRV变异株所具有的分子生物学特征。用分离株制备的疫苗免疫断奶仔猪后,能产生良好的中和抗体水平,攻毒后,免疫组的猪除个别的有体温升高的情况外,无其他任何临床症状,而未免疫的猪则全部出现精神萎靡、食欲减退、体温升高、神经症状甚至死亡,表明用分离株有着良好的免疫原性;抗原差异性分析实验结果中,不同毒株在中和抗体水平以及攻毒保护率上均存在明显的抗原差异。疫苗的初步应用效果良好。以上的研究结果表明,在采集的病料中所分离得到的是猪伪狂犬病毒,该病毒有较强的致病力和细胞适应性,为2011年起在我国开始流行的毒株,该毒株有良好的免疫原性,并且与我国广泛使用的疫苗株存在抗原差异,制备的灭活疫苗初步应用效果良好,也为今后进一步研究其致病机理、筛选疫苗株、分子流行病学研究以及病原诊断等提供了有价值的毒株。
万曾培[7]（2020）在《猪伪狂犬病毒流行株的分离鉴定及抗原性差异分析》文中研究表明猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）引起猪神经系统紊乱、呼吸系统疾病、生殖障碍和发烧的急性传染病。猪伪狂犬病主要损害母猪和哺乳仔猪,主要症状是母猪繁殖障碍,哺乳仔猪神经症状、呕吐及腹泻死亡。2011年底首先在天津暴发免疫过经典疫苗的生长育肥猪表现神经症状而死亡的新流行猪伪狂犬病现象,到目前为止,新暴发的猪伪狂犬病已在我国各个地区流行再度成为危害我国养猪业的重要传染病之一。针对新流行的猪伪狂犬疫情,了解新流行的猪伪狂犬病毒株遗传演化及基因变异状况有利于指导防控净化猪伪狂犬病工作。2018年,福建福州某猪场发生疑似猪伪狂犬病的疫情,取发病猪病变脏器进行核酸检测,确诊为PRV野毒感染,为分析病毒毒力,本研究利用小鼠回归试验、易感细胞接种及间接免疫荧光分离鉴定了一株PRV流行毒,命名为PRV-FJFZ株,之后进一步对PRV-FJFZ株进行毒价测定及g E、TK、g B和g C基因扩增测序分析,得到以下结果。（1）基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性分析显示,2011年后新流行的基因Ⅱ型猪伪狂犬毒株在g E、TK、g B和g C基因编导的氨基酸序列有多个位点的插入、缺失或替换等。（2）通过g E、TK、g B和g C基因序列比对分析,PRV-FJFZ株与国内各地区2011年后流行PRV毒株属于基因Ⅱ型且位于同一独立的分支,与欧美等分离株亲缘关系较远。（3）通过对PRV-FJFZ株进行毒价测定评估毒力情况,结果显示TCID50=10-7.2/0.1m L,LD50=10-3.56/0.1m L,PRV-FJFZ株对易感细胞感染性强。为进一步分析PRV-FJFZ株的毒力,本文基于实验室PRV流行毒三基因缺失株PRV-GD0304（GD1406TK-/g E-/g I-株）的研究基础,评估了流行野毒与经典疫苗毒血清交叉免疫保护作用。（4）根据血清型分型鉴定标准分析,PRV-GD1406和PRV-Bartha K61毒株间交叉反应程度相关系数R>70%,表明新流行野毒与经典毒株处于同一个血清型的不同亚型没有发生变异。（5）传统毒株PRV-Bartha K61株疫苗仍然有效,对基因Ⅱ型流行毒株呈中亲和力,选用PRV-Bartha疫苗时应选用抗原量高、作用持久、调整免疫程序以确保猪群有较高的抗体水平。（6）选用基因Ⅱ型流行株PRV-GD0304（GD1406TK-/g E-/g I-株）作为疫苗接种后诱导产生中和抗体水平高,对Bartha K61株具有较高的交叉中和能力,提示PRV-GD1406株有望成为预防基因Ⅱ型猪伪狂犬病毒的疫苗候选株,扩大应用范围。（7）血清中和试验采用不同血清（猪抗PRV-GD0304、猪抗PRV-Bartha K61）对分离株PRV-FJFZ进行中和,结果显示猪抗PRV-GD0304对PRV-FJFZ株的中和效价比猪抗PRV-Bartha K61对PRV-FJFZ株中和效价高,说明PRV-GD0304株对PRV-FJFZ株呈现高亲和力,抗原性更加接近。
陈丽燕[8]（2020）在《龙岩某规模种猪场猪伪狂犬病野毒感染血清学调查及病毒分离鉴定》文中指出伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是猪、牛、羊等多种家畜与野生动物被伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染后引起的一种急性传染病。猪是伪狂犬病毒的储存宿主,不同日龄的猪均可感染,一旦感染后成潜伏感染状态,可终身带毒。自2011年来,我国许多省份均暴发了猪伪狂犬病,从多个发病猪场分离到变异伪狂犬病野毒株。近年,有研究发现,受调查的闽西规模化猪场,猪伪狂犬病野毒感染情况不容乐观,目前猪伪狂犬病的防控形势依然严峻。本研究探寻龙岩市某规模种猪场猪伪狂犬野毒感染现状及原因,旨在为制订科学合理的防控策略提供依据。研究包括以下三个方面的主要内容:1、猪伪狂犬病野毒感染和免疫情况血清学调查为掌握龙岩年出栏万头的某规模种猪场猪伪狂犬病免疫和野毒感染情况,对该场2015-2018年间不同猪群共635份血清样品进行ELISA试验检测。结果表明,PRV-g B抗体阳性率四年均超过97%,PRV-g E抗体阳性率前三年均高于40%,当2018年该场更换疫苗并调整免疫程序后,阳性率下降到17%。说明该场猪群对早期使用的Batha-K61疫苗虽产生了良好的免疫效果,但未能对该场流行野毒提供完全保护,可能该场流行毒株与2018年所更换的疫苗毒株（HB98株、HB2000株）具有更高的相似性。2、实时荧光定量PCR检测伪狂犬病病毒方法的建立与应用为了对猪伪狂犬病毒可疑样品进行检测,建立了检测猪伪狂犬病毒的实时荧光定量PCR方法。试验选取猪伪狂犬病毒的g E基因的保守区设计引物,对引物、反应体系和扩增程序进行优化后,对该检测方法进行敏感性、特异性和可重复性进行测试,并与常规PCR方法进行对比。结果表明,所建立的猪伪狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法,具有良好的敏感性、特异性和重复性。该荧光定量PCR方法与常规PCR方法检测到的阳性率分别为82.75%和77.58%,且可检出更低的拷贝数,说明本研究建立的实时荧光定量PCR检测伪狂犬病病毒方法具有更高的灵敏性。3、猪伪狂犬病病毒的分离鉴定与遗传进化分析为了解该场中流行毒株的特征,对检出阳性的病料无菌过滤后接种于Vero-E6细胞上,盲传3代,再将可稳定传代毒株的g E和TK基因进行PCR扩增、序列测定与分析。结果显示,样品中出现了典型的PRV感染所致的细胞病变,成功获得了一株可稳定传代的毒株,并命名为PRV-FJ18株;该毒株的TCID50为10-4.29/100μL;其g E基因与广东GD0304株的核苷酸同源性最高,为100%,同属于一个遗传进化分枝上,与其他亚洲株均属于GⅠ型;TK基因的核苷酸序列遗传分析发现,该分离株与广东GD0304株、湖北Ea株、日本RC1株以及中国Fa株的Tk基因同属于一个遗传进化分枝上,与前3者的同源性达100%,虽然与疫苗Bartha株TK基因的同源性为99.7%,但是进化树上是处在两个不同的分枝中。综合以上结果,表明该分离株与GD0304株可能具有相同的来源。综上所述,该规模种猪场为猪伪狂犬野毒感染阳性场,并用本文建立的实时荧光定量PCR方法进行检测,从阳性样品中成功分离得到一株猪伪狂犬病毒,与广东GD0304株具有较高的相似性。建议该场沿用疫苗HB2000株进行免疫。
赵宇[9]（2020）在《PRV的分离、基因缺失株的构建及其免疫效力的探究》文中研究表明伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,即奥耶兹氏病（Aujeszky’s disease）,是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起牛、羊、猪等多种家畜及野生动物患病的传染病。猪是PRV主要的天然宿主,感染PRV会导致严重的神经紊乱、呼吸系统疾病和母猪的繁殖障碍,以及新生仔猪的高死亡率。目前对于猪伪狂犬病的防制主要依靠Bartha-K61疫苗,使该病得到有效控制。自2011年以来,中国许多规模化猪场接种Bartha-K61疫苗的猪群出现新一轮的PR疫情,表明Bartha-K61疫苗不能对当前的PRV感染提供完全保护,且新一轮的PR对我国养猪业的危害巨大,因此一种可针对当前PRV流行变异株的有效疫苗急待开发。本试验成功建立了检测PRV野毒株的荧光定量PCR检测方法,特异性结果显示,该方法只能够特异性检测PRV,对其它病原体无反应,表明该方法具有良好的特异性;灵敏度结果显示,PRV的最小检测下线为37.0 copies/μL,表明该方法具有良好的灵敏性;重复性结果显示,不同浓度标准品模板的批内变异系数为0.214～0.873%,批间的变异系数为0.964～1.233%,且批内和批间的变异系数均小于2%,表明本研究建立的荧光定量PCR检测方法具有重复性高、稳定性良好的优点。对201 8年6月至2020年1月的56份河南省的临床样品进行检测,结果显示,PRV的阳性率为17.86%（10/56）,表明河南省猪场依旧存在PRV野毒感染。本试验为PRV的早期诊断及其流行病学调查提供了技术保障。将鉴定为PRV阳性的病料接种于ST细胞,成功分离出2株PRV毒株。血清中和试验和靶向PRV gE基因的荧光定量PCR结果显示,本试验分离出的2株PRV毒株为野毒株。对本研究分离的2株PRV野毒株和1份PRV阳性病料进行gE全基因扩增、gE基因序列同源性分析以及遗传进化分析,结果显示,3株PRV野毒株均与国内流行株亲缘关系最近,同属一个分支,说明3株PRV野毒株均为PRV流行株。对PRV流行株在ST细胞上的增殖规律以及致病性进行探究,结果显示,分离株JZ-1-2019在接种ST细胞上第4-24h毒力逐渐上升,第36h达到最高,随后毒力开始降低;动物试验结果显示,分离株JZ-I-2019对小鼠具有致死性,说明流行株ZJ-1-2019为PRV强毒株。本次试验为PRV的检测方法提供技术支持,也为PRV遗传变异情况提供参考依据。本实验室利用同源重组的方法成功构建了 rPRV NY-gE-/gI-/TK-/EGFP+变异株,但传统的同源重组方法效率较低,因此,本试验在rPRV NY-gE-/gI-/TK-/EGFP+变异株的基础上,利用CRISPR/Cas9对外源基因EGFP进行大片段的敲除,获得不带有外源基因EGFP的rPRV NY-gE-/gI-/TK-变异株,随后,我们对该毒株的TCID50、一步生长曲线、理化特性以及稳定性进行探究。结果显示,敲除EGFP后并没有显着影响该毒株的病毒感染力,且该毒株的增长速度略低于亲本毒株;理化特性和遗传稳定性结果显示,该毒株与PRV野毒株的理化特性类似且该毒株具有良好的遗传稳定稳定性;将本实验室保存的rPRVNY-gE-/gI-,rPRV NY-gE-/gl-/TK-病毒液经甲醛灭活后,分别与MONTANIDETM SIA201 VG佐剂和MONTANIDETM GEL PR佐剂混合,制成4种灭活制剂,将4种灭活制剂及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,通过ELISA试验、中和试验及攻毒保护试验,来鉴定4种灭活制剂的免疫原性。结果显示,4种灭活制剂均可以有效刺激小鼠产生特异性抗体,且对PRV野毒的攻击均具有一定的抵抗力,其中,rPRV NY-gE-/gl-/TK--GEL灭活苗的免疫效果较差,其余3组无明显差异,但rPRV NY-gE-/gI-/TK--201灭活苗由于缺少TK基因,因此更加安全。本研究将为猪伪狂犬病毒变异株的防控及净化提供理论基础和科学依据。
张磊[10]（2019）在《河南省猪伪狂犬病野毒感染情况调查及流行毒株的分离鉴定》文中研究说明伪狂犬病（PR）是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的一种急性烈性传染病,其宿主范围广泛,可引起多种动物感染,表现发热、脑脊髓炎、呼吸和神经障碍。PRV具有潜伏感染能力。猪伪狂犬病病毒可以以气溶胶形式经过易感猪的口鼻传入,侵入呼吸道,经过神经传导入侵中枢神经系统最终导致神经症状。本研究系统的调查和分析了目前河南省部分地区的PRV野毒感染情况进行,了解流行情况,并且对分离到伪狂犬病病毒进行鉴定做遗传进化分析,以了解伪狂犬病毒的变化情况,对伪狂犬病的预防及控制有重要意义。1.河南省猪伪狂犬病野毒感染情况调查自2011年来,猪伪狂犬病在中国大部分地区暴发,野毒感染情况急剧上升,为了研究河南省猪伪狂犬病的野毒感染情况,了解该病的流行情况,对2018年全年送检共387个猪场的8947份猪血清用gE-ELLISA方法进行检测,并且收集河南农业大学动物疫病检测诊断中心近三年的野毒抗体检测数据,对其进行分析。结果显示,2018年河南地区PRV野毒抗体阳性猪场的比率为86.3%,血清PRV野毒抗体阳性率为41.53%,其中产房仔猪的PRV野毒抗体阳性率最高为65.5%,后备母猪的PRV野毒抗体阳性率最低为21.1%。2016-2018年的血清阳性率分别为47.8%、44.1%和41.53%。可以看出,河南省PRV野毒感染情况非常严重,阳性猪场较多,但是近三年的血清阳性率呈逐年下降趋势。2.猪伪狂犬病病毒流行毒的分离鉴定对2017年10月至2018年12月期间,疑似猪伪狂犬病的病料接种到Vero细胞上进行病毒的分离,在接毒48h即出现细胞变圆、收缩和合胞体的产生等典型的PRV细胞病变。对4株分离毒株做PCR鉴定、中和试验和动物试验等鉴定。检测到4株分离株的TCID50分别为:1 0-6.8/0.1ml、10-7.0/0.1ml、10-71/0.1 ml和10-73/0.1ml,并且所有毒株均能被标准的PRV阳性血清特异性中和,确定分离到的所有毒株均为PRV毒株。3.4株PRV分离毒株的gC、gD和gE基因序列分析根椐GenBank中PRV全基因序列,设计了 gE基因、gC基因和gD 基因的全基因特异性引物,将4株PRV分离株的DNA做为PCR扩增的模板,扩增产物测序。采用DNAStar软件将毒株序列与国内外参考毒株序列进行分析比对,做核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分析,并做氨基酸序列的遗传进化树分析。结果显示,gE基因与参考毒株之间核苷酸和氨基酸的相似性分别为97.7%-1 00%和95.7%-100%,gC基因序列与参考毒株核苷酸和氨基酸的相似性分别为95.9%-100%和93.1%-100%,gD基因的核苷酸和氨基酸的相似性与国外毒株相似性分别为98.8%-99.3%和97.5%-99.8%。4株分离株与HN1201株和JS-2012株等国内毒株亲缘关系最近。
二、猪伪狂犬病病毒潜伏感染检测方法研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪伪狂犬病病毒潜伏感染检测方法研究进展（论文提纲范文）
（1）PRV强毒株的分离及其gB、gD基因的遗传进化分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 文献综述 |
| 1 PRV的病原学 |
| 1.1 PRV的分类地位 |
| 1.2 PRV的病毒粒子结构 |
| 1.3 PRV的理化特性 |
| 1.4 PRV的血凝性和培养特性 |
| 1.5 PRV的病原性及致病机理 |
| 2 PRV的分子生物学特性 |
| 2.1 PRV的基因组特性 |
| 2.2 PRV的主要基因及其功能 |
| 3 猪伪狂犬病毒病的诊断方法 |
| 3.1 临床诊断 |
| 3.2 解剖学与组织病理学诊断 |
| 3.3 分子病原学诊断 |
| 3.3.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 3.3.2 环介导恒温扩增技术(LAMP) |
| 3.4 血清学诊断 |
| 3.4.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 3.4.2 间接免疫荧光法(IFA) |
| 3.4.3 血清中和试验(SNT) |
| 3.4.4 乳胶凝集试验(LAT) |
| 3.4.5 免疫胶体金技术 |
| 3.5 病毒分离 |
| 4 猪伪狂犬病疫苗的研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 传统弱毒疫苗 |
| 4.3 亚单位疫苗 |
| 4.4 核酸疫苗 |
| 4.5 伪狂犬重组活载体疫苗 |
| 4.6 伪狂犬基因缺失苗 |
| 4.6.1 第一代基因缺失苗 |
| 4.6.2 第二代双基因缺失苗 |
| 4.6.3 第二代三基因缺失苗 |
| 5 猪伪狂犬的流行状况 |
| 5.1 猪伪狂犬国外流行状况 |
| 5.2 猪伪狂犬病国内流行状况 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 试验一 鉴别猪伪狂犬病病毒强毒与疫苗弱毒PCR方法的的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒、菌株及临床样品 |
| 1.1.2 主要试剂及设备 |
| 1.2 引物的设计与合成 |
| 1.3 病料的研磨与DNA的提取 |
| 1.4 单项PCR扩增 |
| 1.5 DNA纯化回收,连接及转化 |
| 1.5.1 DNA纯化回收 |
| 1.5.2 连接 |
| 1.5.3 转化 |
| 1.5.4 蓝白斑筛选及测序 |
| 1.6 双重PCR扩增 |
| 1.7 双重PCR的特异性试验 |
| 1.8 双重PCR的灵敏度试验 |
| 1.9 双重PCR的重复性试验 |
| 1.10 临床应用 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 强毒株PCR扩增结果 |
| 2.2 弱毒株PCR扩增结果 |
| 2.3 双重PCR反应条件优化结果 |
| 2.4 双重PCR检测 |
| 2.5 双重PCR的灵敏度试验 |
| 2.6 双重PCR的重复性试验 |
| 2.7 临床应用 |
| 3 讨论 |
| 试验二 猪伪狂犬病病毒强毒株的分离与鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞、试验动物及临床样品 |
| 1.1.2 试验仪器 |
| 1.1.3 工具酶及试剂 |
| 1.2 病毒的PCR扩增 |
| 1.3 PRV的分离及其gE基因的检测 |
| 1.4 ST细胞中病毒滴度TCID50 的测定 |
| 1.5 接种小鼠试验 |
| 1.6 分离株的理化特性试验 |
| 1.7 一步生长曲线的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 组织病料PRV的 PCR检测结果 |
| 2.2 PRV的细胞培养与CPE的观察结果 |
| 2.3 PRVgE基因检测结果 |
| 2.4 PRV病毒含量测定结果 |
| 2.5 接种小鼠试验结果 |
| 2.6 分离株的理化特性试验结果 |
| 2.7 分离株的一步生长曲线测定结果 |
| 3 讨论 |
| 试验三 PRV分离株gB、gD基因的扩增及序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、细胞和菌株 |
| 1.1.2 主要试剂设备 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 病毒增殖培养及其DNA的提取 |
| 1.4 PRV gB、gD全基因的PCR扩增、克隆与测序 |
| 1.5 基因的遗传进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PRV gB、gD全基因的扩增结果 |
| 2.2 PRV gB、gD全基因重组质粒的PCR和酶切鉴定 |
| 2.3 gB全基因的核苷酸序列同源性分析 |
| 2.4 gB基因推导氨基酸的同源性分析 |
| 2.5 gB基因的遗传进化树分析 |
| 2.6 gD全基因的核苷酸序列同源性分析 |
| 2.7 gD基因推导氨基酸的同源性分析 |
| 2.8 gD基因的遗传进化树分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
（2）PRV激活三叉神经节细胞NF-κB信号通路的探究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪伪狂犬病概述 |
| 1.1 猪伪狂犬病主要流行病学特征 |
| 1.2 伪狂犬病毒致病机理研究进展 |
| 1.3 病毒对信号通路的影响在致病机理中的作用研究 |
| 1.4 伪狂犬病毒感染细胞的信号通路研究 |
| 2 伪狂犬病毒对NF-кB信号通路影响的研究进展 |
| 2.1 信号通路和NF-кB信号通路简介 |
| 2.2 NF-κB通路活化途径分类和正负调节 |
| 2.3 病毒调节NF-кB信号通路的研究进展 |
| 2.4 PI3K/Akt/NF-кB信号通路与细胞凋亡的关系 |
| 2.5 TLRs信号转导途径与NF-кB信号通路的关系 |
| 2.6 NF-кB信号通路在PRV激活三叉神经节细胞中的作用有待揭示 |
| 2.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 PRV感染小鼠三叉神经节细胞的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRV增毒培养 |
| 2.2 小鼠三叉神经节细胞培养 |
| 2.3 PRV感染小鼠三叉神经节细胞的病变观察 |
| 2.4 细胞间接免疫荧光法检测PRV在TG细胞内的增殖情况 |
| 2.5 小鼠三叉神经节细胞感染PRV以后的增殖情况 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV增毒培养结果 |
| 3.2 成年小鼠三叉神经节细胞的分离培养结果 |
| 3.3 TG细胞接毒PRV后出现的CPE现象 |
| 3.4 细胞间接免疫荧光法检测PRV在TG细胞内的增殖结果 |
| 3.5 小鼠三叉神经节细胞感染PRV以后的增殖情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 PRV对三叉神经节细胞NF-кB通路影响的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料与细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要溶液的配制 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 利用双抗夹心法ELISA检测样本中IL-1的含量 |
| 2.2 MyD88和TRIF基因沉默实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 Vero细胞接PRV后IL-1含量检测(浓度pg/mL)结果 |
| 3.2 TG细胞接毒PRV后IL-1检测(浓度pg/mL)结果 |
| 3.3 TG细胞接毒PRV后IL-6检测(浓度pg/mL)结果 |
| 3.4 沉默MyD88和TRIF后IL-1检测结果(浓度pg/mL) |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 PRV对细胞NF-КB通路影响研究的体内验证 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料与细胞 |
| 1.2 主要试剂和配方 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 小鼠脑内接毒PRV实验 |
| 2.2 小鼠脑组织中IL-1含量检测 |
| 2.3 实时荧光定量PCR检测p65转录因子 |
| 2.4 Western Blot实验检测p65表达蛋白量 |
| 3 结果 |
| 3.1 小鼠接毒PRV到脑组织后出现的瘙痒症状 |
| 3.2 PRV接毒到小鼠脑组织后IL-1的含量检测结果 |
| 3.3 实时荧光定量PCR检测NF-кB p65 转录因子含量的结果 |
| 3.4 Western Blot实验检测p65 表达蛋白量的结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 主要参考文献 |
| 附录一 研究生期间参与的课题 |
| 附录二 攻读硕士学位期间参与发表的论文 |
| 附录三 本文用到的部分英文缩写及含义说明 |
| 致谢 |
（3）山东规模猪场伪狂犬病野毒感染状况调查及阳性猪场的安全生产措施（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 猪伪狂犬病概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.2.1 猪伪狂犬病毒形态和理化性质 |
| 1.2.2 猪伪狂犬病毒基因组结构 |
| 1.2.3 gE的蛋白结构及功能 |
| 1.3 PRV的致病机制 |
| 1.3.1 病毒入侵 |
| 1.3.2 病毒转录 |
| 1.3.3 DNA合成与病毒的释放 |
| 1.4 猪伪狂犬病的流行病学 |
| 1.5 猪伪狂犬病的检测方法 |
| 1.5.1 病原学检测方法 |
| 1.5.2 血清学检测方法 |
| 1.6 伪狂犬疫苗的使用情况 |
| 1.7 研究的目的意义 |
| 2 试验研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品信息 |
| 2.1.2 主要实验材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要实验试剂配制 |
| 2.1.5 引物的设计 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病原学检测 |
| 2.2.2 血清学试验 |
| 2.2.3 组织病理学检测 |
| 2.2.4 病毒分离 |
| 2.2.5 PRVgE基因序列测定及分析 |
| 2.2.6 病毒gE全长基因序列的分析 |
| 2.2.7 试验场猪群疫苗免疫及抗体检测 |
| 2.2.8 试验场猪群免疫程序优化及生物安全措施 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 临床病例剖检病变及组织病理学观察结果 |
| 3.2 病理组织学观察 |
| 3.3 试验场PCR检测结果 |
| 3.4 试验场PRV分离与鉴定 |
| 3.5 PRV分离毒株gE基因同源性比对及遗传进化分析 |
| 3.5.1 同源性比对结果 |
| 3.5.2 遗传进化分析结果 |
| 3.5.3 gE基因推导氨基酸位点突变分析 |
| 3.6 gE抗体检测结果 |
| 3.6.0 山东地区规模猪场各阶段猪群PRVgE抗体检测结果 |
| 3.6.1 试验场gE抗体检测结果 |
| 3.6.2 试验场伪狂犬抗原检测情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）信阳市规模化种猪场伪狂犬病控制与净化关键技术研究与应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中英文缩写词对照表 |
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 PR病原学 |
| 1.1 PRV的病毒粒子 |
| 1.2 PRV的基因结构特性 |
| 2 PRV理化特性 |
| 3 PRV潜伏感染的特点 |
| 4 PR的疫苗类型 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 自然缺失弱毒疫苗(活苗) |
| 4.3 基因工程疫苗 |
| 4.4 几种重要的伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株 |
| 5 PR的诊断 |
| 6 PR的流行史 |
| 7 国外PR控制与净化方案研究现状 |
| 7.1 美国采取PR控制与根除计划简述 |
| 7.2 欧洲国家采取PR控制与净化计划简述 |
| 7.3 日本的PR控制与净化方案简述 |
| 8 国内PR控制与净化方案研究现状 |
| 8.1 国家生猪产业技术体系PR控制与净化方案简述 |
| 8.2 中国动物疾病预防控制中心示范场PR控制与净化方案简述 |
| 8.3 华中农业大学PR控制与净化方案简述 |
| 8.4 广东省农村农业厅PR控制与净化方案简述 |
| 8.5 台湾PR控制与净化方案简述 |
| 8.6 湖南新南方养殖服务有限公司PR控制与净化方案简述 |
| 第二章 引言 |
| 第三章 试验研究 |
| 第一节 试验一PR诊断与临床紧急接种效果研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床症状 |
| 2.2 剖检变化 |
| 2.3 PRV PCR鉴定 |
| 2.4 试验场PRVgE基因测序 |
| 2.5 PRVgE基因氨基酸相似性分析 |
| 2.6 PRVgE基因的氨基酸遗传进化分析 |
| 2.7 PRVg E抗体阻断ELISA检测 |
| 2.8 家兔感染试验 |
| 2.9 紧急接种疫苗 |
| 3 讨论 |
| 第二节 试验二PR免疫程序优化研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生产条件下仔猪PRV母源抗体水平变化检测 |
| 2.2 不同首免日龄接种疫苗后10天PRV抗体检测 |
| 2.3 疫苗接种当天及后10天猪只PRV中和抗体平均滴度检测结果对比 |
| 2.4 仔猪滴鼻免疫试验 |
| 3 讨论 |
| 3.1 生产条件下仔猪PRV母源抗体消长规律 |
| 3.2 仔猪滴鼻免疫试验 |
| 3.3 伪狂犬病理论优化免疫程序和生产实践免疫程序差异很大 |
| 3.4 本试验优缺点 |
| 第三节 试验三规模化种猪场伪狂犬病控制与净化关键技术的应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 紧急接种PR疫苗,PR临床症状消失,PR得到控制 |
| 2.2 PR净化前后PRVg E野毒抗原阳性率变化 |
| 2.3 PR净化前后各阶段猪群PRVg E野毒抗体阳性率变化 |
| 2.4 PR净化前后各阶段猪群中和抗体变化 |
| 2.5 PR净化前后母猪群生产性能指标变化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 规模化种猪场伪狂犬病控制与净化关键技术的应用取得了显着效果 |
| 3.2 规模化种猪场伪狂犬病控制与净化关键技术的应用,必须同时配合其它综合措施 |
| 3.3 紧急接种PR疫苗,效果显着 |
| 第四章 全文总结 |
| 第五章 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附:导师及作者简介 |
（5）猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失疫苗候选毒株的构建及其免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 伪狂犬病及猪伪狂犬病的流行及危害 |
| 1.1.1 2011年以来猪伪狂犬病的流行概况 |
| 1.1.2 2011年以来PRV流行毒株遗传变异情况 |
| 1.2 PRV的病原学特征 |
| 1.2.1 PRV分类地位 |
| 1.2.2 PRV主要生物学特征 |
| 1.2.3 PRV的基因组结构 |
| 1.2.4 PRV编码的毒力相关蛋白 |
| 1.3 PRV疫苗研究现状 |
| 1.3.1 PRV传统疫苗 |
| 1.3.2 基因工程疫苗 |
| 1.3.3 针对PRV新流行毒株的疫苗研发 |
| 1.4 CRISPR/Cas9技术在病毒基因缺失上的应用 |
| 1.4.1 基因编辑技术的发展 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9技术的原理 |
| 1.4.3 CRISPR/Cas9技术基因编辑的方式 |
| 1.4.4 CRISPR/Cas9技术在病毒中的应用 |
| 1.5 携带CRISPR/Cas9系统的慢病毒系统 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 疑似猪伪狂犬病病料 |
| 2.1.2 病毒、细胞与质粒 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 抗体制剂与试剂盒 |
| 2.1.5 主要试剂及试剂配制与耗材器材 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.2.2 分离毒株的鉴定 |
| 2.2.3 PRV分离毒株的同源性分析 |
| 2.2.4 PRV分离毒株的复制动力学的测定 |
| 2.2.5 PRV分离毒株毒力测定 |
| 2.2.6 分离毒株的免疫原性测定 |
| 2.2.7 sgRNA载体构建与筛选 |
| 2.2.8 携带sg RNA与Cas9的慢病毒质粒的构建 |
| 2.2.9 Lenti CRISPR V2-sg RNA gE/gI重组质粒的功能鉴定 |
| 2.2.10 稳定敲除PRV gE/gI的慢病毒系统构建 |
| 2.2.11 gE/gI-Cas9-Vero细胞中Cas9基因整合与表达的测定 |
| 2.2.12 gE/gI-Cas9-Vero稳定表达细胞系基因编辑效率测定 |
| 2.2.13 gE/gI双基因缺失病毒的获取 |
| 2.2.14 PRVgE/gI双基因缺失病毒株的鉴定 |
| 2.2.15 PRV gE/gI双基因缺失株对小鼠致病性 |
| 2.2.16 PRV gE/gI双基因缺失株免疫原的制备 |
| 2.2.17 PRV gE/gI双基因缺失株免疫原性实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRV分离与鉴定结果 |
| 3.1.1 病料样品的检测 |
| 3.1.2 PRV病毒株的分离及纯化 |
| 3.1.3 病毒的鉴定 |
| 3.1.4 PRV分离株的gE/gC同源性比对及氨基酸序列分析 |
| 3.2 PRV流行毒株复制动力学的测定 |
| 3.3 PRV-WC01株LD50及免疫原性的测定 |
| 3.3.1 PRV-WC01株LD50测定结果 |
| 3.3.2 PRV-WC01病毒感染后的临床症状 |
| 3.3.3 PRV-WC01株的免疫原性测定结果 |
| 3.4 高效sgRNA筛选结果 |
| 3.4.1 不同sgRNA对病毒复制的影响 |
| 3.4.2 用于gE/gI基因敲除的高效sg RNA筛选 |
| 3.5 慢病毒包装系统的构建及其功能测定 |
| 3.5.1 慢病毒包装系统质粒的构建 |
| 3.5.2 慢病毒包装系统质粒功能的初步验证 |
| 3.6 稳定敲除PRV gE/gI细胞系获得及功能验证 |
| 3.6.1 使细胞致死的嘌呤霉素最低浓度测定 |
| 3.6.2 筛选获得稳定敲除PRV gE/gI细胞系 |
| 3.6.3 gE/gI-Cas9-Vero细胞中Cas9 基因整合与表达的测定 |
| 3.7 PRV-WC01 gE/gI双基因缺失毒的获得 |
| 3.7.1 PRV-WC01 gE/gI双基因敲除病毒的筛选与纯化 |
| 3.7.2 PRV-WC01 gE/gI基因敲除病毒的鉴定 |
| 3.8 PRV-WC01 gE/gI双基因敲除病毒特性的研究 |
| 3.8.1 PRV-WC01Del-gE/gI病毒复制动力学分析 |
| 3.8.2 PRV-WC01Del-gE/gI病毒对小鼠致病性的研究 |
| 3.9 PRV-WC01Del-gE/gI免疫原对猪免疫保护的评估 |
| 3.9.1 PRV-WC01 gE/gI双基因敲除病毒免疫原的制备 |
| 3.9.2 PRV-WC01Del-gE/gI免疫原诱导的特异性ELISA抗体检测 |
| 3.9.3 PRV-WC01Del-gE/gI免疫原诱导的中和抗体检测 |
| 3.9.4 PRV-WC01Del-gE/gI免疫原对强毒株WC01的免疫保护结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRV分离毒株生物学特性与猪伪狂犬病的流行病学 |
| 4.2 CRISPR/Cas9 系统构建PRV gE和 gI双基因缺失的编辑效率 |
| 4.3 WC01 Del-gE/gI基因缺失病毒免疫原性分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（6）猪伪狂犬病病毒流行株的分离鉴定及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 伪狂犬病的流行病学 |
| 1.1.1 易感动物 |
| 1.1.2 传播途径 |
| 1.1.3 国内外流行情况 |
| 1.1.4 猪伪狂犬病的净化情况 |
| 1.2 伪狂犬病毒的病原学 |
| 1.2.1 分类地位 |
| 1.2.2 基因组及其表达的蛋白 |
| 1.2.3 病毒的致病机理 |
| 1.2.4 病毒的理化特性 |
| 1.3 伪狂犬病的诊断和检测方法 |
| 1.3.1 临床诊断 |
| 1.3.2 实验室检测 |
| 1.4 伪狂犬病疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 弱毒疫苗 |
| 1.4.3 基因工程疫苗 |
| 1.5 课题研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 细胞、毒株、血清和疫苗 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要仪器和设备 |
| 2.1.6 主要溶液的配置和保存 |
| 2.2 试验内容与方法 |
| 2.2.1 病料的处理 |
| 2.2.2 病料的PCR鉴定 |
| 2.2.3 病毒的分离培养 |
| 2.2.4 分离病毒的鉴定 |
| 2.2.5 病毒的生长曲线的测定 |
| 2.2.6 病毒的动物感染实验 |
| 2.2.7 病毒gE基因的克隆、测序及序列分析 |
| 2.2.8 分离病毒灭活疫苗的初步应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 病料的鉴定结果 |
| 3.2 病料的分离培养结果 |
| 3.2.1 病毒的分离结果 |
| 3.2.2 分离病毒含量的测定结果 |
| 3.3 分离病毒的鉴定结果 |
| 3.3.1 病毒株PCR的鉴定结果 |
| 3.3.2 血清学鉴定结果 |
| 3.3.3 电镜的观察结果 |
| 3.3.4 直接免疫荧光法鉴定结果 |
| 3.4 病毒的生长曲线测定结果 |
| 3.5 致病力试验测定结果 |
| 3.5.1 对家兔的致病力测定结果 |
| 3.5.2 对小白鼠的致病力测定结果 |
| 3.5.3 对断奶仔猪的致病力测定结果 |
| 3.6 病毒gE基因的克隆、测序及序列分析结果 |
| 3.6.1 病毒gE基因的PCR扩增结果 |
| 3.6.2 病毒gE基因测序及序列分析结果 |
| 3.7 分离病毒灭活疫苗的初步应用结果 |
| 3.7.1 分离株的免疫效果测定结果 |
| 3.7.2 与经典疫苗株抗原差异性的测定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 猪伪狂犬病病毒流行株的分离鉴定 |
| 4.2 猪伪狂犬病毒分离株的gE基因 |
| 4.3 猪伪狂犬病毒分离株的免疫原性 |
| 4.4 猪伪狂犬病毒分离株的抗原差异性 |
| 4.5 猪伪狂犬病病毒分离株灭活疫苗初步应用的效果 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（7）猪伪狂犬病毒流行株的分离鉴定及抗原性差异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表 |
| 第一章 猪伪狂犬病的研究进展 |
| 1.1 猪伪狂犬病毒的流行史 |
| 1.2 猪伪狂犬病毒的生物学特性 |
| 1.2.1 猪伪狂犬病毒的病原学分类 |
| 1.2.2 猪伪狂犬病毒形态结构 |
| 1.2.3 猪伪狂犬病毒的基因组 |
| 1.2.4 猪伪狂犬病毒的主要编码蛋白 |
| 1.3 猪伪狂犬病的致病机理 |
| 1.4 猪伪狂犬病的流行病学 |
| 1.5 猪伪狂犬病的临床症状和病理变化 |
| 1.6 猪伪狂犬病的诊断、防控和净化 |
| 1.6.1 猪伪狂犬病的诊断与防控 |
| 1.6.2 猪伪狂犬病的净化与根除策略 |
| 1.7 研究目的和意义 |
| 第二章 一株猪伪狂犬病毒流行株的分离鉴定及基因序列分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 病料、细胞和试验动物 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病料处理 |
| 2.2.2 引物的设计与合成 |
| 2.2.3 病毒DNA的提取及PCR鉴定 |
| 2.2.4 小鼠回归试验 |
| 2.2.5 病毒分离培养 |
| 2.2.6 病毒的间接免疫荧光鉴定 |
| 2.2.7 病毒gE、gB、gC及 TK基因测序及比对分析 |
| 2.2.8 病毒的TCID_(50)、LD_(50)测定结果 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病料PCR检测结果 |
| 2.3.2 小鼠回归试验结果 |
| 2.3.3 细胞感染与病毒分离 |
| 2.3.4 病毒的间接免疫荧光鉴定 |
| 2.3.5 PRV-FJFZ株 gE、TK、gB及 gC扩增结果 |
| 2.3.6 g E基因测序结果分析 |
| 2.3.7 TK基因测序结果分析 |
| 2.3.8 g B基因测序结果分析 |
| 2.3.9 g C基因测序结果分析 |
| 2.3.10 病毒的TCID_(50)、LD_(50)测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 猪伪狂犬病毒流行株与经典毒株抗原性差异分析 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 试验动物及细胞 |
| 3.1.2 毒株和试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 病毒繁殖 |
| 3.2.2 病毒TCID_(50)测定 |
| 3.2.3 高免血清制备 |
| 3.2.4 微量交叉中和试验 |
| 3.2.5 抗原性差异分析标准 |
| 3.2.6 血清中和试验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 病毒繁殖 |
| 3.3.2 TCID_(50)测定结果 |
| 3.3.3 高免血清制备结果 |
| 3.3.4 微量交叉中和试验结果 |
| 3.3.5 抗原性差异分析 |
| 3.3.6 血清中和试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他成果 |
（8）龙岩某规模种猪场猪伪狂犬病野毒感染血清学调查及病毒分离鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 伪狂犬病简介 |
| 1.1 伪狂犬病的流行病学 |
| 1.2 伪狂犬病的流行概况 |
| 1.3 猪伪狂犬病的诊断方法 |
| 1.3.1 传统的诊断方法 |
| 1.3.2 当前常用的检测方法 |
| 1.4 猪伪狂犬病的防治措施 |
| 2 猪伪狂犬病毒的病原特性 |
| 2.1 病毒粒子的形态特征 |
| 2.2 病毒粒子的理化特性 |
| 2.3 猪伪狂犬病毒的培养方法 |
| 2.4 猪伪狂犬病毒的致病机理 |
| 3 PRV基因组 |
| 3.1 PRV基因组的结构 |
| 3.2 gE、TK基因的功能 |
| 3.2.1 gE基因 |
| 3.2.2 TK基因 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 龙岩某规模种猪场猪伪狂犬病野毒感染和免疫情况血清学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 血清样品的采集材料 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 检测方法 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 伪狂犬病gB抗体检测情况 |
| 2.2 伪狂犬病gE抗体检测情况 |
| 2.2.1 不同年份猪伪狂犬病野毒感染情况 |
| 2.2.2 不同阶段猪伪狂犬病野毒感染情况 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于PRV抗体检测 |
| 3.2 PRV免疫和野毒感染情况分析 |
| 4 小结 |
| 第三章 实时荧光定量PCR检测伪狂犬病病毒方法的建立与应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒基因组和质粒 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 序列分析及引物设计 |
| 1.4 常规PCR的扩增 |
| 1.5 构建荧光定量产物的参考质粒 |
| 1.6 构建用于检测PRV的 Quantitative Real-time PCR |
| 1.6.1 标准曲线的建立 |
| 1.6.2 敏感性试验 |
| 1.6.3 特异性试验 |
| 1.6.4 重复性试验 |
| 1.7 临床样本收集与处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 常规PCR扩增目的基因 |
| 2.2 绘制检测 PRV 的实时荧光定量 PCR 标准曲线和熔解曲线 |
| 2.3 敏感性试验 |
| 2.4 特异性试验 |
| 2.5 重复性试验 |
| 2.6 临床样本检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 龙岩某规模种猪场猪伪狂犬病毒的分离鉴定与遗传进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要仪器与耗材 |
| 1.2 病料处理 |
| 1.3 细胞接种 |
| 1.4 病毒鉴定 |
| 1.5检测病毒TCID50 |
| 1.6 PRV的基因组提取和g E和TK测序 |
| 1.6.1 病毒DNA提取 |
| 1.6.2 设计PRV g E和 TK基因测序引物 |
| 1.6.3 病毒序列的扩增 |
| 1.6.4 扩增产物的凝胶纯化 |
| 1.6.5 PRV的 g E和 TK基因的序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PRV的分离、鉴定与定量 |
| 2.1.1 细胞CPE |
| 2.1.2 TCID50检测结果 |
| 2.2 PRV的部分毒力基因遗传进化分析 |
| 2.2.1 PRV g E和 TK基因的PCR扩增结果 |
| 2.2.2 gE基因核苷酸序列遗传进化分析 |
| 2.2.3 TK基因核苷酸序列遗传进化分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）PRV的分离、基因缺失株的构建及其免疫效力的探究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 伪狂犬病 |
| 2 伪狂犬病病毒 |
| 2.1 伪狂犬病病毒的分子生物学 |
| 2.2 伪狂犬病病毒的基因组 |
| 2.3 伪狂犬病病毒的理化特性 |
| 3 猪伪狂犬病病毒常见的诊断方法 |
| 3.1 临床诊断 |
| 3.2 病理组织学诊断 |
| 3.3 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR) |
| 3.4 酶联免疫吸附试验(Hemagglutination-hemagglutination inhibition,ELISA) |
| 3.5 血清中和试验(Serum Neutralization,SN) |
| 4 猪伪狂犬病毒疫苗 |
| 4.1 灭活苗 |
| 4.2 弱毒疫苗 |
| 4.3 基因缺失疫苗 |
| 4.3.1 第一代基因缺失疫苗-单基因缺失疫苗 |
| 4.3.2 第二代基因缺失疫苗-双基因缺失疫苗 |
| 4.3.3 第二代基因缺失疫苗-三基因缺失疫苗 |
| 4.4 亚单位疫苗 |
| 4.5 DNA疫苗 |
| 4.6 猪伪狂犬病病毒重组疫苗 |
| 5 猪伪狂犬病的防控 |
| 6 CISPR/Cas9系统 |
| 6.1 CRISPR/Cas9系统的来源 |
| 6.2 CRISPR/Cas9系统的基因结构与工作机制 |
| 6.3 CRISPR/Cas9的应用 |
| 6.3.1 CRISPR/Cas9在植物中的应用 |
| 6.3.2 CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞中的应用 |
| 6.3.3 CRISPR/Cas9在病毒中的应用 |
| 7 本研究的目的和意义 |
| 试验一 猪伪狂犬病病毒野毒株荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒、菌株及临床样品 |
| 1.1.2 主要试剂设备 |
| 1.2 引物的设计与合成 |
| 1.3 病料的研磨与DNA的提取 |
| 1.4 PRV的PCR扩增 |
| 1.5 DNA纯化回收,连接及转化 |
| 1.5.1 DNA的纯化 |
| 1.5.2 连接 |
| 1.5.3 转化 |
| 1.6 蓝白斑筛选及测序 |
| 1.7 阳性质粒的提取 |
| 1.8 PRV荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 1.8.1 PRV荧光定量PCR最佳反应条件的摸索及标准曲线的建立 |
| 1.8.2 PRV荧光定量PCR的特异性和敏感性分析 |
| 1.8.3 PRV荧光PCR重复性试验 |
| 1.8.4 临床样品检测 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 标准品模板的制备结果 |
| 2.2 PRV荧光定量PCR标准曲线的建立结果 |
| 2.3 荧光定量PCR特异性试验与灵敏性试验结果 |
| 2.4 重复性试验结果 |
| 2.5 临床样品PRV的检测 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验二 猪伪狂犬病病毒的分离及gE基因的遗传进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞及试验动物 |
| 1.1.2 主要试剂设备 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 病毒的分离培养 |
| 1.4 病毒的纯化 |
| 1.5 病毒在ST细胞上TCID_(50)的测定 |
| 1.6 PRV血清中和试验鉴定 |
| 1.7 病毒荧光定量PCR鉴定 |
| 1.8 PRVgE基因的扩增 |
| 1.8.1 gE全基因的扩增纯化及测序 |
| 1.8.2 序列测定与分析 |
| 1.9 PRV JZ-1-2019株的一步生长曲线的测定 |
| 1.10 PRV JZ-1-2019株动物回归试验 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 PRV的分离纯化结果 |
| 2.2 PRV TCID_(50)的测定结果 |
| 2.3 PRV的血清中和试验结果 |
| 2.4 PRV的荧光定量PCR鉴定结果 |
| 2.5 gE全基因的扩增结果 |
| 2.6 PRV分离株gE基因的序列分析结果 |
| 2.6.1 PRV分离株gE基因的同源性分析结果 |
| 2.6.2 PRV分离株gE全基因推导氨基酸的序列分析 |
| 2.6.3 PRV分离株gE全基因系统发育进化关系分析 |
| 2.7 猪伪狂犬病病毒变异株在ST细胞上的增殖规律 |
| 2.8 猪伪狂犬病病毒变异株致病性结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验三 PRV流行株三基因缺失变异rPRV NY-gE-/gI-/TK-的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 毒株、细胞、菌株与质粒 |
| 1.1.2 主要试剂设备 |
| 1.1.3 敲除载体的构建技术路线 |
| 1.2 病毒增殖培养 |
| 1.3 待检样品处理与DNA提取 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 TK及EGFP基因的扩增 |
| 1.6 CRISPR/Cas9菌液的复苏、挑斑及质粒的提取 |
| 1.7 PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-EGFP及PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-TK双敲除载体的构建 |
| 1.8 PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-TK及PX459-gRNA1/2- EZ-gRNA3/4-EGFP双敲除载体的构建 |
| 1.9 敲除载体PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-TK及PX459-gRNA1/2- EZ-gRNA3/4-EGFP的转染 |
| 1.10 接毒 |
| 1.11 rPRV NY-gE~-/gI~-/TK-的挑斑纯化 |
| 1.12 NY株、rPRV NY-gE~-/gI~-株以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-株的的TCID_(50)的测定 |
| 1.13 NY株、rPRV NY-gE~-/gI~-株以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-株的一步生长曲线的测定 |
| 1.14 重组病毒rPRV NY-gE-/gI~-/TK~-的理化特性检测 |
| 1.15 rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-遗传稳定性的评价 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 TK与EGFP基因的扩增结果 |
| 2.2 PX459与EZ载体的提取结果 |
| 2.3 PX459与EZ载体的酶切结果 |
| 2.4 PX459-gRNA1/2-TK、EZ-gRNA3/4-TK、PX459-gRNA1/2-EGFP及EZ-gRNA3/4-EGFP载体的构建结果 |
| 2.5 PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-EGFP及PX459-gRNA1/2-EZ-gRNA3/4-TK双敲除载体菌液PCR检测结果 |
| 2.6 rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-的拯救结果 |
| 2.7 NY株、rPRV NY-gE~-/gI~-株以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-的TCID_(50)的测定结果 |
| 2.8 NY株、rPRV NY-gE~-/gI~-株以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-的—步生长曲线测定结果 |
| 2.9 重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-的理化特性检测 |
| 2.10 rPRV NY-gE~-/gl~-/TK~-遗传稳定性的评价结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 试验四 基因缺失伪狂犬变异株灭活制剂免疫原性初步探究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 疫苗和毒株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂仪器 |
| 1.2 灭活疫苗的制备 |
| 1.2.1 rPRV NY-gE~-/gI~-及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-缺失毒的灭活 |
| 1.2.2 rPRV NY-gE~-/gI~--201、rPRV NY-gE~-/gI~--GEL、rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--201以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--GEL灭活制剂的制备 |
| 1.3 小鼠免疫试验 |
| 1.4 间接ELISA检测 |
| 1.5 血清中和试验 |
| 1.6 攻毒保护试验 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 灭活制剂的制备结果 |
| 2.1.1 rPRV NY-gE~-/gI~-及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~-缺失毒的灭活 |
| 2.1.2 rPRV INY-gE~-/gI~--201、rPRV NY-gE~-/gI~--GEL、rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--201以及rPRV NY-gE~-/gI~-/TK~--GEL灭活制剂的制备结果 |
| 2.2 间接ELISA抗体检测结果 |
| 2.3 PRV的血清中和试验结果 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 2.5 荧光定量PCR方法检测攻毒小鼠主要组织中PRV载量 |
| 3 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附录：攻读硕士期间发表的论文 |
（10）河南省猪伪狂犬病野毒感染情况调查及流行毒株的分离鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病毒基因组 |
| 1.2 病毒的相关蛋白 |
| 1.3 病毒的潜伏感染机制 |
| 2 流行现状 |
| 2.1 国外的流行状况 |
| 2.2 国内的流行状况 |
| 3 主要诊断方法 |
| 3.1 病毒分离 |
| 3.2 分子诊断 |
| 3.2.1 核酸探针诊断 |
| 3.2.2 常规PCR诊断 |
| 3.2.3 多重PCR诊断 |
| 3.2.4 荧光定量PCR诊断 |
| 3.2.5 环介导等温扩增 |
| 3.3 血清检测 |
| 3.3.1 中和试验 |
| 3.3.2 酶联免疫吸附试验 |
| 3.3.3 乳胶凝集试验 |
| 3.3.4 免疫荧光试验 |
| 4 疫苗研究进展 |
| 4.1 灭活疫苗 |
| 4.2 弱毒活疫苗 |
| 4.3 转因缺失疫苗 |
| 4.4 新型疫苗 |
| 4.4.1 亚单位疫苗 |
| 4.4.2 重组疫苗 |
| 4.4.3 核酸疫苗 |
| 试验一 河南省猪伪狂犬病野毒感染情况调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 血清样品 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 试验器材 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 血清处理 |
| 1.2.2 PRV野毒抗体的检测 |
| 1.2.3 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同地区猪场PRV野毒抗体阳性率 |
| 2.2 不同年龄段猪群PRV野毒抗体阳性率 |
| 2.3 不同规模猪场PRV野毒抗体阳性率 |
| 2.4 近三年PRV野毒抗体阳性率 |
| 3 讨论 |
| 试验二 猪伪狂犬病病毒流行毒的分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病料和细胞 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要器材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 病料的采集和处理 |
| 1.2.2 引物设计及合成 |
| 1.2.3 细胞传代 |
| 1.2.4 病毒分离 |
| 1.2.5 DNA的提取 |
| 1.2.6 PCR鉴定 |
| 1.2.7 病毒TCID_(50)测定 |
| 1.2.8 病毒中和试验 |
| 1.2.9 动物试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离 |
| 2.2 PCR鉴定 |
| 2.3 TCID_(50)的测定 |
| 2.4 病毒中和试验 |
| 2.5 动物试验 |
| 3 讨论 |
| 试验三 4株PRV分离毒株的gC、gD和gE基因序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要器材 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计及合成 |
| 1.2.2 目的基因的PCR扩增 |
| 1.2.3 目的基因序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 gE、gC和gD基因的PCR扩增 |
| 2.2 gE基因序列分析 |
| 2.2.1 gE基因核苷酸和氨基酸相似性分析 |
| 2.2.2 gE基因进化分析 |
| 2.3 gC基因序列分析 |
| 2.3.1 gC基因核苷酸和氨基酸相似性分析 |
| 2.3.2 gC基因进化分析 |
| 2.4 gD基因序列分析 |
| 2.4.1 gD基因核苷酸和氨基酸相似性分析 |
| 2.4.2 gD基因进化分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
四、猪伪狂犬病病毒潜伏感染检测方法研究进展（论文参考文献）
- [1]PRV强毒株的分离及其gB、gD基因的遗传进化分析[D]. 顾阳. 河南农业大学, 2020(04)
- [2]PRV激活三叉神经节细胞NF-κB信号通路的探究[D]. 廖少山. 贵州大学, 2020(01)
- [3]山东规模猪场伪狂犬病野毒感染状况调查及阳性猪场的安全生产措施[D]. 张晓阳. 山东农业大学, 2020
- [4]信阳市规模化种猪场伪狂犬病控制与净化关键技术研究与应用[D]. 朱贵阳. 河南农业大学, 2020(04)
- [5]猪伪狂犬病病毒流行株gE/gI双基因缺失疫苗候选毒株的构建及其免疫原性分析[D]. 丁国杰. 东北农业大学, 2020(07)
- [6]猪伪狂犬病病毒流行株的分离鉴定及免疫原性分析[D]. 李岩. 东北农业大学, 2020(07)
- [7]猪伪狂犬病毒流行株的分离鉴定及抗原性差异分析[D]. 万曾培. 佛山科学技术学院, 2020(01)
- [8]龙岩某规模种猪场猪伪狂犬病野毒感染血清学调查及病毒分离鉴定[D]. 陈丽燕. 福建农林大学, 2020(02)
- [9]PRV的分离、基因缺失株的构建及其免疫效力的探究[D]. 赵宇. 河南农业大学, 2020(06)
- [10]河南省猪伪狂犬病野毒感染情况调查及流行毒株的分离鉴定[D]. 张磊. 河南农业大学, 2019(04)