一、NOV基因修饰神经干细胞移植对损伤大鼠脊髓功能恢复的影响（论文文献综述）
曾友根[1]（2020）在《NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究》文中提出目的:本研究通过观察NSCs和OECs联合移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞神经营养因子,凋亡及抗凋亡蛋白因子表达影响,探讨细胞移植对SNHL损伤耳蜗细胞保护作用的部分机制。方法:（1）细胞培养:选取胎鼠作为移植细胞组织来源,对NSCs和OECs培养、形态观察及鉴定。（2）动物造模:采用庆大霉素对大鼠进行SNHL造模,将筛选出符合要求的大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组予NSCs和OECs联合移植,对照组予输注人工外淋巴液代替细胞移植。（3）细胞移植:将荧光标记的NSCs和OECs通过圆窗植入耳蜗内,术后记录各组大鼠体重变化,检测大鼠ABR听力阈值变化和听觉耳动反射阈值,并采集样本检测。（4）耳蜗切片HE染色。（5）耳蜗免疫荧光染色检测移植后NSCs和OECs荧光标记物。（6）TUNEL法检测凋亡细胞阳性细胞数和MOD值。（7）免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞。（8）Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达影响。结果:（1）细胞培养鉴定结果:NSCs染色鉴定标记物呈nestin阳性,OECs染色鉴定标记物呈p75NTR阳性,培养获得了纯度较高的细胞。（2）听觉耳动反射检测结果:实验组大鼠耳廓反射阈值改善,耳廓抖动变化增强,对照组改变不明显。（3）ABR阈值变化结果:与对照组比较,实验组在1周后ABR阈值变化不明显（P>0.05）,在2周后实验组ABR阈值变化升高（P<0.05）。（4）耳蜗免疫荧光染色结果:实验组移植后NSCs标记分化的细胞部分能表达神经元细胞标志物Nestin,OECs标记分化的细胞分能表部达OECs标志物p75NTR,对照组耳蜗未发现荧光标记的细胞。（5）HE染色结果:对照组见内、外毛细胞变性坏死,SGCs部分坏死,核萎缩,损伤明显,细胞空泡样变性,密度降低,排列疏松混乱不齐,实验组整体病理损伤减低。（6）TUNEL阳性细胞数检测结果:与对照组比较,实验组TUNEL阳性细胞数明显减少（P<0.05）,细胞凋亡指数占比减少,MOD值减少（P<0.05）。（7）免疫组化检测结果:与对照组比较,实验组BDNF和NT-3阳性细胞数及IOD值明显增多（P<0.05）,同时抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数及IOD值升高,促凋亡因子Bax、Caspase-3阳性细胞数及IOD值减少（P<0.05）。（8）Western-blot检测结果:与对照组比较,实验组耳蜗组织样本中BDNF、NT-3,Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论:（1）NSC联合OEC移植对SNHL大鼠耳蜗具有保护作用,能减轻耳蜗细胞的损伤。（2）NSC联合OEC移植可能通过调节神经营养因子的表达水平而参与了耳蜗细胞的保护过程。（3）NSC联合OEC移植可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达路径而参与了对SNHL耳蜗细胞凋亡的保护机制。
陈梦吉,叶佳辉,应一博,陈敏,窦海成,倪文飞,朱思品[2]（2020）在《氧调控性神经生长因子基因修饰神经干细胞移植治疗急性脊髓损伤》文中认为目的探讨氧调控性神经生长因子（nerve growth factor,NGF）基因修饰神经干细胞（neural stem cells,NSCs）移植治疗急性脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）的可行性并观察脊髓损伤后的功能修复情况。方法以腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）为载体构建基因修饰神经干细胞,制备SCI动物模型3 d后将氧调控性神经生长因子基因修饰的神经干细胞移植到脊髓损伤部位作为AAV-5HRE-NGF-NSCs组（NGF组）;另设GFP修饰的神经干细胞组（AAV-5HRE-GFP-NSCs组,GFP组）;假手术组（空白组）;SCI组（对照组）。在移植后第1、3、7、10、14、21、28、35、42、60 d共10个时间点采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）运动功能评分,斜板试验和脚步印迹检测大鼠后肢运动功能的恢复情况。通过盒式磁带录像（video cassette recorder,VCR）图像及定量测定大鼠离地高度,错误脚步及后肢轮替动作检验大鼠的后肢支持力及灵活度。通过观察脊髓直观图粗测大鼠脊髓损伤程度。通过尼氏染色、HE染色和免疫荧光方法评价脊髓损伤区的神经元修复及形态学变化情况。通过CM-DiI追踪移植神经干细胞并用免疫荧光的方法分析干细胞的分化情况。结果基因修饰神经干细胞移植60 d后,NGF组大鼠的BBB,斜板测试和脚步印迹试验的功能评分均高于SCI组和GFP组,差异有统计学意义（P<0.05）;通过VCR图像分析,NGF组大鼠的后肢支持力与活动灵活度优于SCI组和GFP组,差异有统计学意义（P<0.05）;通过脊髓直观图分析,各组大鼠脊柱肉眼观对比图示NGF组脊柱未呈现明显萎缩和颜色加深,损伤程度低于SCI组和GFP组;通过尼氏染色、HE染色和免疫荧光方法检测,相比于SCI组与GFP组,NGF组在移植部位NeuN呈明显阳性,同时在形态学水平可见明显再生的神经结构,且SCI空洞面积减小,神经元和尼氏小体增多,差异具有统计学意义（P<0.05）。通过CM-DiI追踪神经干细胞,用NeuN标记神经元,用GFAP标记星形胶质细胞,发现神经干细胞可以有效分化为神经元和星形胶质细胞,GFP组神经干细胞更多向星形胶质细胞分化,NGF组神经干细胞更多向神经元分化。结论通通过腺相关病毒介导氧调控性NGF基因修饰神经干细胞移植治疗SCI,一方面神经干细胞分化为神经干细胞和星形胶质细胞可以填补损伤空洞;另一方面神经干细胞充当NGF基因治疗的载体,对邻近受损神经细胞发挥保护作用,减少神经元细胞的死亡,这有望为急性脊髓损伤的治疗提供新思路,同时给NGF蛋白药物的研发做出新尝试。
唐浩帅[3]（2020）在《慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究》文中研究指明【目的】脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）后的神经功能恢复一直是困扰医学界的难题,其中轴突的再生和髓鞘化是突破这一难题的重要修复方式,本研究通过慢病毒介导音猥因子（Sonic Hedgehog,Shh）转染大鼠雪旺细胞,持续稳定分泌Shh因子,同时促进雪旺细胞的增殖活性以及分泌神经营养因子功能,移植稳定表达Shh因子的雪旺细胞于脊髓损伤部位,探讨Shh因子联合雪旺细胞在修复脊髓损伤中的作用及其发挥协同作用的相关机制,为细胞移植联合基因修饰促进SCI修复提供新策略。【方法】1.大鼠雪旺细胞的分离、培养和鉴定:本研究选取出生后3-5天的SD（Sprague Dawley）大鼠,在其坐骨神经中分离雪旺细胞（Schwann Cells,SCs）,通过双酶消化和差速贴壁对雪旺细胞进行分离、培养以及纯化,S-100免疫荧光对雪旺细胞进行鉴定。2.慢病毒转染雪旺细胞及筛选:构建p LVX-IRES-Puro-Shh慢病毒表达载体,将纯化后的雪旺细胞传代至6孔板中加入病毒工作液,转染成功后加入嘌呤霉素筛选出稳定表达Shh因子的雪旺细胞（S-SCs）。3.检测细胞活性及表达因子:利用MTT法进行细胞活性测定,绘制细胞生长曲线;多时间点ELISA法检测Shh因子及BDNF、NGF的表达水平的变化。4.动物模型的建立及移植后行为学评价:雌性SD大鼠（240±10g）,8周龄,采用Impactor Model II打击系统,建立脊髓挫伤模型,大鼠SCI后7天,在损伤部位进行移植。行为学评价包括SCI后当天以及SCI后12周内每隔2周对各组大鼠进行BBB评分,评估各组大鼠后肢功能的恢复情况。5.移植后损伤区域神经细胞改变:SCI后第12周,通过NF200标记轴突,损伤中心横切染色,观察脊髓损伤局部轴突改变情况;SCI后第2、12周,通过Nestin标记神经干细胞、Olig2标记少突胶质细胞前体细胞、GFAP标记星形胶质细胞,损伤中心横切染色,观察神经细胞的增殖和分化情况。6.移植后损伤区域白质和髓鞘改变:SCI后第2、12周,各组大鼠以损伤部位为中心进行横切,行甲苯胺蓝染色,高倍镜下观察损伤局部的白质和髓鞘改变。【结果】1.细胞形态与生长情况观察:经筛选后转染Shh因子的雪旺细胞符合典型雪旺细胞特征,S-100染色观察转染Shh因子雪旺细胞与正常细胞形态一致。纯化培养后光镜下观察各组雪旺细胞生长情况,S-SCs组细胞密度高于SCs组与V-SCs组,慢病毒转染后未对细胞生长产生负担。2.细胞增殖活性及表达因子检测:通过MTT法检测发现细胞增殖曲线为指数型,S-SCs组细胞增殖活性高于V-SCs组和SCs组,无负代谢影响,其差异具有统计学意义（P<0.05）;通过ELISA法进行不同时间点Shh、BDNF和NGF含量检测,S-SCs组明显高于SCs组和V-SCs组,可持续稳定分泌至第8周。3运动功能评价:脊髓损伤后12周内对动物进行BBB评分,各组大鼠后肢功能均有恢复,在损伤后第12周,与DMEM移植组和SCs移植组相比,S-SCs移植组BBB评分最高,其差异具有统计学意义（P<0.01）,S-SCs移植组更好的促进了大鼠后肢的运动功能恢复。4.移植后损伤区域神经细胞改变:免疫荧光染色结果显示,与SCs移植组组和DMEM移植组相比,S-SCs移植组的损伤中心NF200阳性细胞数最多（P<0.01）;在损伤后第2周和12周,免疫荧光染色结果显示损伤中心Nestin阳性细胞、损伤中心及周围白质的Olig2阳性细胞数,S-SCs移植组最多,SCs移植组和DMEM移植组较少（P<0.01）;损伤后第2周,损伤区域GFAP阳性细胞数DMEM移植组多于SCs移植组和S-SCs移植组（P<0.05）,至第12周S-SCs移植组GFAP阳性细胞数最少,其差异具有统计学意义（P<0.01）。5.移植后损伤局部白质和髓鞘的改变:在SCI第2周时,各组SCI中心白质区损伤严重;第12周时,DMEM组白质区域神经纤维结构不清,排列紊乱;而S-SCs组白质区域神经纤维结构清晰,可见囊性结构中有髓鞘出现,与DMEM组相比可明显改善SCI后损伤面积,减少慢性期的空洞形成。【结论】1.雪旺细胞通过慢病毒转染Shh基因后,能够持续、稳定表达Shh因子,提高雪旺细胞的增殖活性以及神经营养因子BDNF、NGF的表达水平,并且其效果具有长期稳定的特征。2.脊髓损伤局部移植持续稳定表达Shh因子的雪旺细胞,较单纯移植SCs或DMEM,可显着减少损伤区域胶质瘢痕形成,促进损伤区域轴突再生和髓鞘化,促进大鼠后肢功能恢复。3.Shh因子能够增强雪旺细胞的自身活性,并维持稳定表达,通过基因修饰手段将雪旺细胞与Shh因子联合,优势互补,产生协同作用,在损伤后激活内源性神经细胞,促进神经干细胞向少突胶质细胞方向分化,保护轴突并促进轴突的再髓鞘化,为基因修饰联合细胞移植修复脊髓损伤提供新策略。
陈茂华[4]（2014）在《HIF-1α基因及GDNF基因修饰神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究》文中认为研究目的：探讨经HIF-1α、 GDNF基因修饰的神经干细胞（NSCs）在大鼠脊髓内移植后,神经干细胞的存活和分化情况及其对动物运动功能恢复的影响。为脊髓损伤的基因治疗提供新思路及实验依据。研究方法：采用电控大鼠脊髓损伤打击装置制作SD大鼠脊髓损伤模型95只,25g·c（2.5cm×10g）力致伤T13脊髓,随机分为4组：正常对照（Normal）5只,脊髓损伤组（SCI）30只,神经干细胞移植组（NSC）30只, HIF-1α、GDNF双基因修饰的神经干细胞移植组（HIF-1α、GDNF+NSC）30只,分别于移植后5个时相点（1周、2周、3周、5周、8周）对大鼠进行BBB后肢功能评分和皮层体感诱发电位（cortical somatosensory evoked potential, CSEP）检查后,进行灌注固定,取损伤段脊髓做石蜡切片,运用HE染色、免疫组化、免疫双标检测等方法,通过观察移植处神经干细胞的标记物5-溴-2-脱氧尿苷（bromodeoxy uridine/5-bromo-2-deoxy uridine,BrdU）的表达,观察神经丝-200（NF-200）的表达和观察GFAP+BrdU、NF-200+BrdU双重染色的表达结果,分析HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞的存活、分化情况,进而分析HIF-1α、GDNF双基因修饰的NSC对脊髓损伤的修复作用。实验结果：1.H-E染色显示,损伤组脊髓损伤后损伤区及中央管内、灰质中不同程度出血,神经元变性,脊髓前索、侧索的轴索粗肿胀,坏死缺损区域形成；HIF-1α、GDNF双基因修饰神经干细胞组移植治疗后,出血、坏死等损伤性改变持续时间缩短,细胞残留数目相对增多,尼氏体增加,形态大致正常的细胞数目较多,相同时间点与其它组相比较差异明显。2.BrdU免疫组化染色结果发现,细胞移植组在细胞移植处,均有BrdU染色阳性细胞存在,表明移植细胞在宿主体内可以存活,比较单纯神经干细胞移植组与HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞移植组BrdU染色阳性细胞数,基因修饰组明显多于单纯神经干细胞组（P<0.05）,双基因修饰神经干细胞在宿主内存活的数量增加；免疫双标检测结果,在单纯神经干细胞移植组与HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞移植组均有GFAP+BrdU和NF-200+BrdU双染阳性细胞；分析双染阳性细胞数占所有BrdU染色阳性细胞数的比例,移植后同一时间点,HIF-1α、GDNF双基因修饰神经干细胞组神经干细胞分化率高于单纯神经干细胞组（P<0.01）；NF-200染色,正常组脊髓白质可见轴突阳性着色,排列整齐密集,损伤组NF-200阳性轴突灰度值降低；HIF-1α、GDNF基因修饰神经干细胞组与神经干细胞组相比,移植后相同时间,NF-200灰度值均明显增高,且前者高于后者差异明显（P<0.01）。3.CSEP检查结果：所有被检测大鼠受伤前均获得正常CSEP信号,包括1个负向波,潜伏期（17.1±0.5）ms,波幅（66.4±20.2）μV。受伤后各组动物CSEP信号均不同程度消失,潜伏期延长,GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞组从移植后第1周开始,大鼠CSEP信号开始出现恢复，但其波幅较伤前及正常组明显下降,潜伏期也明显延迟（P<0.05）,与单纯神经干细胞组和损伤对照组CSEP潜伏期恢复有明显差异（P<0.01）。4.所有手术组动物BBB评分,移植后BBB评分逐渐升高,移植后同一时间点,NSC+GDNF、 HIF-1α组评分高于SCI和NSC组,结果差异明显（P<0.01）。结论：1.GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞能在损伤脊髓内可以存活。2. GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞能在损伤脊髓内可以分化为神经元和神经胶质细胞。3. GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞移植较单纯神经干细胞移植可以增加干细胞的存活和分化。4. GDNF、HIF-1α基因修饰神经干细胞移植能促进脊髓损伤动物运动功能的恢复。5. GDNF、HIF-1αt基因修饰神经干细胞可以作为脊髓损伤修复的移植材料。
刘丽霞,王永成[5]（2011）在《神经干细胞转基因疗法与运动性脊髓损伤的治疗》文中研究说明背景:神经干细胞基因疗法的提出,给运动性脊髓损伤的修复与治疗提供了广阔的应用前景和挑战。目的:综述神经干细胞的增殖分化和基因调控促进运动性脊髓损伤恢复的效果。方法:应用计算机检索Medline数据库、维普数据库和清华同方数据库1991-01/2010-12有关神经干细胞疗法治疗运动性脊髓损伤的文献,以"neural stem cells,gene therapy,exercise spinal cord injury,gene modification,gene transfection"为英文检索词,以"神经干细胞,脊髓损伤,基因治疗"为中文检索词,排除重复性、陈旧性研究,对所得文献资料进行整理,运用归纳演绎等方法进行分析。结果与结论:神经干细胞的基因治疗能够通过其神经营养因子的修饰、增殖分化和移植技术,以替代坏死、凋亡的神经细胞,并在损伤区域分泌大量的神经营养因子,达到改善局部微环境,促进神经通路的重建、新生神经元的增殖等促进运动性脊髓损伤的再生与修复。同时,神经干细胞基因治疗运动性脊髓损伤还面临着巨大的考验,包括神经干细胞基因治疗技术的成熟性、转基因后的稳定高效表达性等相关问题还没有得到很好的解决,仍需要不断的进行基础性研究和临床实验。
刘佳[6]（2010）在《细胞移植治疗脊髓损伤的优化方案及PDGF-B在脊髓修复中的作用》文中认为【目的】建立三种干细胞即神经干细胞（NSC）、骨髓问充质细胞（BMSC）和造血干细胞（HSC）,及两种支持细胞即嗅鞘细胞（OEC）和雪旺细胞（SC）的体外培养技术,并将两种支持细胞分别和三种干细胞分别联合移植入SD大鼠和猴损伤的脊髓,筛选出细胞联合移植治疗SCI的优化方案,并探讨与其相关的分子表达,找出相对重要的调节分子,研究该分子在SCI中的作用。为寻找细胞移植治疗SCI的有效方法和相关的分子机制提供实验依据,为指导临床应用干细胞移植治疗SCI提供新思路。【方法】1.建立嗅鞘细胞、雪旺细胞、神经干细胞、骨髓间充质细胞和造血干细胞的体外培养技术,并对培养细胞进行鉴定。2.建立SD大鼠脊髓T10全横断损伤模型。将动物分假手术组、单纯脊髓全横断手术组、脊髓全横断手术注射免疫抑制剂组,NSC移植组、BMSC移植组、HSC移植组、SC细胞移植组,OEC移植组,以及NSC+OEC,BMSC+OEC,HSC+SC联合移植组。术后14d沿原切口暴露损伤脊髓,选取距离瘢痕5mm的脊髓上下端和瘢痕各取左右两个位点（脊髓上下端旁开脊髓后正中沟0.5mm,瘢痕处的左右侧位点参照脊髓上下端的左右位点定位）,共6个位点用立体定向仪进行细胞移植（1.0×105/5uL,每个位点）。用5mg/kg/天腹腔注射环孢素（CsA）以减轻细胞移植后的免疫排斥反应。3.后肢运动功能评分:移植术后1～24周,采用双盲法由三名观察人员每周末进行大鼠后肢BBB运动功能评分。最后将三人所得分值求平均分后进行统计学处理。筛选出促进脊髓损伤功能恢复最好的一组为NSC+OEC联合移植组。4.神经电生理检测:对NSC+OEC联合移植组,及其相应对照组进行神经电生理检测,进一步探讨NSC+OEC联合移植组促进SCI的实验依据。（1）运动诱发电位（MEP）的测定采用了神经电生理经颅磁刺激器对NSC+OEC联合移植组14d组,及其对照组假手术组、脊髓全横断手术注射免疫抑制剂组、NSC移植组和OEC移植组的MEP进行检测。3.6%水合三氯乙醛麻醉固定动物后,用盘状电极通过导电膏粘附于大鼠耳朵作为地线,记录电极置于大腿股四头肌,正负电极间距1cm,磁力板中心置于大脑皮质运动区之上刺激大脑皮质,以刺激强度40%刺激大脑皮质,记录股四头肌收集到得电位变化,待波形稳定且重复3次时中止并描记结果。（2）皮层体感诱发电位（CSEP）的测定本实验采用了皮层体感诱发仪（MEDTRONIC公司产品-KEYPOINY）对移植14d的NSC+OEC联合移植组,及其对照组假手术组、脊髓全横断手术注射免疫抑制剂组、NSC移植组和OEC移植组进行了检测。电流为方波脉冲型,刺激电极置于大鼠左下肢胫后神经处,正负电极间距为1cm,参考电极置于大鼠鼻正中皮下,记录电极置于大鼠右侧大脑皮层处皮下,接地电极置于大鼠耳朵。参数设置:扫描速度10ms/D,灵敏度10uv/D,滤波低频10Hz,滤波高频2KHz,刺激强度以引起大鼠后爪抖动为止。每次均记录300次波形后将其叠加平均得到最终的检测结果。5.植入细胞存活检测:在第12和24W末取部分动物用3.6%的水合氯醛进行腹腔注射麻醉,4%的多聚甲醛灌注固定后取材、冰冻切片,荧光显微镜下观察植入细胞存活,迁移。6.PCR扩增疤痕组织的神经营养因子及其受体,和凋亡相关因子:将14d、21d、28d的各组全横断脊髓（手术注射免疫抑制剂组、NSC移植组、OEC移植组和NSC+OEC联合移植组）活体取出疤痕部位及临近组织,匀浆、裂解、提取总RNA、逆转录合成cDNA,进行神经营养因子NGF、BDNF、NT-3、CNTF、PDGF-B、IGF-1、bFGF、TGF-β1,及其受体TrkA、TrkB和TrkC,和凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3及内参照β-actin的PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。测光密度值,进行统计学分析,筛选出有变化的因子。推测其中与SCI有关的重要分子。7.用高等动物灵长类猴验证NSC+OEC联合移植治疗SCI的效果:建立恒河猴半横断SCI模型。动物分半横断手术注射免疫抑制剂组、NSC移植组、OEC移植组和NSC+OEC联合移植组。通过运动功能评分（1-9周）,神经电生理和核磁共振检测（1月）,和形态学观察来阐明NSC+OEC联合移植对SCI的促进作用。8.选择通过PCR扩增后确定的疤痕组织内有变化的PDGF-B作为切入点:通过免疫组化,RT-PCR,Western Blot,细胞培养,RNA干扰,抗体封闭等技术来研究PDGF-BB在SCI中的作用和可能的作用机制。【结果】1.本实验成功建立了OEC、SC、NSC、BMSC和HSC的体外培养方法,并进行了鉴定。2.运动功能评分:所有大鼠脊髓全横断后,双侧后肢完全瘫痪,不能排尿。大鼠靠前肢拖动身体前行。1周末时,手术损伤组大鼠双后肢开始出现1个后肢关节（踝关节）的轻微活动。细胞移植组则开始出现1或2个后肢关节轻微活动（多为膝关节或/和踝关节）。在第2周末时,手术损伤组和细胞移植组大鼠在细胞移植后排尿障碍均较第1周末时稍有好转,膀胱残余尿仍较多,手术损伤组部分大鼠开始出现2个后肢关节的轻微活动,而细胞移植组部分大鼠开始出现1或2个后肢关节大幅运动。各细胞移植组的大鼠BBB评分在整个恢复的过程中均有明显的提高,但变化最明显的的就是OECs+NSCs组。说明OEC+NSC移植对运动功能恢复明显改善。3.神经电生理感觉和运动诱发电位检测3.1 CSEP检测N1波变化:脊髓全横断组没有测到波形,潜伏期无限延长,与假手术组比较差异显着;说明手术切断脊髓后上行传导通路明显受损。细胞移植后,OEC、NSC移植组均分别能测到N1波,其与SCI组相比较,有显着性统计学差异（P=0.001,≤0.001、P=0.045,＜0.05）。但OEC+NSC移植组分别与OEC组和NSC组比较,均无统计学差异（P=0.720、0.323,＞0.05）。说明OEC+NSC移植对感觉神经生理功能恢复改善不明显。P1波变化:脊髓全横断组亦没有测到波形,说明潜伏期无限延长,与假手术组比较差异显着;然而OEC、NSC移植组能测到P1波,其与SCI组完全消失的情况相比较,差异显着,P=0.001,≤0.001;然而,需注意的是,仅OEC移植组P1波的潜伏期较与假手术组比较明显延长,有统计学差异;而NSC移植组P1波的潜伏期与SCI组相比较,P=0.069,＞0.05,无统计学差异;OEC+NSC移植组P1波的潜伏期与OEC组和NSC组的相比较,P值分别为0.688、0.247,＞0.05,无统计学差异。进一步说明OEC+NSC移植对感觉神经生理功能恢复改善不明显。3.2 MEP检测:本实验中,假手术大鼠均能测到明显的诱发电位,这种诱发电位的波幅为均值在6mv左右,潜伏期5ms左右。而SCI后,波幅和潜伏期均测不到,MEP消失。但给予NSC或者OEC移植后,均能测到MEP。只是其潜伏期有些延长（说明传导速度减慢）,且恢复波幅明显降低（说明突触功能受损）。细胞联合治疗对MEP没有明显影响。4.植入细胞的存活:脊髓切片上可见到GFP标记的绿色荧光细胞。而联合移植组脊髓既可见绿色荧光细胞,又可见Hochest33342标记的细胞核。标记细胞在损伤脊髓瘢痕,及其上段、下端均可见到。说明移植细胞向头、尾侧迁移,并在宿主脊髓存活。5.PCR扩增疤痕组织的神经营养因子及其受体,和凋亡相关因子的表达变化发现:①在疤痕组织中均未检测到BDNF、NT-3、bFGF、TrkA、TrkB表达;②NGF各时间点均没有变化。③凋亡基因变化:Bcl-2:在联合移植21d时与NSC移植组比较明显降低,P=0.011,＜0.05,差异有统计学意义;Caspas-3:联合移植组在14d与NSC移植组、OEC移植组相比较,明显增加（P=0.039、0.032,＜0.05）,差异有显着统计学意义;但至在21d时,联合移植组与NSC移植组比较Caspas-3表达明显减P=0.006,＜0.01,差异有显着统计学意义;在28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。Bax在联合移植组14d时与NSC移植比较,明显增加,P=0.031,＜0.05,差异有统计学意义;但至21d时,联合移植组与手术组比较明显减少,P=0.040,＜0.05,差异有统计学意义;在28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。④NTF变化:CNTF在联合移植14d时,与OEC移植组及NSC移植比较表达明显增加,P值分别为0.007、0.001、0.023,均＜0.05,差异有显着统计学意义;在21d,联合移植组与NSC移植组比较明显减少,P值为0.000,＜0.01,差异有显着统计学意义;在28d,联合移植组与OEC移植组、NSC移植组比较均明显减少,P值分别为0.028、0.028,均＜0.05,差异有显着统计学意义。IGF-1:在14d时,联合移植组与OEC移植组及NSC移植比较,明显增加,尸值分别为0.003、0.001,均＜0.05,差异有显着性统计学意义;而在21d和28d时,各处理方式之间比较,差异均无统计学意义;PDGF-B:在14d时,联合移植组、OEC、NSC移植与手术组比较,明显减少,P=0.044,＜0.05,差异有统计学意义;联合移植组与NSC移植比较,明显减少,P=0.047,＜0.05,差异有统计学意义。在21d时,联合移植组与NSC移植组、OEC移植组及手术组比较明显减少,P=0.039、0.039、0.031,＜0.05,差异有统计学意义。在28d时,联合移植组与OEC移植组之间比较显着减少,P=0.011,＜0.05,差异有统计学意义。TGF-betal:在14d时,联合移植组与NSC移植组、OEC移植组和手术组比较明显增加,p=0.001、0.019、0.001,＜0.05,差异有统计学意义;而在21d和28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。Trkc:在14d时,联合移植组与NSC移植组比较,明显降低,P值分别为0.031,＜0.05,差异有统计学意义;在21时,联合移植组与手术组比较（P=0.015,＜0.05）,和NSC移植组比较（P=0.010,＜0.05）。差异有统计学意义,而在28d时,各处理方式之间比较,差异无统计学意义。可以看出,PDGF-B是细胞移植促进损伤脊髓修复中变化最明显的分子,提示其可能是细胞移植改进功能可塑性相关的重要分子。6.OEC+NSC移植对恒河猴SCI功能恢复的影响6.1后肢运动功能评分:改良的Tarlov’s Method评分结果显示损伤侧、细胞联合移植侧评分均较假手术组明显降低,有统计学差异（P＜0.05）。第1周、第2周、第3周、第4周、第7周,OEE+NSE移植细胞联合移植侧Tarlov’s Method评分均明显高于损伤侧评分,均有统计学意义（P＜0.05）。6.2移植细胞在宿主脊髓存活和迁移情况:在宿主脊髓可观察到大量荧光细胞,向头端或尾端迁徙;说明移植细胞在宿主脊髓存活,迁移。6.3神经电生理:CSEP:SCI后各组动物的CSEP信号均消失。损伤侧N1波波幅明显低于损伤对侧,有统计学差异（P＜0.05）;而NSC联合OEC细胞移植1个月,细胞联合移植侧N1波幅明显高于损伤侧,有统计学意义（P＜0.05）;MEP:SCI后各动物MEP信号均消失。而细胞移植1个月能检测到MEP,只是损伤侧损伤平面以下节段MEP的波幅明显低于损伤侧损伤平面以上节段的MEP波幅,有统计学差异（P＜0.05）;而损伤侧与细胞联合移植侧测得的波幅相比较没有明显差异,没有统计学意义（P＞0.05）。比较之,损伤侧损伤平面以上节段测得的潜伏期较损伤侧损伤平面以下节段测得波幅明显延长,有统计学差异（P＜0.05）;而细胞联合移植测得的潜伏期较损伤侧测得的潜伏期明显缩短,有统计学差异（P＜0.05）。6.4 MRI:脊髓左侧半横断+细胞移植瘢痕横切面积明显小于单纯脊髓左侧半横断组脊髓损伤对照节段面积,有统计学差异（P＜0.05）;而脊髓损伤上1节段和损伤下1阶段脊髓横切面面积无明显差异,均没有统计学差异（P＞0.05）。7.PDGF-B在大鼠脊髓全横断损伤后的变化和作用研究:SCT后1天直至损伤后28天,PDGF-B蛋白质和mRNA在损伤脊髓中明显上调。PDGF-B免疫反应的产物分布在疤痕星型胶质细胞中。同时星型胶质细胞明显增值,疤痕组织内的PDGF-B信号分子转录激活因子3（STAT-3）的上调相一致。通过PDGB-B抗体封闭和iRNA对PDGF-B活性分别在蛋白水平和基因水平进行阻断和干扰,导致以下几方面的显着改变:（1）显着下调了PDGF-B下游信号分子的水平;（2）显着减少了星形细胞胶质增生和疤痕的形成;（3）增加轴突再生和出芽;（4）后肢运动功能和感觉功能的显着改善。【结论】1本实验通过不同的细胞组合治疗方法,在低等啮齿类动物SD大鼠和高等灵长类动物恒河猴SCI模型上证明了NSC联合OEC移植能够最有效促进损伤脊髓的运动功能恢复。是目前较为乐观的有效策略。移植细胞能够在大鼠和猴损伤脊髓长时间存活、迁徙。NSC联合OEC移植作为一种治疗SCI的有效方法,具有潜在的临床应用价值。2 NSC联合OEC移植有效促进损伤脊髓的运动功能恢复与多种细胞因子的表达调节有关。其中PDGF-B是较重要的分子。3 PDGF-B蛋白和基因干扰,能显着减少了星形胶质增生,抑制疤痕形成,促进轴突再生,并改善后肢运动功能。从而证明PDGF在SCI修复中是一个关键的调节分子。
李云[7]（2010）在《NSC和OEC联合移植对SCT大鼠大脑皮质运动区神经元的作用及相关机制研究》文中研究说明【目的】探讨NSC和OEC联合移植对脊髓全横断损伤大鼠的运动功能及大脑皮质运动区神经元的保护作用,并探讨其作用机制。【方法】采用细胞培养、免疫组织化学、TUNEL法、蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链式反应等技术,结合动物行为学观察（BBB评分及运动诱发电位检测）,研究全横断脊髓损伤及NSC和OEC联合移植后,损伤大鼠运动功能的变化、大脑皮质运动区神经元的存活与凋亡、相关凋亡基因表达变化及其信号转导分子的调节。【结果】1.T9全横断脊髓损伤后,大鼠后肢运动功能完全丧失,随时间延长,有一定的（甚至无）自发性恢复,但此种自发性恢复能力非常有限。在脊髓全横断损伤后的1～4周的各个时间点,手术组大鼠BBB评分明显低于假手术组（P＜0.001）。术后4周,手术组80%的大鼠未检测到MEP,20%的大鼠检测到波幅极低的MEP波形;假手术组MEP检出率为100%,波幅、潜伏期正常。细胞凋亡TUNEL检测显示:术后2周,手术组大脑皮质V层TUNEL阳性细胞数较假手术组增多（P＜0.05）。免疫组化结果表明:术后4周,手术组大脑皮质V层NeuN阳性细胞数较假手术组减少（P＜0.05）;同时,手术组Bax和Caspase-3的阳性细胞数较假手术组明显增多（P＜0.05）,而Bcl-2两组相比无统计学差异（P＞0.05）。RT-PCR结果显示:大脑皮质运动区Bax的表达在手术组各时间点与假手术组比较均无差异（P＞0.05）;而Bcl-2的表达术后14天和28天较假手术组明显减少（P＜0.05）;Caspase-3则在术后3天较假手术组表达高（P＜0.05）,其他时间点接近假手术组水平。2.从细胞移植术后第3周末开始,NSC和OEC联合移植组大鼠后肢运动功能的恢复明显优于单纯全横断组（P＜0.05）;三个细胞移植组大鼠的BBB评分在整个恢复过程中均有明显的提高,其中NSC和OEC联合移植组的BBB分值在第3周末高于NSC移植组和OEC移植组,在第4周末高于NSC移植组（P＜0.05）;NSC移植组和OEC移植组的BBB评分在移植术后第4周末高于单纯全横断组（P＜0.05）。细胞移植术后4周,各细胞移植组均有不同程度的MEP波幅,但均明显低于假手术组（P＜0.01）;NSC和OEC联合移植组的所有受试动物均检测到MEP波形,检出率达100%,NSC和OEC单独移植组MEP检出率均为50%。细胞移植后2周,假手术组和各细胞移植组大鼠大脑皮质V层TUNEL阳性染色细胞较单纯全横断手术组少（P＜0.05）;联合移植组较OEC移植组细胞凋亡数少（P＜0.05）。细胞移植术后4周,免疫组化结果显示:尽管全横断损伤组、NSC和OEC单独移植组的NeuN阳性细胞数较假手术组明显减少（P＜0.05）,而NSC和OEC联合移植组与假手术组相比却无明显差异（P＞0.05）,说明细胞联合移植可减轻皮质运动神经元的凋亡。结果还发现:联合移植组大脑皮质V层抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数较各对照组多（P＜0.05）;而联合或单细胞移植组促凋亡基因Bax阳性细胞数均较手术组减少（P＜0.05）;Caspase-3阳性细胞数仅联合移植组和OEC移植组较手术组减少,且联合移植组较两种细胞单一移植组减少明显（P＜0.05）。RT-PCR检测发现:NSC和OEC联合移植后3天,Bax mRNA的表达较NSC移植组增多,但较OEC移植组降低（P＜0.05）;而在联合移植后14天和21天,Bcl-2的表达较OEC移植组增高（P＜0.05）;Caspase-3的表达在移植后3天和7天较手术组表达降低（P＜0.05）,移植后14天,较NSC移植组表达降低（P＜0.05）。3.信号通路分子RT-PCR检测显示:细胞移植术后3天,联合移植组、OEC移植组和手术组大脑皮质运动区PKB mRNA的表达均明显高于NSC移植组（P＜0.05）,手术组还较假手术组表达高（P＜0.05）;而术后14天,NSC移植组PKB mRNA的表达明显回升且显着高于OEC移植组（P＜0.05）;移植术后21天,NSC和OEC联合移植组PKB mRNA的表达较NSC移植组和OEC移植组高（P＜0.05）,其中,OEC移植组还低于手术组和假手术组（P＜0.05）。术后7天和28天,各组比较无差异（P＞0.05）。比较之,单独和联合移植术后ERK1mRNA的表达在各时间点均较假手术组和手术组明显减低（P＜0.01）;且术后3天,NSC移植组高于OEC移植组和联合移植组（P＜0.01）。Stat-3 mRNA的表达则表现为细胞移植术后3天,联合移植组和OEC移植组较假手术组及手术组表达高（P＜0.05）;移植术后14天手术组较假手术组降低（P＜0.05）,而各细胞移植组均较手术组明显升高（P＜0.05）;在细胞移植术后21天,各细胞移植组Stat-3的表达均较假手术组降低（P＜0.05）;而在移植术后28天,NSC移植组Star-3较假手术组和联合移植组表达增高（P＜0.05）。进而,Western-blot检测结果发现:移植术后14天,联合移植组Akt非磷酸化蛋白、ERK1/2磷酸化蛋白的表达均比手术组和假手术组高,且Akt非磷酸化蛋白在NSC移植组比手术组表达高（P＜0.05）。联合移植组非磷酸化Stat-3的表达较假手术组、手术组、NSC移植组表达高（P＜0.05）;Akt磷酸化蛋白、Stat-3磷酸化蛋白和ERK1/2非磷酸化蛋白的表达各组间比较均无差异（P＞0.05）。4.体外共培养显示:NSC和OEC共培养7天,联合培养组NeuN阳性细胞数较NSC单独培养组多（P＜0.05）,而未分化的Nestin阳性细胞较单独培养组低（P＜0.05）;GFAP和APC阳性细胞分化率两组比较无差异（P＞0.05）。提示OEC可能促进NSC向神经细胞分化。【结论】1.脊髓全横断损伤后可能有部分自主运动功能恢复,但非常有限,需要寻找有效的治疗措施;脊髓全横断损伤引发大脑皮质运动区神经元凋亡基因表达失控,进而导致细胞凋亡,因此,脊髓损伤的研究必须考虑到脊髓自身以外的损害,特别是大脑皮质。2.NSC和OEC作为两种有用的“种子”细胞,其单独和联合移植能有效促进脊髓损伤大鼠运动功能部分恢复,且联合移植优于单细胞移植。3.NSC和OEC联合移植发挥作用的机制可能涉及:①OEC能促进NSC的增殖和向神经元分化;②减少大脑皮质运动区神经元凋亡;③促进抗凋亡因子Bcl-2的基因和蛋白质表达;④调节ERK1/2信号转导通路。
梁袁昕[8]（2009）在《神经营养因子-3基因修饰的神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤》文中研究指明目的：研究神经营养因子-3（NT-3）修饰的胚胎脊髓来源的神经干细胞移植对于脊髓损伤的治疗作用。方法：构建NT-3基因真核表达载体pEGFPN1-NT-3后，应用核转染技术将其转入神经干细胞内建立NT-3基因修饰的神经干细胞。比较脊髓损伤后不同时间神经干细胞移植的治疗效果，确定脊髓损伤后进行神经干细胞移植的最佳时间。在NT-3修饰的神经干细胞移植入脊髓损伤大鼠后，通过行为学测试，及对损伤脊髓局部移植细胞存活、分化及基因表达的分析，综合评价NT-3修饰的神经干细胞治疗大鼠脊髓损伤的效果。结果：动物行为学实验研究结果表明：与未修饰的神经干细胞移植相比，NT-3基因修饰的神经干细胞移植更能显着改善脊髓损伤大鼠的脊髓功能。免疫组织化学实验研究结果表明：NT-3修饰能使更多的移植细胞存活，并能促进移植的神经干细胞向少突胶质细胞分化。分子生物学实验研究结果表明：NT-3基因修饰的神经干细胞移植后能更好的表达NT-3和MBP。结论：NT-3修饰的神经干细胞移植治疗脊髓损伤具有良好效果，治疗效果优于未修饰的神经干细胞，具有广阔的应用前景。第一部分载体构建目的：构建将NT-3基因真核表达载体pEGFPN1-NT-3。方法：将NT-3基因编码序列克隆入pMD19-T Simple载体；经鉴定确认后，将NT-3基因CDS克隆至真核表达载体pEGFPN1。结果：重组质粒pEGFPN1-NT-3双酶切鉴定与预期结果相同。结论：NT-3基因真核表达载体pEGFPN1-NT-3构建成功。第二部分细胞培养目的：对胚胎脊髓神经干细胞进行稳定的培养。方法：从孕鼠中分离胚胎14天的脊髓组织，培养胚胎脊髓神经干细胞，传代并进行多能性检测。结果：胚胎脊髓神经干细胞神经球形成，并且Nestin阳性。结论：胚胎脊髓神经干细胞培养成功并保持干细胞多能性。第三部分基因修饰目的：构建EGFP标记NT-3基因修饰的神经干细胞。方法：采用核转染将重组质粒pEGFPN1-NT-3转染至大鼠胚胎脊髓神经干细胞后，采用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学方法对转染后的细胞进行鉴定。结果：RT-PCR和Western blot显示转染后细胞NT-3表达强阳性，免疫细胞化学染色结果显示转染后细胞呈NT-3及EGFP阳性。结论：FGFP标记NT-3基因修饰的神经干细胞构建成功并能表达NT-3和EGFP。鼠右侧半脊髓，术后观察大鼠行为学表现并进行行为学测试。结果：脊髓损伤后大鼠右侧后肢瘫痪，损伤后4周时大鼠右侧后肢BBB评分不足2分、网格测试经常摔倒。结论：胸9水平脊髓半切大鼠动物模型建立成功。第五部分细胞移植（一）目的：确定脊髓损伤后神经干细胞的最佳移植时间。方法：比较脊髓损伤后不同时间神经干细胞移植对于大鼠行为功能恢复的治疗效果，确定治疗效果最佳的神经干细胞移植时间。结果：脊髓损伤后3天、7天及14天进行移植大鼠的BBB测试和网格测试结果明显优于对脊髓损伤大鼠，脊髓损伤后7天时进行细胞移植的治疗效果最佳。结论：进行神经干细胞移植的最佳时间为脊髓损伤后一周左右。第六部分细胞移植（二）目的：研究NT-3修饰的胚胎脊髓来源的神经干细胞移植对于脊髓损伤大鼠行为学恢复的治疗作用。方法：采用行为学测试评价NT-3修饰的神经干细胞移植后脊髓损伤大鼠的行为学恢复，并与未修饰的神经干细胞移植的治疗效果进行比较。结果：神经干细胞移植组和NT-3修饰的神经干细胞移植组大鼠的BBB测试结果和网格测试结果明显优于对照组大鼠，NT-3修饰的神经干细胞移植的治疗效果最佳。结论：NT-3修饰能够促进神经干细胞移植对于脊髓损伤大鼠行为学恢复的治疗作用。第七部分细胞检测目的：研究NT-3修饰的胚胎脊髓来源的神经干细胞移植后细胞的存活、分化及基因表达情况。方法：采用免疫组织化学检测NT-3修饰的神经干细胞移植后细胞的存活及分化情况；采用分子生物学技术检测相关基因的表达；并与未修饰的神经干细胞移植进行比较。结果：免疫细胞化学染色表明NT-3修饰的神经干细胞能更好的在损伤脊髓内的存活，分泌NT-3并向少突胶质细胞分化；分子生物学检测表明NT-3修饰能在转录水平和蛋白水平增强NT-3和MBP的表达。结论：NT-3修饰能够促进神经干细胞移植后移植细胞的存活、分化及相关基因表达。
王涛[9]（2008）在《TLX基因对大鼠真皮多能干细胞增殖和成神经细胞分化及移植治疗脊髓损伤的影响研究》文中认为TLX基因最初是作为一个“孤儿”核受体发现的,其功能不明。但近来研究结果表明,TLX基因在神经系统发育过程中具有重要意义,是维持成体干细胞增殖和成神经分化的关键基因。脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）后神经细胞再生能力不足是影响损伤脊髓功能恢复的关键,神经细胞的再生问题一直是困扰神经科学工作者的大难题。目前可用于治疗脊髓损伤的种子细胞来源主要包括:胚胎来源干细胞;来源于神经系统的具有促神经再生作用的细胞;其他具有成神经分化潜能的成体干细胞。胚胎干细胞具有分化全能性和无限增殖的能力,进行成神经诱导分化后用于脊髓损伤治疗时具有替代受损神经元、重建神经元回路的作用,但考虑到伦理学、法律学、组织相容性以及胚胎的来源等难题,其临床应用目前还受到限制。多种来源于神经系统的细胞在脊髓损伤时可作为种子细胞,具有促神经功能恢复作用,但这些细胞在成年个体中数量较少,增殖能力较为有限,并且取材困难,行自体移植时尤为明显;而进行异体移植则要面临组织相容性和免疫相斥等难题。近来多种具有成神经分化潜能的间充质干细胞在脊髓损伤中的研究受到了关注,并有望为脊髓损伤治疗提供新的种子细胞来源。因此,研究真皮多能干细胞高效定向成神经分化的机制及调控将为解决脊髓移植供体细胞来源探索新的途径。基因治疗也是一种促进脊髓损伤再生的有希望的措施,基因修饰DMSCs移植则是结合了两者的优点。为了确定TLX基因对DMSCs增殖和成神经细胞分化的影响以及TLX基因工程化DMSCs对SCI后神经再生和功能修复的影响,本文就此进行了系列研究。⑴大鼠TLX基因的克隆及含TLX基因的全长编码序列的真核表达载体的构建和表达;⑵观察大鼠TLX基因对DMSCs的增殖和成神经分化的影响;⑶将TLX基因修饰DMSCs移植到大鼠脊髓全横断模型的损伤部位,观察移植物能否促进脊髓功能的恢复,来阐明TLX基因修饰DMSCs在SCI恢复中所起的作用。希望通过移植物（TLX基因修饰DMSCs）恒定表达TLX,使移植区具有高浓度的TLX,通过TLX高效、定向诱导DMSCs分化为神经细胞,可能为SCI再生修复提供更合适的种子细胞。主要结果如下:1、利用设计合成的TLX简并引物,以成年大鼠大脑组织总RNA为模板,进行RT-PCR,我们首次成功扩增出大鼠TLX全长编码序列,序列在线BLAST发现,其与大鼠预测的TLX序列99%相似,证实扩增和克隆成功,将大鼠TLX序列登陆GeneBank,获得Gene accession number:EU316216。2、利用RT-PCR的产物,采用定向克隆的方法,先进行T/A克隆,然后成功地将TLX cDNA全长序列亚克隆到pEGFPN1真核表达载体上。在此基础上,将重组质粒pEGFPN1-TLX转染到DMSCs中,用荧光显微镜下观察到荧光蛋白的表达和用RT-PCR方法检测到TLXmRNA的表达,说明TLX已成功转染DMSCs并能在DMSCs中表达。3、MTT法研究显示TLX可以促进DMSCs的增殖;DMSCs经诱导后可分化成神经细胞,分化出来的细胞中,星形胶质细胞的比例较高,而神经元比例较低。TLX可以促进DMSCs向神经元方向分化,TLX/DMSCs分化出来的细胞中,与未转染TLX的DMSCs相比,神经元的比例明显增高,而星形胶质细胞比例降低。4、将DMSCs和TLX基因修饰DMSCs移植入大鼠脊髓全横断处,结果显示DMSCs和TLX基因修饰DMSCs都能在宿主脊髓内存活和整合,并使脊髓形态学结构达到部分恢复;行为学检测检测显示大鼠脊髓运动功能得到部分恢复,其中移植TLX基因修饰DMSCs使大鼠的功能恢复更好一些。综上所述,我们首次成功的地扩增出大鼠TLX基因并构建了含TLX基因全长编码序列的真核表达载体。进一步研究显示TLX基因可以促进DMSCs增殖和向神经元方向分化,抑制DMSCs向星形胶质细胞的分化;移植TLX基因修饰DMSCs可以促进大鼠脊髓损伤后功能和形态的部分恢复,表现为行为学评分明显增高、损伤区空洞和瘢痕面积缩小和通过损伤区的神经纤维数量增多,与移植单纯DMSCs相比较,移植TLX基因修饰的DMSCs治疗效果要显着一些。结果提示TLX基因可能通过提高DMSCs向神经元分化而抑制星形胶质细胞的产生、减少胶质瘢痕形成具有促进脊髓损伤后神经再生和功能重建的作用,为临床治疗脊髓损伤提供新思路。
赵宁,杨万章[10]（2007）在《神经干细胞移植在脊髓损伤修复中的应用进展》文中提出
二、NOV基因修饰神经干细胞移植对损伤大鼠脊髓功能恢复的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NOV基因修饰神经干细胞移植对损伤大鼠脊髓功能恢复的影响（论文提纲范文）
（1）NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要操作仪器 |
| 2.1.4 主要溶剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织来源、细胞提取和培养 |
| 2.2.2 NSCs的传代培养 |
| 2.2.3 OECs培养 |
| 2.2.4 NSCs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.5 OECs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.6 细胞活力测定 |
| 2.2.7 细胞冻存 |
| 2.2.8 细胞复苏 |
| 2.3 动物实验及样本检测 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要仪器 |
| 2.3.4 主要试剂配制 |
| 2.3.5 庆大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法 |
| 2.3.6 实验动物分组及给药 |
| 2.3.7 ABR检测大鼠听力阈值 |
| 2.3.8 听觉耳动反射检测 |
| 2.3.9 制作切片 |
| 2.3.10 切片染色 |
| 2.3.11 耳蜗免疫荧光染色 |
| 2.3.12 TUNEL法(原位切口末端标记法)检测凋亡细胞 |
| 2.3.13 免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞 |
| 2.3.14 Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达 |
| 2.4 统计方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 细胞的形态观察及鉴定 |
| 3.1.1 NSCs的培养观察及鉴定 |
| 3.1.2 OECs的培养观察和鉴定 |
| 3.2 各组大鼠体重变化结果 |
| 3.3 大鼠听觉耳动反射检测阈值结果 |
| 3.4 各组大鼠ABR阈值变化结果 |
| 3.5 HE染色结果 |
| 3.6 耳蜗免疫荧光染色观察结果 |
| 3.6.1 耳蜗荧光标记NSC结果 |
| 3.6.2 荧光标记OEC观察结果 |
| 3.7 TUNEL法检测凋亡细胞结果 |
| 3.7.1 各组TUNEL阳性细胞数比较 |
| 3.7.2 各组MOD值比较 |
| 3.8 免疫组化检测结果 |
| 3.9 Western-blot检测各组蛋白表达水平结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 实验性感音神经性耳聋动物模型的制备与机制探究 |
| 4.2 神经营养因子减轻SNHL内耳神经损伤后相关机制 |
| 4.2.1 BDNF对 SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.2.2 NT-3对SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.3 细胞移植抑制耳蜗损伤细胞凋亡机制探索 |
| 4.3.1 Caspase结构、功能与促耳蜗细胞凋亡机制探究 |
| 4.3.2 Bcl-2 结构、功能和抗耳蜗细胞凋亡机制探析 |
| 4.3.3 细胞联合移植激活Bcl-2,抑制Caspase、Bax表达路径保护损伤耳蜗细胞探究 |
| 4.4 细胞联合移植上调神经营养因子,抑制细胞凋亡 |
| 4.5 神经性耳聋常见病因概述 |
| 4.6 神经性耳聋治疗方法概述 |
| 4.7 关于NSC和 OEC的取材、培养与鉴定探究 |
| 4.7.1 NSC的组织取材和分离 |
| 4.7.2 NSC的培养和鉴定方法选择 |
| 4.7.3 OECs的组织取材和分离 |
| 4.7.4 OECs的培养与鉴定选择 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（3）慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、慢病毒介导Shh因子转染雪旺细胞的体外研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验对象 |
| 1.1.2 实验仪器与试剂 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 雪旺细胞的分离培养和转染后形态学观察 |
| 1.2.2 MTT法检测细胞增殖活性 |
| 1.2.3 ELISA 法检测细胞 Shh 和神经营养因子 BDNF 及 NGF 的表达 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 Shh因子促进雪旺细胞增殖及增强分泌活性的机制 |
| 1.3.2 Shh因子的表达及其通路在脊髓损伤中的作用 |
| 1.4 小结 |
| 二、转Shh因子的雪旺细胞移植修复脊髓损伤 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验分组 |
| 2.1.3 实验仪器与试剂 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大鼠行为学功能评价 |
| 2.2.2 大鼠损伤后局部的轴突改变 |
| 2.2.3 大鼠损伤后局部神经干细胞的改变 |
| 2.2.4 大鼠损伤后局部少突胶质细胞的改变 |
| 2.2.5 大鼠损伤后局部星形胶质细胞的改变 |
| 2.2.6 大鼠损伤后局部白质和髓鞘的改变 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 雪旺细胞在修复脊髓损伤中的作用 |
| 2.3.2 Shh 因子联合雪旺细胞移植对损伤局部内源性神经细胞的影响 |
| 2.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 细胞移植在脊髓损伤中的现状与展望 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）HIF-1α基因及GDNF基因修饰神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 序言 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 胶质细胞源性神经营养因子体外转染神经干细胞的研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 附图 |
| 1.7 小结 |
| 第二部分 HIF-1α、GDNF基因修饰的神经干细胞移植在大鼠损伤脊髓内的存活和分化的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间所取得的科研成果 |
（5）神经干细胞转基因疗法与运动性脊髓损伤的治疗（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 资料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 运动性脊髓损伤的分析 |
| 2.2.1 神经干细胞作为基因治疗的载体 |
| 2.2.2 神经干细胞增殖分化基因调控促进运动性脊髓损伤的修复 |
| 2.2.3 神经干细胞的基因修饰在运动性脊髓损伤中的应用 |
| 2.2.4 神经干细胞的基因疗法在运动性脊髓损伤中的应用 |
| 3 结论与展望 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 展望 |
（6）细胞移植治疗脊髓损伤的优化方案及PDGF-B在脊髓修复中的作用（论文提纲范文）
| 中英文对照索引 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 一、神经干细胞体外培养技术的建立 |
| 参考文献 |
| 二、骨髓基质干细胞培养技术建立 |
| 参考文献 |
| 三、骨髓造血干细胞的体外培养 |
| 参考文献 |
| 四、嗅鞘细胞培养 |
| 参考文献 |
| 五雪旺细胞的体外培养 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 一 材料与方法 |
| 二.实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 |
| 材料和方法 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 博士期间发表的论文和参编教材 |
| 参加科研项目 |
| 博士期间获奖情况 |
| 致谢 |
（7）NSC和OEC联合移植对SCT大鼠大脑皮质运动区神经元的作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 主要缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 正文 |
| 引言 |
| 第一部分 全横断脊髓损伤对大鼠运动功能及大脑皮质运动区神经元的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 NSC和OEC联合移植对全横断脊髓损伤大鼠运动功能及大脑皮质运动区神经元的保护作用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 NSC和OEC联合移植对全横断脊髓损伤大鼠大脑皮质运动区神经元保护作用的分子信号通路研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一 |
| 文献综述二 |
| 攻读博士研究生期间发表的文章 |
| 致谢 |
（8）神经营养因子-3基因修饰的神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤（论文提纲范文）
| 英文缩略语 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪言 |
| 第一部分 载体构建 |
| NT-3基因真核表达载体PEGFPN1-NT-3的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 细胞培养 |
| 胚胎脊髓神经干细胞的培养 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 基因修饰 |
| EGFP标记NT-3基因修饰的神经干细胞的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 动物模型 |
| 胸9水平脊髓半切大鼠动物模型的建立 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第五部分 细胞移植(一) |
| 脊髓损伤后神经干细胞移植最佳时间的确定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第六部分 细胞移植(二) |
| NT-3基因修饰的神经干细胞移植后大鼠的行为学恢复 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第七部分 细胞检测 |
| 移植细胞的存活、分化及基因表达的检测 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一:攻读学位期间发表论文目录 |
| 附录二:实验方法与技术 |
| (一)分子生物学实验技术 |
| (二)细胞培养实验技术 |
| (三)免疫学实验技术 |
| (四)动物实验技术 |
| 附录三:主要设备、试剂及实验材料 |
| (一)主要仪器设备 |
| (二)主要试剂 |
| (三)相关试剂配方 |
| (四)质粒载体、菌株及实验动物 |
| 文献综述一 |
| 脊髓损伤动物模型的研究进展 |
| 文献综述二 |
| 干细胞治疗脊髓损伤研究的新进展 |
| 致谢 |
（9）TLX基因对大鼠真皮多能干细胞增殖和成神经细胞分化及移植治疗脊髓损伤的影响研究（论文提纲范文）
| Abstract |
| 摘要 |
| 论文正文 TLX 基因对大鼠真皮多能干细胞增殖和成神经细胞分化及移植治疗脊髓损伤的影响研究 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 大鼠TLX 基因克隆及真核表达载体的构建 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TLX 对真皮多能干细胞增殖和定向成神经细胞分化的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TLX 修饰真皮多能干细胞移植治疗SCI |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 文献综述 脊髓损伤的移植治疗研究 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 英文论着 |
（10）神经干细胞移植在脊髓损伤修复中的应用进展（论文提纲范文）
| 1 神经干细胞研究现状 |
| 1.1 神经干细胞移植的生物学特性 |
| 1.2 神经干细胞移植治疗脊髓损伤的可行性 |
| 1.3 神经干细胞的移植来源 |
| 1.4 神经干细胞的移植途径 |
| 1.5 神经干细胞的移植时机 |
| 2 神经干细胞治疗脊髓损伤的研究现状 |
| 2.1 神经干细胞单独移植治疗脊髓损伤 |
| 2.2 神经干细胞综合移植治疗脊髓损伤 |
| 3 结 语 |
四、NOV基因修饰神经干细胞移植对损伤大鼠脊髓功能恢复的影响（论文参考文献）
- [1]NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究[D]. 曾友根. 南昌大学, 2020(08)
- [2]氧调控性神经生长因子基因修饰神经干细胞移植治疗急性脊髓损伤[J]. 陈梦吉,叶佳辉,应一博,陈敏,窦海成,倪文飞,朱思品. 中华骨科杂志, 2020(10)
- [3]慢病毒载体介导Shh基因转染雪旺细胞移植修复脊髓损伤的实验研究[D]. 唐浩帅. 天津医科大学, 2020(06)
- [4]HIF-1α基因及GDNF基因修饰神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的研究[D]. 陈茂华. 浙江大学, 2014(09)
- [5]神经干细胞转基因疗法与运动性脊髓损伤的治疗[J]. 刘丽霞,王永成. 中国组织工程研究与临床康复, 2011(27)
- [6]细胞移植治疗脊髓损伤的优化方案及PDGF-B在脊髓修复中的作用[D]. 刘佳. 昆明医学院, 2010(08)
- [7]NSC和OEC联合移植对SCT大鼠大脑皮质运动区神经元的作用及相关机制研究[D]. 李云. 昆明医学院, 2010(08)
- [8]神经营养因子-3基因修饰的神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[D]. 梁袁昕. 华中科技大学, 2009(11)
- [9]TLX基因对大鼠真皮多能干细胞增殖和成神经细胞分化及移植治疗脊髓损伤的影响研究[D]. 王涛. 第三军医大学, 2008(03)
- [10]神经干细胞移植在脊髓损伤修复中的应用进展[J]. 赵宁,杨万章. 中西医结合心脑血管病杂志, 2007(05)