一、用非离子去污剂提高胶内酶切效率的初探（论文文献综述）
王庆锋[1]（2020）在《TGR5对成骨细胞分化的影响及相关机制研究》文中进行了进一步梳理背景骨是由成骨细胞和破骨细胞调节的一种精细的动态器官,在调节骨周转率中起着关键作用。成骨细胞对骨形成很重要,破骨细胞负责骨吸收。成骨细胞来源于间充质干细胞和成骨前细胞,通过成骨分化形成。成骨分化功能障碍导致正常骨重塑或骨翻转功能受损,并伴有多种骨代谢紊乱,包括骨质疏松症。骨质疏松症的主要病理特征为骨密度降低、骨稳态崩溃、骨脆性增加。成骨细胞的成熟是一个复杂的生理过程,由细胞增殖、分化、矿化等多个步骤调控。前体细胞成功的分化和矿化成功能性成骨细胞被认为是骨形成的关键步骤。多种细胞内信号通路被报道参与成骨细胞分化和矿化过程。例如,AMPK活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）可刺激内皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）磷酸化,增加成骨前细胞MC3T3-E1一氧化氮（nitric oxide,NO）的产生,促进成骨细胞分化和矿化,提高成骨细胞活性,促进骨形成。AMPK/eNOS通路的激活导致RUNT相关转录因子2（runt-related transcription factor 2,Runx-2）的表达,该转录因子通过调节碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨钙素（osteocalcin,OCN）、骨黏连蛋白（osteonectin）、骨桥蛋白（osteopontin）和Ⅰ型胶原的表达参与成骨细胞成熟。促进成骨分化被认为是治疗骨质疏松症等骨疾病的重要治疗策略。G蛋白偶联受体TGR5是G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptor,GPCR）家族的重要成员。它最初被鉴定为胆汁酸的膜受体。据报道,TGR5在调节胆汁酸和能量稳态以及葡萄糖代谢方面发挥着关键作用。TGR5存在于多种组织和细胞中,通过异三聚体G蛋白转导细胞外信号,具有多种药理特性。例如,最近报道TGR5激活在抑制脂多糖（LPS）诱导的全身急性胃炎症中起关键作用,该过程主要是通过抑制IκBα/NF-κB信号通路的激活完成的。也有报道称TGR5在治疗肾脏炎症相关疾病中具有抑制NF-κB和STAT3信号的作用。TGR5在氧化偶氮甲烷（azoxymethane,AOM）小鼠模型中也通过减轻神经炎症和改善预后显示其具有神经保护作用。然而,关于TGR5在成骨分化中的作用的信息以前很少有报道。目的本课题拟通过体内和体外实验探究TGR5对成骨细胞分化和骨骼发育形成的影响,以及参与调控成骨细胞正常分化的具体作用机制,不仅研究TGR5在骨形成过程中的生理功能,为骨代谢的分子机制提供了新的见解,也为临床治疗骨相关疾病提供了新的理论基础和靶点。方法正常成骨细胞分化障碍与骨质疏松等骨丢失相关疾病有关。G蛋白偶联受体TGR5被认为是胆汁酸和能量稳态的重要调节因子。关于TGR5对成骨细胞骨形成和基质矿化的影响,以往报道较少。在本研究中,我们首先利用RNA-seq检测了 β-GP/AA诱导前成骨细胞系MC3T3-E1前后基因表达差异,确定了目的基因TGR5可能参与调控β-GP/AA诱导的成骨细胞的分化与成熟,能够促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞的分化。然后,我们利用TGR5激动剂GPBARA和siRNA技术证明了 TGR5的活性能够调控MC3T3-E1成骨细胞分化相关基因（ALP、OCN、Osx）、成骨细胞分化转录因子Runx2的表达,影响细胞ALP活性及基质钙化。之后,我们通过进一步的机制研究发现TGR5通过激活AMPK信号通路促进MC3T3-E1向成骨细胞的分化。最后,我们通过TGR5缺失的转基因小鼠模型体内证明TGR5通过影响AMPK信号通路对小鼠骨骼的发育和成骨细胞的分化产生影响。结果（1）β-GP/AA诱导前成骨细胞系MC3T3-E1前后基因表达差异β-甘油磷酸/抗坏血酸（β-glycerophosphate/ascorbicacid,β-GP/AA）能够诱导成骨细胞的分化和形成。我们利用前成骨细胞系MC3T3-E1作为成骨细胞前体细胞（osteoblastprecursors,OBPs）,该细胞能够诱导分化成成骨细胞。我们用4 mMβ-GP和25 μg/mlAA分别处理MC3T3-E1 24h、48h和72h后,收取不同组的RNA,送公司行二代测序。RNA-seq和生物反应路径分析（Ingenuity Pathway Analysis,IPA）发现β-GP/AA诱导24h有1488个基因表达上调,诱导48h有1417个基因表达上调,诱导72h有337个基因表达上调,其中TGR5是三组中表达上调最明显的。因此,我们推测TGR5可能参与调控β-GP/AA诱导的成骨细胞的分化与成熟,能够促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞的分化。（2）β-GP/AA 诱导促进 MC3T3-E1 TGR5 的表达TGR5在不同类型的细胞和组织中表达。然而,目前尚不清楚TGR5是否在MC3T3-E1细胞中表达。因此,我们通过RT-PCR和western blot检测了 TGR5是否在MC3T3-E1细胞中表达。小鼠MIN6细胞作为TGR5表达的阳性对照[16]。与预期一样,通过RT-PCR和western blot分析,我们在MC3T3-E1细胞的RNA水平和蛋白水平分别检测到了 TGR5的表达。接下来,我们发现在成骨培养基（含4mMβ-GP和25 μg/mlAA的α-MEM）培养的MC3T3-E1细胞中,TGR5的表达从第3天到第14天逐步增加,且呈时间依赖性。这些结果提示TGR5可能是MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的一个重要因素,说明TGR5参与MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化。（3）TGR5激动剂能够促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化GPBARA作为TGR5的特异性激动剂被广泛应用于TGR5的激活研究[17]。前面已经证明TGR5可能参与MC3T3-E1细胞成骨细胞的分化,下面我们利用TGR5特异性激动剂做进一步的验证。我们利用含TGR5激动剂GPBARA（3μM）的成骨培养基培养MC3T3-E1细胞,然后测定成骨细胞ALP活性、茜素红S染色及成骨细胞分化标志物基因表达情况,用于检测成骨细胞分化情况。结果发现:与对照组相比,GPBARA（3μM）能够显着提高MC3T3-E1的ALP活性,且差异具有统计学意义（p<0.05）。相应地,茜素红S染色结果表明,与对照组相比,添加GPBARA（3μM）能够显着促进MC3T3-E1细胞在第14天的矿化作用,且差异具有统计学意义（p<0.05）。同时,RT-PCR结果表明,TGR5激动剂GPBARA（3μM）的使用能够显着增强成骨细胞相关标记基因的表达,包括ALP、OCN、Osx和Col-I,且差异具有统计学意义（p<0.05）。（4）TGR5能够促进MC3T3-E1成骨细胞特异性转录因子Runx2的表达与成骨细胞分化相关的标记基因的表达主要受转录因子Runx-2调控。结果发现,与对照组相比,GPBARA（3μM）处理能够显着促进MC3T3-E1Runx2的表达,且差异具有统计学意义（p<0.05）。（5）TGR5敲低能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化为了进一步验证TGR5在成骨分化中的生物学功能,通过TGR5 siRNA转染敲除TGR5的表达。western blot证明TGR5敲除成功。重要的是,TGR5的沉默部分阻止了 ALP活性增加、基质矿化以及成骨细胞分化标记基因的表达,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。这些结果均提示TGR5可能在成骨分化中起重要作用。（6）TGR5通过激活AMPK信号通路促进成骨细胞的分化eNOS 的磷酸化和 AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）产生NO在成骨细胞分化过程中起关键作用。因此,我们检测了 GPBARA（3μM）是否能够影响MC3T3-E1eNOS/NO信号通路。结果发现:GPBARA（3μM）能够显着促进MC3T3-E1eNOS的磷酸化,且具有时间依赖性。DAF-FMDA染色用于检测MC3T3-E1NO的产生。结果表明,GPBARA处理将MC3T3-E1NO的产生时间从1h增加到6h。此外,我们还发现GPBARA（3μM）能够促进MC3T3-E1AMPK和ACC的磷酸化,且具有时间依赖。因此,我们推测TGR5通过激活AMPK信号通路促进MC3T3-E1向成骨细胞的分化。（7）AMPK抑制剂能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化为了进一步证实AMPK在调节GPBARA诱导的成骨分化作用中的作用,我们使用了特定的AMPK抑制剂化合物C来处理MC3T3-E1。利用条件性成骨培养基培养MC3T3-E1细胞,培养时间为14天。结果发现,复合物C的存在抑制了 GPBARA诱导的ALP活性升高、基质矿化和成骨细胞分化标记基因表达。同时我们还发现,使用复合物C阻断AMPK的活化,可以抑制GPBARA诱导的Runx-2表达。这些结果表明,TGR5在成骨分化中的作用是由AMPK介导的。（8）在骨骼形成过程中TGR5是成骨细胞分化必不可少的为了体内证明TGR5对小鼠骨骼发育和成骨细胞分化的影响,我们构建了 TGR5缺失的转基因小鼠,通过原位杂交分析TGR5的表达对骨骼形成的影响。结果发现:在E14.5,与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠ECM矿化的面积明显较少,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。Von Kossa染色用于检测骨骼中的钙含量以及ECM的矿化程度。与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠骨骼中的钙含量更低,ECM的矿化程度更低,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。阿尔新蓝染色发现TGR5缺失的小鼠骨骼ECM中大部分为软骨一类细胞,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。此外,我们还发现与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠骨骼中成骨细胞分化的相关基因OCN、Col-Ⅰ的表达也显着降低,成骨细胞分化的转录因子Runx2的表达也显着降低,且差异均具有统计学意义（p<0.05）。因此,在骨骼形成和发育过程中,TGR5能够影响骨骼中钙的沉积,调控成骨细胞分化相关基因的表达。（9）TGR5通过调控AMPK信号通路影响骨骼发育前面己经证明了 TGR5主要通过激活AMPK信号通路促进成骨细胞的分化,我们通过尾静脉注射的方式给TGR5缺失的小鼠给予AMPK激动剂GSK621（2mg/kg）注射,结果发现AMPK激动剂能够促进TGR5缺失小鼠骨骼的发育,也会促进成骨细胞分化相关基因OCN、Col-Ⅰ以及转录因子Runx2的表达。因此,在骨骼形成和发育过程中,TGR5能够通过AMPK信号通路影响骨骼的发育,调控成骨细胞分化相关基因的表达。结论总之,TGR5能够通过调控AMPK信号通路影响成骨细胞相关基因的表达,进而影响成骨细胞的分化和骨骼的发育。本研究不仅阐明了 TGR5在骨形成过程中的生理功能,为骨代谢的分子机制提供了新的见解,也为临床治疗骨相关疾病提供了新的理论基础和靶点。
辛彦龙[2]（2018）在《细菌内膜蛋白插入酶YidC的结构与功能研究》文中研究说明细胞中有超过三分之一的蛋白是膜蛋白,这些膜蛋白的生理功能角色非常广泛,包括ATP酶,各种离子通道以及通透酶等等。对于细胞来说,要将这么多的膜蛋白顺利地转运插入到磷脂双分子层将是一个非常关键和具有挑战性的生理活动。分布于细菌、叶绿体、线粒体中的YidC/Alb3/Oxal家族蛋白很早就被鉴定出具有催化膜蛋白插入磷脂双分子层的功能。细菌中的YidC除了可以独立地将一部分膜蛋白作为底物催化插入到磷脂双分子层,还可以辅助SecYEG转运蛋白。SecYEG是目前发现的最重要的膜转运通道,除了负责转运大部分分泌蛋白,它还负责催化大部分膜蛋插入到细胞膜,后一过程中,往往需要YidC的协同参与。目前关于YidC的具体功能机制,大部分还不清楚。许多以往的研究表明,新生膜蛋白特定区域的带电氨基酸的分布对于其对YidC的依赖性起着非常关键的作用。本论文中,我们解析了来自于Thermotoga maritima种属中的YidC（TmYidC）3.8A分辨率的晶体结构。TmYidC的C端五次跨膜螺旋相互作用在一起,形成一个亲水性的沟渠结构,这五个跨膜螺旋的周质侧半叶相互紧密地聚束在一起,形成沟渠的封口端,而胞质侧半叶则松散地相互作用在一起,形成沟渠的开口端。沟渠内存在的五个保守的极性氨基酸（Gln322、Arg260、Ser371、Thr374和Asn413）使得跨膜区具有明显的亲水性。另外,我们单独解析了 TmYidC周质侧第一个可溶区结构域（TmYidCP1）2.5A分辨率的晶体结构。Pf3是一个非SecYEG通道依赖性的YidC底物膜蛋白,它可以被YidC独立地转运插入到磷脂双分子层。我们利用体内光交联的实验手段,对YidC和Pf3之间相互作用的位点进行了研究。YidC的五次跨膜螺旋可以形成两个α五螺旋束,我们发现Pf3可以从这两个α-螺旋束所形成的TM3-TM5界面离开YidC的沟渠结构,继而进入磷脂双分子层。通过在YidC内部人为引入二硫键的方法,我们发现YidC中两个α-螺旋束周质侧的运动性对YidC的活性非常重要。负责连接第三个跨膜螺旋和第四个跨膜螺旋的P2 loop包裹住了整个沟渠结构的周质侧一端,该loop上含有两个十分保守的负电性氨基酸,这些保守的负电氨基酸导致沟渠的周质侧一端呈现出一定程度的负电势。我们发现该负电氨基酸对于YidC的功能实现是必需的,因此推测P2 loop上保守的负电性氨基酸在YidC催化底物进入磷脂分子层时发挥着重要作用。总之,我们的实验表明现YidC跨膜区的周质侧部分（包括P2 loop）虽然远离YidC核心的亲水性沟渠结构域,却是一个与YidC的功能实现密相关的活性区域。
吴灼[3]（2018）在《IL-21与肝素相互作用并初步揭示其Gamma受体亚基胞内域的构象》文中研究指明白介素-21属于I-型细胞因子,具有重要的多效性免疫调节作用,对体液免疫和T细胞免疫均有影响。已知IL-21在行使其生物学功能时是先与其受体胞外域结合形成IL-21/IL-21R α/IL-21R γ三元复合物,信号再通过受体的跨膜区传至胞内从而激活JAK/STAT通路,然而当前这一过程中详细的分子机理还有待研究。本论文通过研究IL-21与其受体在以下几个方面的特点试图加深理解此信号转导过程。（1）前期实验表明IL-21信号转导可能与分子所处的微环境有关,即细胞表面和基质中的HSPG可能影响了IL-21的构象从而影响其生物功能,在此我们采用核磁共振手段研究具体参与作用的区域。（2）蛋白质结构与功能相互联系,构象的稳定性直接影响其功能性。前期我们通过计算机模拟筛选出稳定性高的突变体,在此我们为实现液体核磁共振探索IL-21突变体构象的稳定性而表达、纯化出足够的样品。（3）我们研究了 IL-21Rγ受体亚基的跨膜区。首先对受体跨膜区结构进行了摸索,并初步获得了其二级结构信息。跨膜区因其疏水性强,分子量小等特点,所以其样品制备上具有很大挑战性,因此我们尝试了几种不同分离纯化方法。（4）细胞膜作为重要因素可能参与信号转导。为研究受体亚基的胞内域与细胞膜的相互作用,成功制备了 alpha亚基蛋白质样品。应用荧光及脂质条实验鉴定了该蛋白与质膜在体外的相互作用。由于胞内域蛋白不易结晶,结构松散,稳定性低,因此很难应用X-射线衍射和液体核磁手段获取其三维结构信息。我们根据受体蛋白胞内域结构的特殊性,首次尝试运用化学交联结合质谱的方法初步获取了a 1 apha亚基胞内域蛋白的三维结构信息。
马敏[4]（2017）在《基于质谱技术的蛋白质翻译后修饰研究》文中进行了进一步梳理蛋白质翻译后修饰在生命的许多生物学过程中发挥着重要的作用,并与人类的多种疾病的发生息息相关。目前已知的蛋白质翻译后修饰有300多种类型。本文主要针对蛋白质翻译后甲基化修饰和磷酸化修饰进行了深入的研究。甲基化和磷酸化同其他类型的翻译后修饰一样,都具有低丰度、化学计量数低和动态范围变化大等特征。因此,利用传统的生物学技术不能对其进行大规模化的深入研究。蛋白质组学的突起,特别是质谱仪灵敏度、速度和自动化的提升,成为了蛋白质翻译后修饰大规模化研究的强有力工具。其中“鸟枪法”蛋白质组学策略更是被广泛地应用于翻译后修饰的研究中。本论文主要通过结合“鸟枪法”质谱技术的手段,针对甲基化的定性和定量,以及磷酸化底物筛选等三个方面进行了研究。第一,通过去除甲基化富集过程中糖基化的干扰,并结合多酶切以及多维分离的手段,本论文研发了一种重现性高、成本低、耗时少的非抗体富集的甲基化方法,DOMAIN（De-glycO-assisted MethylAtion site IdeNtification）,可以对样品进行全蛋白质组学的甲基化大规模鉴定。并且可以有效地应用于临床样本的研究中。第二,结合同位素细胞培养技术,应用DOMAIN方法,对精氨酸甲基转移酶3的底物进行了筛查。并结合由于不同同位素核结合能不同产生的微小质量偏差Neucode（neutronencoding）思想,研发了特异性识别精氨酸二甲基化的定性定量方法,CoNeucode。不仅如此,同时还开发了针对Neucode的数据处理软件,可以应用于除甲基化以外的其他Neucode数据分析。第三,利用“鸟枪法”质谱技术,对Ack1磷酸激酶底物进行了初步的研究。从组蛋白到非组蛋白,最后到细胞全蛋白质水平。希望能发现一些新的酪氨酸磷酸激酶调控机制。同时,为一些疾病,特别是癌症等疾病提供新的药物靶点和新的治疗思路。综上所述,应用先进的质谱技术不仅能在大规模范围内研究蛋白质翻译后修饰,而且为发现新的蛋白质翻译后修饰位点以及新的生命过程机制提供了极大的可能性。
韩云宾[5]（2016）在《鞘糖脂人工生物合成关键酶的结构、功能及分子改造》文中研究表明鞘糖脂是由神经酰胺和寡糖链以糖苷键结合形成的双亲分子,作为人体内重要的生物活性物质,它们参与了多种生理和病理过程,如信号传导、免疫、癌症发生和胰岛素抗性等。研究发现,鞘糖脂类具有作为疾病药物、治疗靶标及潜在诊断标记的潜力,因此对该类化合物制备及药用研究受到学术界的广泛关注。目前鞘糖脂类药物的大量制备主要依赖从动物脑组织中提取,存在成本较高、来源有限,且有受疯牛病等人畜共患病污染的潜在危险。通过工程化的系统设计,构建鞘糖脂类体外生物合成体系,探索相关酶催化及底物选择性机制,不仅将深度揭示酶结构-功能关系,还将有助于实现鞘糖脂的高效、廉价合成。在本实验室的前期工作中,已成功创建了鞘糖脂的体外多酶合成体系;为进一步提高人工体系的运行效率,我们对多酶体系中的三类关键酶:鞘糖脂内切糖苷酶、鞘糖脂N-去酰基化酶、及岩藻糖基转移酶在酶学功能表征、结构机制解析、酶分子改造等方面进行了系统研究。天然的鞘糖脂内切糖苷酶（EGCase）催化鞘糖脂糖苷键的水解。但通过对其活性中心的亲核攻击残基进行突变,可将EGCase改造为糖苷合成酶,从而催化氟代糖链模块和鞘氨醇模块缩合生成溶血鞘糖脂。我们通过数据库搜索与活性测定,从Rhodococcus equi 103S基因组中鉴定了一个新的EGCase基因（EGCase I）,其催化效率(kcat/Km)比目前广泛使用的Rhodococcus sp.M-777鞘糖脂内切酶EGCase II高130倍,且具有更广泛的底物选择性。为深入解析EGCase的作用机制,我们首次解析了EGCase I的晶体结构及其与GM1底物结合的复合体结构,阐明了该酶具有高催化活性和宽底物特异性的结构基础。通过与EGCase II的结构进行比较,鉴定了影响EGCase II活力的关键氨基酸,并在此基础上通过理性设计获得了活力提高10倍、且底物谱更宽的EGCase II突变酶,为构建获得高效的糖苷合成酶奠定了基础。鞘糖脂N-去酰基化酶（SCDase）能够催化鞘糖脂中酰胺键水解或合成,是典型的双功能酶。SCDase在鞘糖脂人工合成体系中催化溶血鞘糖脂和脂肪酸链的缩合,生成完整的鞘糖脂结构,是主要的限速步骤之一。为获得更高效的SCDase催化元件,我们克隆并系统表征了来源于海洋微生物Shewanella alga G8的鞘糖脂N-去酰基化酶（SASCD）。SASCD与来自于Pseudomonas sp.TK4的商品化PSSCD相比,水解活性高9倍,合成活性高38倍,而且可以更有效利用不饱和脂肪酸、极短和极长链脂肪酸合成鞘糖脂。SASCD的优良酶学特性以及能够在大肠杆菌中异源表达的能力,使它在鞘糖脂高效生物合成及结构衍生中具有良好的应用潜力。岩藻糖基转移酶（FucT）可用来催化合成一系列含有岩藻糖基的鞘糖脂。由于此类鞘糖脂与多种癌症发生和发展密切相关,因此受到学术界的广泛关注。为了提高岩藻糖基转移酶的催化效率,我们首先使用来源于幽门螺杆菌H.pylori NCTC11639的α1,3-岩藻糖基转移酶（FutA）作为模式酶,建立了适用于岩藻糖基转移酶的FACS超高通量筛选方法,筛选速度达到每小时107以上。在模式筛选实验中,表达了FutA的大肠杆菌从大量无酶活性细胞中富集的倍数高达104倍,而且可以对表达酶活力相差2倍的菌株进行有效区分,证明了该方法的有效性。随后我们对库容量高达4×106的FutA随机突变库进行3轮筛选获得了催化活力明显提高的突变体A4（Y199N/V368A/D407N）和D9（E340D）。在此基础上,我们又设计了针对α1,2-岩藻糖基转移酶的荧光受体底物,拓展了该技术的应用空间,为岩藻糖基转移酶的大范围改造奠定了基础。综上所述,本论文围绕鞘糖脂类人工合成体系的关键酶系进行了系统的研究,发现了性质优良的EGCase和SCDase新酶源,解析了EGCase的底物选择性机制,开发了岩藻糖基转移酶的高通量筛选方法,并通过分子改造获得多种性质更优良的突变酶。本论文工作将有助于进一步对鞘糖脂合成酶系进行系统的人工设计和优化,最终为实现重要鞘糖脂类药物的高效合成和结构创新提供技术源头和理论支撑。
姜超[6]（2015）在《几种作物蛋白质样品制备及小麦抗条锈病相关蛋白质组分析》文中认为小麦、水稻、玉米、大豆是我国最主要四大粮食作物,对于我国粮食安全起着至关重要的作用。在全球气候恶化的大背景下,维持四种作物的生产可持续发展,开展这几种作物的耐寒、耐旱、耐盐性等逆境的研究,保障其在恶劣环境下的生产和种植显得尤为重要。目前对四大粮食作物的抗虫、抗病、抗盐、抗旱等方面开展了广泛的研究,蛋白质作为基因的产物,它是各种功能基因发挥其遗传效应的关键,也是决定植物性状的具体物质,因此进行蛋白质水平的研究对于探索作物的抗性机制有重要意义。本论文选用中国农业科学院植物保护研究所小麦抗条锈病基因Yr5近等基因系Taichung29*6/Yr5 （TYr5）和水稻退穗化突变型植株/退穗化野生型植株、大豆长叶柄植株和短叶柄植株以及AA/aa玉米突变株植株几种作物材料,开展了这几种作物蛋白质样品制备及小麦抗条锈病相关蛋白组学的初步研究。对四种作物开展的高效制备植物叶片蛋白样品的方法学研究,建立了比较适合于这几种作物蛋白质组研究的制样方法。结合TripleTOF5600质谱（AB-SCIEX）技术对TYr5抗条锈小麦进行质谱分析,通过质谱定性分析从小麦中发掘了大量可能与抗条绣病相关的多肽信息,为小麦条锈病的防治以及新品种的培育提供了基础。主要结果如下：（1）建立并完善了小麦、水稻、大豆、玉米叶片总蛋白的分离体系,利用1DE电泳技术和蛋白质酶切技术,对四种作物提取蛋白质进行快速的分离鉴定,比较了不同处理前提下不同种类提取缓冲液提取蛋白方法和不同蛋白质酶切方法的差异,对不同缓冲液所提蛋白以及蛋白质酶切的肽段提取效率进行分析论证,以此为植物的蛋白组学研究提供依据。结果表明尿素硫脲提取缓冲液所提取出的小麦、玉米、大豆蛋白条带数量多、稳定性好、提取率高,TCA丙酮处理后进行的酚提法所提取水稻叶片蛋白的纯度更高,杂质更少,电泳谱带清晰。相对于微波辅助酶切法,传统酶切方法多肽回收率更高,蛋白质酶切更彻底。（2）利用基于液相色谱串联TripleTOF5600质谱（AB-SCIEX）的进行定性分析,对小麦抗条锈病基因Yr5近等基因系Taichung29*6/Yr5 （TYr5）进行了蛋白质定性分析,经NCBI blast软件搜库,在两个样品中共同鉴定到46108个肽段片段和9001个蛋白,其中有准确定量信息的蛋白共2254个,含量变化大于2倍的差异蛋白有78个对78个差异表达蛋白进行了Gene Ontology （GO）功能注释和分析,发现他们多数定位于细胞基质和核糖体等细胞器,具备结合、催化等功能,主要参与代谢、细胞过程、应激反应等生物学进程。
赵岩[7]（2015）在《大肠杆菌二肽转运蛋白YbgH结构与功能研究》文中提出在生命活动过程中,细胞需要在环境中摄取营养物质,并且要把新陈代谢过程中产生的废物外排出去。这些都需要定位在细胞膜上的主动转运蛋白来完成。主动运输是指利用外来能量进行的底物跨膜运输,而底物的运动方向往往与自身浓度梯度相反,也就是将物质从低浓度一侧运输到高浓度一侧。根据能量来源的不同,膜转运蛋白主要划分为初级主动转运蛋白和次级主动转运蛋白。MFS超家族转运蛋白是最大的转运蛋白家族之一,属于次级转运蛋白。该家族成员主要利用膜两侧的质子、钠离子浓度梯度作为驱动力,将底物进行跨膜运输。EcYbgH是大肠杆菌中利用细胞膜两侧质子浓度梯度转运小肽的转运蛋白。其主要底物是C端具有携带正电荷的氨基酸残基的小肽。我们解析了EcYbgH处于内向型构象的3.4A分辨率晶体结构,并利用细胞水平的转运实验研究了该蛋白的转运功能。在结构分析中,我们发现在细胞膜外侧在穿膜螺旋5-6之间的A类模体和保守的Asp44-Arg297盐桥,对于稳定内向型构象是非常关键的,而细胞膜内侧TM2/3之间的模体A则可以将蛋白稳定在外向型构象。这三个相互作用均发生于转运蛋白的两个跨膜结构域之间。当破坏三者中的一个或者两个,EcYbgH蛋白的转运活性就会丧失。而当把三者同时破坏,转运活性又得到恢复。因此,我们认为在MFS超家族蛋白转运过程中,存在一个内向型与外向型构象之间的能量平衡。而两者的失衡不利于转运蛋白的转运活性。同时,通过功能实验我们证明保守的Glu21是EcYbgH转运蛋白的质子化位点。另外,原核POTs转运蛋白亚家族成员氨基酸序列所特有的两根“嵌入”跨膜螺旋可能参与了对构象变化的调控。除了对大肠杆菌二肽转运蛋白YbgH进行了结构与功能的研究之外,我还参与了其它几个膜蛋白的工作包括YajR、CsgG、PgpB等,在这些工作中我主要负责数据处理、结构解析、修正以及分析。在处理这些工作的过程中,遇到了各种各样的困难,例如数据分辨率低,晶体衍射各向异性等。对于各向异性的数据,在数据处理的过程中一般使用ADS的软件包,将数据进行椭球形的截取,这样就可以去掉信噪比不高的数据。在修正的过程中,通常采用各种约束来保证修正过程的稳定,这些约束主要有二级结构约束、二面角约束、参考模型约束等。
李冬[8]（2015）在《利用19F位点特异性标记和19F核磁共振方法的原位蛋白质相互作用和功能分析》文中提出此论文中主要讨论了非天然氨基酸标记的方法和应用,FNMR的优势和在各领域中的应用。我们结合非天然氨基酸标记和I9F NMR来研究蛋白质的结构和功能,本论文共分为六个章节。第一章介绍了非天然氨基酸标记的方法及其应用。通过非天然氨基酸的引入来研究生物学过程,可以解决传统方法无法解决的一些问题。将非天然氨基酸位点特异性引入最有力的方法是通过遗传密码子扩增,该方法在需要标记的位置引入琥珀密码子（TAG）突变,筛选到能识别琥珀密码子的氨酰tRNA合成酶/tRNA对将非天然氨基酸引入,另外,可以通过化学连接方法辅助这种非天然氨基酸引入的方法。非天然氨基酸也可以通过选择压力的方法以氨基酸特异性的方式引入,这种方法会导致基因组特定氨基酸全方面的标记,而不是定点标记。本章还重点介绍了氨基酸特异性和位点特异性两种非天然氨基酸标记方法在各方面的应用以及在一些前沿科技方面的应用。第二章介绍了利用FNMR研究蛋白质的结构和功能。19F自旋量子数为1/2,自然丰度是100%,磁旋比高,没有背景信号干扰,灵敏度高,使用氟原子代替氢原子不会明显的影响分子的结构,19F核的多种特性使其成为研究生物学过程的有力工具。核磁共振能研究蛋白质的结构,功能,底物结合,构象变化等信息。本章第一部分总结了氟核应用于核磁共振的优势,接下来介绍了氟标记蛋白质和多肽的合成原理和方法,最后重点介绍了结合19F NMR和氟标记探针方法在各领域中的应用,包括研究蛋白质和核酸的结构和功能、药物的开发和筛选、代谢过程、生物活性分子体内追踪等信息。第三章描述了应用位点特异性19F标记和19FNMR研究crude lysate蛋白质间相互作用。我们成功的通过化学方法合成了非天然氨基酸三氟甲基苯丙氨酸,并利用19FNMR分析两个促分裂原激活蛋白激酶（MAPKs）:MEKK3和MEK5的PB1结构域在天然细胞环境下蛋白质间的相互作用。高度保守的MAPKs家族是一个参与信号转导的重要体系,其中比较重要的是参与从细胞膜到细胞核或细胞内其它位置的信号传递。MEKK3和MEK5在N端都含有一个PB1结构域,它们通过形成二聚体发挥作用。我们将19F-tfmF分别插入到MEKK3-PB1和MEK5-PB1的不同位点,然后通过19F NMR化学位移变化和弛豫分析MEKK3-PB1和MEK5-PB1的相互作用界面,我们还证明了MEKK3-PB1和MEK5-PB1共纯化样品结合界面标记位点的化学位移变化与在细菌浓浆样品（crude lysate）样品中的变化一致。第四章介绍利用19F固体核磁共振来研究蛋白质的磷酸化信息,以及在苯乙烯马来酸酐（styrene maleic anhydride, SMA）作用下形成的脂碟（lipodisq）对细胞膜环境的改变。我们证实了苯乙烯马来酸酐包裹形成的单层囊膜脂碟在膜蛋白相关结构和功能研究中的优势。饼状胶束（bicelles）和纳米碟（nanodiscs）,虽然也可以提高底物与膜蛋白的接触几率,但或需要特殊脂质,或需要去污剂参与,或由于膜支架蛋白的影响,使其都不是最佳的研究介质。Lipodisq一方面能维持完整的细胞膜环境,另一方面还可以提高底物与膜蛋白的接触几率,为利用19F固体核磁共振方法或者其它生物物理方法研究天然细胞膜环境下配体受体结合,酶学分析,蛋白质间相互作用提供了便利。第五章主要介绍小分子荧光探针的发展以及在生物学中的应用,结合非天然氨基酸标记和小分子荧光探针L-（7-hydroxycoumarin-4-yl） ethylglycine荧光寿命等荧光特性研究蛋白质的结构和功能。第六章主要介绍了非天然氨基酸标记和19F NMR技术的展望。在细胞天然环境下研究蛋白质结构和功能更能反应其真实的生物物理信息,非天然氨基酸标记技术和核磁共振技术的发展为这些研究提供了有力的工具。
姜超,张学文,潘映红[9]（2015）在《蛋白质胶内酶切技术研究进展》文中研究表明胶内酶切是蛋白质组研究中衔接电泳分离和质谱鉴定的重要环节,对最终的蛋白质定性和定量分析结果有显着的影响。该技术自1992年初步建立以来,一直处于不断完善中,出现了种类繁多的改进方案。为了更有效地利用胶内酶切技术,从凝胶脱色、杂质去除、蛋白酶切、肽段提取4个方面归纳整理了近年来蛋白质胶内酶切技术的主要研究进展。
吴国杰[10]（2014）在《嗜冷杆菌Psychrobacter sp.的冷活性、耐盐酯酶基因的克隆、蛋白表达及其酶学性质研究》文中研究表明酯酶（Esterase, E C3.1.1.X）是具有重要工业价值的生物催化剂之一,可以水解酯类底物产生酸类和醇类物质,也可以催化逆反应合成各种酯类,因此在食品、药物、农业、化工等多种领域广泛研究和应用。冷活性酯酶具有在低温下保持高的催化效率,温度升高时不稳定的特点,能够满足一些特殊的工业生产要求（如低温）,达到高效催化、节省能源、热不稳定物质合成等目标。本研究筛选到两株活性较高,可以产冷活性酯酶的嗜冷菌株,分别是嗜冷杆菌（Psychrobacter sp.）和太平洋嗜冷杆菌（Psychrobacter pacificensis）。分别在大肠杆菌Escherichia coli DH5a中构建它们的基因组文库,通过添加有酯酶筛选底物三丁酸甘油酯的固体Luria-Bertani培养基筛选基因组文库,得到两个可以产透明圈的重组大肠杆菌克隆子。通过插入片段测序、生物信息学分析,鉴定出两个酯酶基因,分别是来自Psychrobacter sp.的酯酶基因est12和Psychrobacter pacificensis的酯酶基因est10。基因est10（Genbank accession no. KC291403）全长672个碱基,编码223个氨基酸,分子质量为24,647道尔顿,对应的酯酶Est10与来自嗜冷杆菌Psychrobacter sp. PAMC2119的一个羧酸酯酶（NCBI参考序列为WP010199455.1）的同源性最高（92%）；基因est12（Genbank accession no. KF313138）含990个碱基对,编码329个氨基酸,分子质量为35,150道尔顿,对应的酯酶Est12与来自嗜冷杆菌Psychrobacter sp. PAMC211的一个酯酶（NCBI参考序列为WP010200623.1）的同源性最高（77%）酯酶Est10和Est12在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）中诱导、表达和纯化后,检测其酶学性质。在不同侧链长度的对硝基苯酯类底物中,Est10对侧链四碳底物对硝基苯丁酸酯（p-nitrophenyl butyrate）活性最高,对十六碳的对硝基苯棕榈酸酯（p-nitrophenyl palmitate）没有活性。酯酶Est10最适反应温度25℃,最适反应pH7.5,在低温0℃能保持55%的活性；Est10在室温比较稳定,在40℃孵育2小时后仍能保持80%以上的活性。1mmol/L低浓度Zn2+、 Mg2+、 Ba2+、Ca2+、 Cu2+、 Fe3+、尿素和EDTA可以轻微地提高Est10活性,而同浓度的DTT和PMSF分别轻微和完全抑制其活性。增加NaCl浓度可以提高酯酶Est10的活性（2mol/L NaCl溶液中,活性提高至143.2%）和稳定性（在5mol/L NaCl溶液中孵育6.5小时后,活性提高到126.4%）,说明Est10耐盐的性质。体积比为0.05%和0.1%的去污剂tween20、 tween80、 Triton X-100和CHAPS均可以提高Est10的活性和稳定性,而SDS和CTAB则相反。同时,Est10和30%的有机溶剂包括甲醇、DMSO.乙二醇孵育后仍保持较好活性,和30%异丙醇、乙醇、正丁醇和乙腈孵育后活性很低。进化树分析表明酯酶Est112可能属于一个新的酯酶家族。酯酶Est12最适底物同样为p-nitrophenyl butyrate,最适反应pH7.5,最适反应温度为35℃,在0℃可以保持41%的活性,在40℃以上时不稳定,体现了冷活性的特点。同时,Est12也是个耐盐酶,反应体系中NaCl浓度从0mol/L提高到4.5mol/L时,其米氏常数Km从0.069mmol/L降低至0.033mmol/L,催化常数kcat从4.20s-1升至9.21s-1,使催化效率kcat/Km从60.72s-1·mM-1升至276.31s-1·mM-1；同样,在0-4.5mol/L NaCl溶液中处理24小时后,酯酶Est12依然非常稳定。同时,酯酶Est12对在一些有机溶剂和去污剂存在时,也具有很好的活性和稳定性。本研究得到了两个新型的冷活性、耐盐,并对有机溶剂和去污剂具有一定耐受的酯酶,它们在一些极端工业生产加工条件（低温、高盐、有机合成等）中具有潜在应用价值。
二、用非离子去污剂提高胶内酶切效率的初探（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用非离子去污剂提高胶内酶切效率的初探（论文提纲范文）
（1）TGR5对成骨细胞分化的影响及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞培养 |
| 1.3 主要试剂及仪器 |
| 1.4 主要实验试剂配制 |
| 1.5 实时定量聚合酶链反应(PCR) |
| 1.6 Western-blot |
| 1.7 碱性磷酸酶(ALP)活性的测定 |
| 1.8 矿化试验茜素红S染色 |
| 1.9 测量一氧化氮(NO)的产生 |
| 1.10 siRNA构建及细胞转染 |
| 1.11 统计学分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 β-GP/AA诱导前成骨细胞系MC3T3-E1前后基因表达差异 |
| 2.2 β-GP/AA诱导促进MC3T3-E1 TGR5的表达 |
| 2.3 TGR5激动剂能够促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化 |
| 2.4 TGR5能够促进MC3T3-E1成骨细胞特异性转录因子Runx2的表达 |
| 2.5 TGR5敲低能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化 |
| 2.6 TGR5通过激活AMPK信号通路促进成骨细胞的分化 |
| 2.7 AMPK抑制剂能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化 |
| 2.8 在骨骼形成过程中TGR5是成骨细胞分化必不可少的 |
| 2.9 TGR5通过调控AMPK信号通路影响骨骼发育 |
| 3. 讨论 |
| 1. 成骨细胞: 来源和发生 |
| 2. 成骨细胞的生长和分化取决于一系列生长因子和信号通路 |
| 3. 促使成骨细胞分化的各种机械信号 |
| 4. 机械刺激作为骨疾病治疗的方案 |
| 5. 成骨细胞和破骨细胞的相互作用 |
| 全文总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述成骨细胞的调控网络及其与骨相关疾病的关系 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（2）细菌内膜蛋白插入酶YidC的结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 膜蛋白的晶体学研究 |
| 1.1.1 膜蛋白样品的获取 |
| 1.1.2 膜蛋白的结晶方法 |
| 1.1.2.1 基于去污剂的结晶方法 |
| 1.1.2.2 基于脂类的结晶方法 |
| 1.1.3 X射线晶体学 |
| 1.1.3.1 衍射的几何原理 |
| 1.1.3.2 结构因子和电子密度 |
| 1.1.3.3 相位问题 |
| 1.2 革兰氏阴性细菌内膜上的蛋白质转运系统 |
| 1.2.1 SecYEG转运系统 |
| 1.2.1.1 Sec转运系统的两种分选定位途径。 |
| 1.2.1.2 SecYEG转运途径中的相关因子 |
| 1.2.1.3 SecYEG的结构特点和转运模型 |
| 1.2.2 Tat系统 |
| 1.2.3 YidC家族转运系统 |
| 1.2.3.1 细菌中的YidC转运系统 |
| 1.2.3.2 线粒体和叶绿体中的YidC转运系统 |
| 1.3 本课题的选题背景和意义 |
| 第2章 YidC的晶体结构研究 |
| 2.1 本章引言 |
| 2.2 YidC的表达与纯化 |
| 2.2.1 本节引言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2.2 表达载体的构建 |
| 2.2.2.3 表达体系的建立 |
| 2.2.2.4 纯化体系的建立 |
| 2.2.3 本节结果讨论 |
| 2.3 YidC的晶体筛选 |
| 2.3.1 本节引言 |
| 2.3.2 材料和方法 |
| 2.3.2.1 实验材料 |
| 2.3.2.2 去污剂筛选 |
| 2.3.2.3 胰蛋白酶酶切样品筛选 |
| 2.3.2.4 其它筛选方法 |
| 2.3.3 本节结果讨论 |
| 2.4 YidC的晶体优化 |
| 2.4.1 本节引言 |
| 2.4.2 材料和方法 |
| 2.4.2.1 实验材料 |
| 2.4.2.2 常规优化 |
| 2.4.2.3 晶体处理 |
| 2.4.2.4 TmYidC蛋白改造 |
| 2.4.3 本节结果讨论 |
| 2.5 TmYidCP1的晶体结构解析 |
| 2.5.1 本节引言 |
| 2.5.2 材料与方法 |
| 2.5.2.1 实验材料 |
| 2.5.2.2 表达载体的构建 |
| 2.5.2.3 TmYidCP1的表达纯化 |
| 2.5.2.4 TmYidCP1的晶体生长 |
| 2.5.2.5 TmYidCP1的数据采集与结构解析 |
| 2.6 TmYidC晶体的数据收集和结构解析 |
| 2.6.1 数据收集与结构解析 |
| 2.6.2 TmYidC结构分析 |
| 2.7 本章讨论 |
| 2.8 本章附 |
| 第3章 基于晶体结构的YidC功能研究 |
| 3.1 本章引言 |
| 3.2 TM3-TM5界面作为YidC底物的出口 |
| 3.2.1 本节引言 |
| 3.2.2 材料与方法 |
| 3.2.2.1 实验材料 |
| 3.2.2.2 TM3-TM5界面及TM2-TM6界面与Pf3的体内光交联实验 |
| 3.2.3 本节结果讨论 |
| 3.3 α.螺旋束Ⅰ和Ⅱ在周质侧的运动性对于YidC的活性是必需的 |
| 3.3.1 本节引言 |
| 3.3.2 材料和方法 |
| 3.3.2.1 实验材料 |
| 3.3.2.2 敲除菌的构建 |
| 3.3.2.3 表型质粒的构建 |
| 3.3.2.4 α2螺旋束Ⅰ、Ⅱ上半胱氨酸突变体的表型 |
| 3.3.3 本节结果讨论 |
| 3.4 P2 loop区域保守负电荷氨基酸的表型分析 |
| 3.4.1 本节引言 |
| 3.4.2 材料与方法 |
| 3.4.2.1 实验材料 |
| 3.4.2.2 P2 loop上特定位点维持负电性对于活性YidC是必需的 |
| 3.4.3 本节结果讨论 |
| 3.5 本章讨论 |
| 3.6 本章附 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（3）IL-21与肝素相互作用并初步揭示其Gamma受体亚基胞内域的构象（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 核磁共振技术的简介 |
| 1.2.1 核磁共振技术的小背景 |
| 1.2.2 异核单量子相关谱(HSQC)与滴定实验 |
| 1.3 CROSS-LINKING(化学交联)技术 |
| 1.3.1 Cross-linking的产生 |
| 1.3.2 胺类交联剂 |
| 1.3.3 蛋白质交联的意义 |
| 第二章 野生型hIL-21及其突变体hIL-21mu, hIL-21/hIL-4mu蛋白提取及初步分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 质粒和菌株 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.2.4 实验流程简单示意图 |
| 2.3 实验部分 |
| 2.3.1 蛋白诱导表达条件优化 |
| 2.3.2 蛋白纯化与复性 |
| 2.3.3 野生型IL-21与配体的滴定实验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 hIL-21野生型和两个突变体(命名为hIL-21mu,hIL21/hIL-4mu)重组蛋白诱导表达条件结果分析 |
| 2.4.2 hIL-21,hIL-21mu和hIL-21/hIL-4mu蛋白纯化及复性结果分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 IL-21受体Y跨膜区提纯和α受体胞内域与膜的相互作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 质粒和菌株 |
| 3.2.2 仪器和试剂 |
| 3.2.3 溶液的配制 |
| 3.3 实验部分 |
| 3.3.1 IL-21受体γ跨膜区的表达与纯化 |
| 3.3.2 IL-21α受体胞内域全长和截短体蛋白的表达 |
| 3.3.3 体外实验鉴定IL-21Rα-ICD与磷脂的特异性 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 IL-21Rγ-TMD蛋白表达及酶切纯化的结果分析 |
| 3.4.2 IL-21受体α胞内域全长和截短体的纯化和蛋白与脂的特异性鉴定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 化学交联结合质谱法初步摸索IL-21Rγ-ICD与IL-21Rα-ICD蛋白质空间信息 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 目标质粒和菌株 |
| 4.2.2 试剂和仪器 |
| 4.3 实验部分 |
| 4.3.1 IL-21Rγ-ICD蛋白质提纯 |
| 4.3.2 IL-21Rγ-ICD交联反应条件摸索与质谱鉴定 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.4.1 IL-21Rγ-ICD蛋白质的纯化结果分析 |
| 4.4.2 IL-21Rγ-ICD交联反应条件的摸索与质谱鉴定结果 |
| 4.4.3 IL-21Rα-ICD质谱鉴定结果分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 4.6 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）基于质谱技术的蛋白质翻译后修饰研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛋白质翻译后修饰 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 蛋白质甲基化修饰 |
| 1.1.3 蛋白质磷酸化修饰 |
| 1.1.4 其他翻译后修饰: |
| 1.2 蛋白质组常用技术 |
| 1.2.1 样品预分离技术 |
| 1.2.2 质谱鉴定技术 |
| 1.3 定量蛋白质组技术 |
| 1.3.1 有标定量 |
| 1.3.2 无标定量 |
| 1.4 本课题主要研究内容及意义 |
| 第2章 基于HILIC富集甲基化修饰新方法的研发 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂与材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 常用储存液配置 |
| 2.2.4 样品制备流程 |
| 2.2.5 质谱检测和数据分析 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 糖肽对甲基化肽段富集的干扰 |
| 2.3.2 LysargiNase对甲基化肽段富集的影响 |
| 2.3.3 应用DOMAIN方法大规模鉴定甲基化修饰位点 |
| 2.3.4 甲基化修饰位点的生物信息学分析 |
| 2.3.5 本章小结 |
| 第3章 基于定量技术的甲基化鉴定方法的应用 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂与材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 储液配置 |
| 3.2.4 样品制备流程 |
| 3.2.5 质谱检测和数据分析 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 PRMT3底物筛查 |
| 3.3.2 coNeucode方法的开发 |
| 3.3.3 针对coNeucode软件的开发 |
| 3.3.4 结合DOMAIN和coNeucode进一步提高二甲基鉴定 |
| 3.3.5 质谱碎裂模式优化 |
| 3.3.6 本章小结 |
| 第4章 蛋白质酪氨酸磷酸化修饰相关研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 储液配置 |
| 4.2.4 样品制备流程 |
| 4.2.5 质谱检测和数据分析 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 CRISPR ACK1效果 |
| 4.3.2 组蛋白酪氨酸磷酸化研究 |
| 4.3.3 全蛋白质组学的ACK1酪酸磷酸化研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文及参加科研情况 |
| 致谢 |
（5）鞘糖脂人工生物合成关键酶的结构、功能及分子改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表与术语 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 鞘糖脂简介 |
| 1.1.1 鞘糖脂的结构及生理功能 |
| 1.1.2 鞘糖脂种类的多样性 |
| 1.2 药用鞘糖脂 |
| 1.2.1 神经节苷脂GM |
| 1.2.2 癌症相关的鞘糖脂疫苗 |
| 1.3 鞘糖脂的制备方法 |
| 1.3.1 鞘糖脂的天然提取 |
| 1.3.2 鞘糖脂的化学法合成 |
| 1.4 鞘糖脂的人工生物合成体系 |
| 1.4.1 合成生物学 |
| 1.4.2 鞘糖脂的人工生物合成研究进展 |
| 1.5 鞘糖脂内切糖苷酶 |
| 1.5.1 鞘糖脂内切糖苷酶简介 |
| 1.5.2 鞘糖脂内切糖苷酶的应用 |
| 1.5.3 鞘糖脂内切糖苷酶改造为糖苷合成酶的研究进展 |
| 1.6 鞘糖脂N-去酰基化酶 |
| 1.6.1 鞘糖脂N-去酰基化酶简介 |
| 1.6.2 鞘糖脂N-去酰基化酶的应用 |
| 1.6.3 鞘糖脂N-去酰基化酶的研究现状 |
| 1.7 岩藻糖基转移酶 |
| 1.7.1 岩藻糖基化简介 |
| 1.7.2 岩藻糖基转移酶简介 |
| 1.7.3 岩藻糖基转移酶的应用 |
| 1.7.4 糖基转移酶的高通量筛选方法 |
| 1.8 本课题的研究意义 |
| 第二章 鞘糖脂内切糖苷酶EGCase I的结构及功能研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 鞘糖脂内切糖苷酶的进化分析 |
| 2.3.2 103 S_EGCase I克隆、表达和纯化 |
| 2.3.3 103 S_EGCase I的底物特异性研究 |
| 2.3.4 103 S_EGCase I的酶催化动力学研究 |
| 2.3.5 EGCase I的晶体结构解析 |
| 2.3.6 EGCase II的理性设计 |
| 2.3.7 EGCase底物特异性探究 |
| 2.3.8 103 S_EGCase I的合成活性研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 鞘糖脂N-去酰基化酶SA_SCD的酶学性质表征及应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 SA_SCD测活方法建立 |
| 3.3.2 SA_SCD酶学性质表征 |
| 3.3.3 SA_SCD与 PS_SCD的酶反应动力学比较 |
| 3.3.4 SA_SCD与 PS_SCD对鞘糖脂极性头特异性比较 |
| 3.3.5 SA_SCD在鞘糖脂脂肪酸模块重构中的应用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 岩藻糖基转移酶FutA的定向进化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 FutA高通量筛选方法的建立及优化 |
| 4.3.2 基于PCR的阳性基因回收方法的建立 |
| 4.3.3 正/负模式筛选 |
| 4.3.4 定量模式筛选 |
| 4.3.5 FutA随机突变库的建立与筛选 |
| 4.3.6 FutA的 DNA-shuffling突变库的建立与筛选 |
| 4.3.7 FutA突变体的构建,表达,纯化与活力测定 |
| 4.3.8 高通量筛选体系在α1,2-岩藻糖基转移酶筛选中的应用探索 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 质谱数据 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| 致谢 |
（6）几种作物蛋白质样品制备及小麦抗条锈病相关蛋白质组分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文章综述 |
| 1 植物蛋白质组学的研究进展 |
| 2 蛋白质组学的样品制备研究 |
| 2.1 蛋白质的提取与制备 |
| 2.2 蛋白质酶切 |
| 3 小麦与小麦条锈病 |
| 3.1 小麦条锈病 |
| 3.2 小麦条锈病的发生与特征 |
| 3.3 小麦条锈病的防治 |
| 3.4 小麦抗条锈病的蛋白质组学研究方案 |
| 4 研究的目的与意义 |
| 第二章 植物蛋白质组样品制备方法的建立以及优化 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 实验所用试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 1.4 溶液的配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 植物总蛋白提取方法 |
| 2.2 蛋白质定量 |
| 2.3 1-DE蛋白分离 |
| 2.4 凝胶染色 |
| 2.5 图像采集 |
| 2.6 凝胶保存 |
| 3 结果 |
| 3.1 四种作物叶片蛋白质提取方法的得率 |
| 3.2 四种作物叶片总蛋白提取的SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.3 四种作物植物叶片用最适方法所提蛋白SDS-PAGE分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第三章 小麦抗条锈病相关蛋白的质谱分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 生物材料 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 小麦叶片全蛋白的提取方法 |
| 2.2 蛋白定量 |
| 2.3 SDS-PAGE电泳 |
| 2.4 液体酶切 |
| 2.5 色谱条件 |
| 2.6 质谱分析条件 |
| 2.7 质谱数据分析 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 小麦蛋白质蛋白酶切效率与酶切后SDS-PAGE比较分析 |
| 3.2 LC-MS质谱鉴定 |
| 3.3 质谱数据鉴定分析结果评价 |
| 3.4 差异蛋白质分析结果以及GO功能分析 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 结论与创新点 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）大肠杆菌二肽转运蛋白YbgH结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 膜蛋白概述 |
| 1.2 膜转运蛋白 |
| 1.2.1 被动运输 |
| 1.2.2 主动运输 |
| 1.3 MFS家族研究现状 |
| 1.3.1 MFS超家族蛋白分类 |
| 1.3.2 MFS超家族结构生物学研究 |
| 1.3.3 MFS超家族转运机制 |
| 1.4 POT家族研究背景 |
| 1.4.1 POTs家族保守motif |
| 1.4.2 人源POTs家族转运蛋白,PepT1和PepT2 |
| 1.4.3 POTs家族结构生物学研究 |
| 1.4.4 大肠杆菌YbgH(EcYbgH)研究背景 |
| 第2章 膜蛋白的结构生物学研究 |
| 2.1 膜蛋白表达 |
| 2.2 去污剂 |
| 2.2.1 去污剂的分类 |
| 2.2.2 去污剂在溶液中的性质 |
| 2.2.3 去污剂在结构生物学中的应用 |
| 2.3 晶体生长 |
| 2.3.1 膜蛋白晶体堆积方式 |
| 2.3.2 结晶方法 |
| 2.3.3 提高膜蛋白稳定性 |
| 2.4 重原子浸泡 |
| 2.5 数据收集以及结构修正 |
| 2.5.1 同步辐射设施发展 |
| 2.5.2 数据收集、处理 |
| 2.5.3 模型搭建以及结构修正策略 |
| 2.6 展望 |
| 第3章 实验原理与方法 |
| 3.1 克隆构建 |
| 3.1.1 双酶切构建 |
| 3.1.2 不依赖于连接酶的构建 |
| 3.1.3 点突变构建 |
| 3.2 大肠杆菌系统膜蛋白表达 |
| 3.3 破菌、蛋白纯化 |
| 3.4 硒代晶体制备 |
| 3.5 细胞水平的转运试验 |
| 3.6 Western Blot检测膜蛋白表达水平 |
| 第4章 大肠杆菌YbgH的克隆、表达和结晶 |
| 4.1 EcYbgH基本信息 |
| 4.2 EcYbgH的克隆,表达以及纯化条件摸索 |
| 4.2.1 EcYbgH克隆、表达 |
| 4.2.2 EcYbgH不同去污剂 |
| 4.3 EcYbgH晶体筛选和优化 |
| 4.3.1 晶体初步筛选 |
| 4.3.2 晶体优化和重复 |
| 4.3.3 重原子衍生物制备 |
| 第5章 数据收集、结构解析以及修正 |
| 5.1 晶体数据收集 |
| 5.2 相位解析 |
| 5.3 模型搭建以及修正 |
| 5.4 EcYbgH晶体结构分析 |
| 第6章 EcYbgH基于结构的功能研究 |
| 6.1 质子化位点 |
| 6.1.1 膜电位与转运蛋白 |
| 6.1.2 质子化如何成为驱动力 |
| 6.1.3 EcYbgH质子化位点 |
| 6.2 Motif A |
| 6.2.1 Motif A的工作机制 |
| 6.2.2 EcYbgH中的motif A |
| 6.3 V形插入螺旋 |
| 6.3.1 motif A调控模型 |
| 6.3.2 HAB的功能 |
| 6.4 结论与展望 |
| 第7章 CsgG结构与功能研究 |
| 7.1 细菌与Curli |
| 7.2 大肠杆菌Curli的研究 |
| 7.3 CsgG的克隆、表达、纯化以及长晶体 |
| 7.4 CsgG结构解析及修正 |
| 7.5 CsgG结构分析 |
| 7.6 CsgG的功能研究 |
| 第8章 参与的其它工作 |
| 8.1 EcYajR的结构解析 |
| 8.1.1 EcYajR研究背景 |
| 8.1.2 EcYaJR结构解析、修正以及分析 |
| 8.1.3 YAM结构域 |
| 8.2 EcPgpB的结构解析 |
| 8.2.1 EcPgpB研究背景 |
| 8.2.2 EcPgpB晶体结构解析 |
| 8.3 脂多糖合成相关复合物LptD/E |
| 参考文献 |
| 附录1 实验仪器和材料 |
| 附录2 E.coli MFS超家族转运蛋白motif A预测 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文 |
（8）利用19F位点特异性标记和19F核磁共振方法的原位蛋白质相互作用和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 非天然氨基酸标记及应用 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 非天然氨基酸引入方法 |
| 1.2.1 氨基酸特异性引入非天然氨基酸 |
| 1.2.2 位点特异性引入非天然氨基酸 |
| 1.3 氨基酸特异性引入非天然氨基酸方法的应用 |
| 1.3.1 分析蛋白质的合成 |
| 1.3.2 蛋白质整体特性的改变 |
| 1.3.3 在材料科学方面的应用 |
| 1.4 位点特异性引入非天然氨基酸方法的应用 |
| 1.4.1 研究蛋白质相互作用 |
| 1.4.2 研究蛋白质翻译后修饰 |
| 1.4.3 Photocaged氨基酸的应用 |
| 1.4.4 引入生物物理探针和标记研究生物学过程 |
| 参考文献 |
| 第二章 ~(19)F NMR在研究蛋白质结构和功能上的应用 |
| 2.1 概述 |
| 2.2 ~(19)F原子的特性以及在NMR应用中的优点 |
| 2.3 氟标记蛋白质和多肽的合成 |
| 2.4 ~(19)F NMR的应用 |
| 2.4.1 利用~(19)F NMR研究相互作用 |
| 2.4.2 利用~(19)F NMR研究蛋白质结构,功能,动力学 |
| 2.4.3 利用~(19)F NMR研究核酸的结构和功能 |
| 2.4.4 ~(19)F NMR应用于药物筛选和开发 |
| 2.4.5 ~(19)F NMR应用于代谢研究 |
| 参考文献 |
| 第三章 结合~(19)F定点标记和~(19)F NMR研究crude lysate蛋白质相互作用 |
| 3.1 背景介绍 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 目的基因的分子克隆 |
| 3.2.2 蛋白质表达条件的筛选 |
| 3.2.3 非天然氨基酸(三氟甲基苯丙氨酸,tfmF)的合成 |
| 3.2.4 琥珀突变体的构建和非天然氨基酸标记 |
| 3.2.5 非天然氨基酸标记蛋白质的表达和纯化 |
| 3.2.6 蛋白质鉴定 |
| 3.2.7 共表达样品的制备 |
| 3.2.8 Crude lysate样品制备 |
| 3.2.9 采集一维氟谱和弛豫测定 |
| 3.3 实验结果和讨论 |
| 3.3.1 三氟甲基苯丙氨酸(tfmF)合成 |
| 3.3.2 MEKK3 PB1、MEK5 PB1结构域的表达 |
| 3.3.3 突变位点的设计和非天然氨基酸位点特异性标记 |
| 3.3.4 定点标记~(19)FNMR标记研究crude lysate蛋白质相互作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 结合~(19)F NMR和lipodisq研究蛋白质磷酸化 |
| 4.1 背景介绍 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 目的基因获得、非天然氨基酸位点特异性标记蛋白质的表达鉴定 |
| 4.2.2 SMA样品处理 |
| 4.2.3 细胞膜样品的制备 |
| 4.2.4 ~(19)F固体核磁实验 |
| 4.2.5 负染法透射电子显微镜分析 |
| 4.3 实验结果和讨论 |
| 4.3.1 ETK表达条件的筛选 |
| 4.3.2 非天然氨基酸位点特异性标记蛋白质的表达 |
| 4.3.3 ~(19)F固体核磁共振和高分辨率透射电子显微镜分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 利用非天然氨基酸定点标记小分子荧光探针研究蛋白质的结构和功能 |
| 5.1 综述小分子荧光探针的分类和应用 |
| 5.1.1 引言 |
| 5.1.2 小分子荧光探针的分类和应用 |
| 5.1.3 L-(7-hydroxycoumarin-4-yl) ethylglycine |
| 5.2 实验材料和方法 |
| 5.2.1 分子克隆,蛋白质的表达鉴定 |
| 5.2.2 膜蛋白的纯化 |
| 5.2.3 荧光寿命测定 |
| 5.3 实验结果和讨论 |
| 5.3.1 利用小分子荧光探针荧光寿命分析GB1结构信息 |
| 5.3.2 利用小分子荧光探针荧光寿命分析NaK通道离子选择性 |
| 参考文献 |
| 第六章 非天然氨基酸标记和~(19)F NMR研究展望 |
| 6.1 非天然氨基酸标记及其应用的发展 |
| 6.2 ~(19)F NMR研究生物过程的发展 |
| 参考文献 |
| 附录一 蛋白质表达培养基和纯化使用的缓冲液 |
| 附录二 常见表面活性剂相关信息 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（9）蛋白质胶内酶切技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 染色和脱色 |
| 2 杂质去除 |
| 3 蛋白酶切 |
| 4 肽段提取 |
| 5 其他问题 |
| 6 展望 |
（10）嗜冷杆菌Psychrobacter sp.的冷活性、耐盐酯酶基因的克隆、蛋白表达及其酶学性质研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 酯酶简介 |
| 1.1.1 酯酶结构 |
| 1.1.2 酯酶的催化机制 |
| 1.1.3 酯酶分类 |
| 1.2 微生物酯酶来源及蹄选 |
| 1.2.1 微生物脂肪酶 |
| 1.2.2 产酯酶微生物筛选 |
| 1.3 酯酶酶活检测 |
| 1.3.1 平板法 |
| 1.3.2 滴定法 |
| 1.3.3 比色法 |
| 1.4 酯酶应用 |
| 1.4.1 去污剂工业 |
| 1.4.2 医药工业 |
| 1.4.3 食品工业 |
| 1.5 冷活性酶 |
| 1.5.1 冷活性酶来源 |
| 1.5.2 冷活性酶生化特点 |
| 1.5.3 冷活性酶分子结构特点 |
| 1.5.4 冷活性酯酶的应用 |
| 1.5.4.1 医学和医药中的应用 |
| 1.5.4.2 精细化合物的合成 |
| 1.5.4.3 食品工业中的应用 |
| 1.5.4.4 家庭使用 |
| 1.5.4.5 环境应用 |
| 1.6 本研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 溶液 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 产脂肪酶的深海细菌筛选与鉴定 |
| 2.2.1 深海细菌的培养 |
| 2.2.2 产脂肪酶深海细菌的筛选 |
| 2.2.3 产脂肪酶细菌的16S rRNA分子鉴定 |
| 2.3 产脂肪酶细菌基因组文库构建 |
| 2.3.1 基因组总DNA抽提 |
| 2.3.2 基因组总DNA预酶切及片段回收 |
| 2.3.3 酶连 |
| 2.3.4 大肠杆菌感受态制备 |
| 2.3.5 电转化 |
| 2.3.6 基因组文库质量的检测 |
| 2.4 文库筛选和克隆子鉴定 |
| 2.4.1 产脂肪酶克隆子筛选 |
| 2.4.2 抽提重组克隆子质粒并测序 |
| 2.4.3 生物信息学分析插入片段 |
| 2.4.4 酯酶蛋白质氨基酸序列分析及进化树分析 |
| 2.5 酯酶基因克隆 |
| 2.5.1 酯酶基因的PCR扩增 |
| 2.5.2 PCR片段回收、酶切及回收 |
| 2.5.3 载体pGEX-6p-1的制备 |
| 2.5.4 酶连 |
| 2.5.5 重组质粒转化及验证 |
| 2.6 酯酶基因表达和纯化 |
| 2.6.1 酯酶基因诱导表达 |
| 2.6.2 酯酶蛋白纯化 |
| 2.6.3 蛋白浓度测定 |
| 2.7 酯酶酶学性质研究 |
| 2.7.1 绘制对硝基苯酚标准曲线 |
| 2.7.2 酯酶酶学性质检测方法 |
| 2.7.3 酯酶最适反应温度测定 |
| 2.7.4 酯酶最适反应pH测定 |
| 2.7.5 酯酶温度稳定性测定 |
| 2.7.6 酯酶pH稳定性测定 |
| 2.7.7 金属离子和化合物对酯酶活性影响 |
| 2.7.8 高浓度NaCl溶液对酯酶活性和稳定性的影响 |
| 2.7.9 不同有机溶剂对酯酶稳定性影响 |
| 2.7.10 不同去污剂对酯酶活性和稳定性的影响 |
| 2.7.11 酯酶底物特异性 |
| 2.7.12 酯酶酶动力学常数测定 |
| 2.8 酯酶三级结构模拟和分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 产酯酶深海细菌筛选结果 |
| 3.2 菌株分子鉴定 |
| 3.3 基因组文库构建及筛选 |
| 3.3.1 总DNA提取 |
| 3.3.2 总DNA预酶切及酶切片段回收 |
| 3.3.3 酶连产物转化大肠杆菌E. coli DH5α |
| 3.3.4 文库筛选 |
| 3.4 克隆子测序及分析 |
| 3.4.1 酯酶基因est10分析 |
| 3.4.2 酯酶基因est12分析 |
| 3.4.3 酯酶蛋白进化树分析 |
| 3.5 酯酶基因克隆 |
| 3.6 酯酶蛋白诱导表达纯化 |
| 3.8 酶学性质检测 |
| 3.8.1 对硝基苯酚标准曲线 |
| 3.8.2 温度对酯酶活性和稳定性的影响 |
| 3.8.3 不同pH对酯酶活性和稳定性的影响 |
| 3.8.4 金属离子和化合物对酯酶活性影响 |
| 3.8.5 高浓度NaCl溶液对酯酶活性和稳定影响 |
| 3.8.6 有机溶剂对酯酶稳定性影响 |
| 3.8.7 去污剂对酯酶活性和稳定性影响 |
| 3.9 酯酶底物特异性分析 |
| 3.10 酯酶动力学常数 |
| 3.11 酯酶蛋白三维结构模拟 |
| 4 讨论 |
| 4.1 嗜冷杆菌Psychrobacter sp.特点 |
| 4.2 冷活性分析 |
| 4.3 耐盐性质 |
| 4.4 有机溶剂耐受 |
| 4.5 潜在的应用价值 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
四、用非离子去污剂提高胶内酶切效率的初探（论文参考文献）
- [1]TGR5对成骨细胞分化的影响及相关机制研究[D]. 王庆锋. 苏州大学, 2020(06)
- [2]细菌内膜蛋白插入酶YidC的结构与功能研究[D]. 辛彦龙. 中国科学技术大学, 2018(10)
- [3]IL-21与肝素相互作用并初步揭示其Gamma受体亚基胞内域的构象[D]. 吴灼. 华中师范大学, 2018(01)
- [4]基于质谱技术的蛋白质翻译后修饰研究[D]. 马敏. 天津大学, 2017(06)
- [5]鞘糖脂人工生物合成关键酶的结构、功能及分子改造[D]. 韩云宾. 上海交通大学, 2016(01)
- [6]几种作物蛋白质样品制备及小麦抗条锈病相关蛋白质组分析[D]. 姜超. 湖南农业大学, 2015(02)
- [7]大肠杆菌二肽转运蛋白YbgH结构与功能研究[D]. 赵岩. 中国科学技术大学, 2015(09)
- [8]利用19F位点特异性标记和19F核磁共振方法的原位蛋白质相互作用和功能分析[D]. 李冬. 中国科学技术大学, 2015(09)
- [9]蛋白质胶内酶切技术研究进展[J]. 姜超,张学文,潘映红. 生物技术通报, 2015(01)
- [10]嗜冷杆菌Psychrobacter sp.的冷活性、耐盐酯酶基因的克隆、蛋白表达及其酶学性质研究[D]. 吴国杰. 华中农业大学, 2014(09)