一、用RT-PCR检测篮舌病毒（论文文献综述）
孙爱军,王芮,朱潇静,孟泽锟,刘思源,张帅,靳家鑫,张改平,庄国庆[1]（2021）在《非洲猪瘟相关检测及猪场生物安全防控研究进展》文中进行了进一步梳理非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）感染猪导致的一种急性、烈性、高度接触性传染病。各日龄猪均易感,因尚无安全有效的疫苗进行预防,感染致死率可达到100%,引起了重大生物安全问题。快速准确的诊断及消毒对于ASF防控有着重要的作用。本研究旨在总结ASF相关的检测方法,以及借鉴国外猪场可能采取的生物安全相关措施,为我国实际生产中ASF防控提供理论参考。
高彩霞[2]（2020）在《草鱼呼肠孤病毒基因Ⅱ型病毒样颗粒的制备及免疫效果评价》文中进行了进一步梳理草鱼出血病（Grass carp haemorrhagic disease,GCHD）是由草鱼呼肠孤病毒（Grass Carp Reovirus,GCRV）感染所引起的一种烈性草鱼传染病,现列为农业部二类动物疫病。GCRV隶属呼肠孤病毒科（Reoviridae）,水生动物呼肠孤病毒属（Aquareovirus）,呈正二十面体对称球形颗粒,直径为6572 nm,无囊膜,具有双层衣壳,GCRV基因组由11条分节段的双链RNA（ds RNA）组成。根据基因序列的差异将GCRV大致分为I、Ⅱ和ⅡI 3个基因型,目前GCRV基因Ⅱ型（GCRV-Ⅱ）为主要流行株型,对草鱼的致病性强,致死率高。目前还没有特效的药物治疗,疫苗免疫是防控草鱼出血病最为有效的措施。因此,研制出一种安全高效的GCRV-Ⅱ疫苗迫在眉睫。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）是由病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而组成的高度结构化空心颗粒,形态类似于真实的病毒粒子。VLPs具有类似于天然病毒的理化性质,能被抗原提呈细胞摄取加工并递呈,可诱导体液免疫和细胞免疫反应,安全性高,免疫原性好。前期研究表明,GCRV-Ⅱ S3、S6、S9和S10编码的结构蛋白有较强的免疫原性,本研究利用杆状病毒表达系统来构建GCRV-Ⅱ的VLPs,选取GCRV-Ⅱ S3、S6、S9和S10四个基因构建重组杆状病毒,通过多个重组杆状病毒不同的组合方式构建了多个GCRV-Ⅱ VLPs,并对其免疫效果进行评价,为开发安全、有效的GCRV-Ⅱ VLPs候选疫苗奠定基础。本研究主要包括以下四部分内容:1.GCRV-Ⅱ S3、S6、S9和S10基因重组杆状病毒的构建及目的蛋白的表达:研究选取了GCRV-Ⅱ S3、S6、S9和S10四个基因分别构建了重组杆状病毒pFBH-S3、pFBH-S6、pFBH-S9和pFBH-S10,用RT-PCR、间接免疫荧光（IFA）和蛋白质印迹（Western blot）鉴定重组杆状病毒的构建及蛋白表达情况。RT-PCR显示,被感染的Sf9细胞中可以检测到S3、S6、S9、S10 mRNA,但IFA和Western blot检测结果显示,只有S3、S6、S10基因编码的蛋白成功表达,而S9基因编码的蛋白未检出。说明重组杆状病毒pFBH-S3、pFBH-S6、和pFBH-S10能成功表达出目的蛋白。2.GCRV-Ⅱ S6、S9和S10基因的密码子优化和重组杆状病毒的构建及表达:通过GENE PROJECT软件对前面表达效果不理想的S6、S9、S10基因的ORF密码子进行优化,并构建了重组杆状病毒pFBH-opti-S6、pFBH-opti-S9和pFBH-opti-S10,通过IFA和Western blot鉴定显示,S6、S9、S10基因编码的蛋白均成功表达,并且经密码子优化后的S6、S10蛋白表达量明显提高,说明重组杆状病毒pFBH-opti-S6、pFBH-opti-S9和pFBH-opti-S10能高效的表达出目的蛋白。3.基于六种重组杆状病毒不同组合共感染策略分别构建GCRV-Ⅱ VLPs:实验对以上构建的6种重组杆状病毒采用了不同组合的方式进行了共感染组装VLPs,分别为S3-S6-VLP、S3-S6-S10-VLPs和opti-S6-S9-S10-VLPs,经IFA鉴定显示,三种VLPs中目的蛋白均得到了表达,通过细胞超薄切片电镜观察及纯化后的VLPs电镜观察显示,不同重组杆状病毒表达的蛋白皆可在昆虫细胞中自行组装成形状与GCRV-Ⅱ相似的VLPs,大小在40nm60nm之间。实验成功构建了GCRV-Ⅱ S3-S6-VLPs、S3-S6-S10-VLPs和opti-S6-S9-S10-VLPs。4.GCRV-Ⅱ三种VLPs免疫效果评价:将纯化的三种VLPs分别免疫草鱼,实验设置阴性对照组、加佐剂组和不加佐剂组。结果显示,三种不同VLPs免疫后都能引起鱼体的免疫反应。ELISA结果显示S3-S6-S10-VLPs和opti-S6-S9-S10-VLPs加佐剂组草鱼血清OD450nm值最高,为0.84和0.83,相对荧光定量结果显示5个免疫相关基因IFN,TLR-3,TLR-7,Mx和IgM的mRNA相对表达量约是PBS对照组的5120倍,与对照组相比均显着升高（P<0.05）;攻毒实验结果表明,GCRV-Ⅱ S3-S6-VLP、S3-S6-S10-VLPs和opti-S6-S9-S10-VLPs未加佐剂组的相对保护率为41.67%、75.00%、58.33%,而加佐剂组的相对保护率分别为58.33%、83.33%、79.17%,以上结果表明,GCRV-Ⅱ三种VLPs均对草鱼具有一定的免疫保护作用,其中S3-S6-S10-VLPs加佐剂组的免疫保护效果最好。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建GCRV-Ⅱ VLPs疫苗,并评价其免疫效果。结果显示,VLPs疫苗能诱导草鱼产生体液免疫和细胞免疫反应,对草鱼具有一定的免疫保护作用,其中以S3、S6及S10三种结构蛋白构建的重组杆状病毒经共感染后组装出的VLPs免疫保护效果最好。本研究不仅为草鱼出血病的免疫防控提供了技术储备,也为其他水生动物疾病病毒样颗粒疫苗的构建提供了思路和方法。
李成辉,肖朋朋,赵冠宇,张克龙,李卓昕,南福龙,陈竞,张涵,马彬尧,韩继成,金鑫,田明尧,鲁会军,金宁一[3]（2019）在《蓝舌病毒RT-PCR检测方法的建立及对云南省库蠓蓝舌病流行病学检测》文中研究表明建立蓝舌病毒（bluetongue virus,BTV）RT-PCR检测方法,用于2018年云南省库蠓的蓝舌病（BT）流行病学检测。设计2对保守引物,优化RT-PCR方法的退火温度、循环次数、退火时间和延伸时间,并进行灵敏性和特异性评价。采集了昭通市3个县及普洱市澜沧县的BT传播媒介库蠓共25万余只,进行研磨后,用建立的RT-PCR方法检测样本。筛选出1对引物BTVS10-F和BTVS10-R作为蓝舌病毒RT-PCR检测引物,敏感度达到102.5 TCID50/0.1 mL,通过对BTV16型的阳性病毒检测,证实该方法的可行性。
丁梦玥[4]（2018）在《新疆牛蓝舌病病毒的分离及全基因组测序》文中研究表明蓝舌病（Bluetongue,BT）是由蓝舌病病毒（BTV）引起的一种经由库蠓、伊蚊等媒介昆虫叮咬传播的严重侵害反刍动物的急性病毒性虫媒病。世界动物卫生组织（OIE）规定蓝舌病为法定上报传染病,我国规定为一类传染病。该病的死亡率一般在10%左右,由于近年来该病的发病率逐渐上升,已严重影响了动物贸易。该项目根据蓝舌病在新疆的流行病学史和媒介昆虫的习性,结合地理位置、气候特点、牧区分布等因素,选择新疆巴州尉犁县墩阔坦乡某场作为建立监控群的监控点,于2016年对年龄小于1岁的家畜进行筛选后,选取BT检测结果为阴性的10头牛、10只山羊和10只绵羊作为哨兵动物建立监控群。每周采集监控动物群血样一次,每次采集普通采血管（分离血清）、肝素钠抗凝采血管和EDTA抗凝采血管共3管,从2016年6月28日开始到2016年12月6日共采样21次,采集血清492份。用BTV竞争ELISA试剂盒检测血清BTV抗体,将所有采集的监控动物群血样接种于BHK-21细胞、Vero细胞和C6/36细胞进行BTV分离,每日观察记录细胞是否病变。对出现细胞病变（CPE）的细胞液进行鉴定;群特异性鉴定采用BTV抗原捕获ELISA（AC-ELISA）、RT-PCR扩增BTV VP7片段以及免疫电镜观察方法;型特异性鉴定采用病毒中和试验;对分离到的BTV（4630号样品）进行全基因测序和初步分析。用BTV竞争性ELISA检测了血清492份,总阳性率为0.41%（2/492）,山羊的阳性率为1.29%（2/155）,转阳时间是10月10日和10月17日,监控动物群中的绵羊、牛未发生转阳。将492份血样接种细胞后,有18份样品出现CPE,其中有12份样品在盲传至第3代的第3天出现CPE,有6份样品在盲传至第4代的第3天出现CPE,出现CPE的18份样品有4份样品来源于牛。对18份CPE样品进行AC-ELISA检测,结果显示都为BTV阳性。对4份牛源样品进行BTV VP7 RT-PCR的扩增,在1100 bp处出现条带单一的目标条带。对4份牛源样品测定TCID50,TCID50在10-3.25/0.1m L至10-4.33/0.1 m L之间。对牛源4630号样品进行中和试验,结果显示,4630号样品与BTV-1～BTV-24型标准血清无中和反应,不属于BTV-1～BTV-24型,进行免疫电镜观察,可观察到具有环状病毒属病毒形态典型特征的病毒颗粒。对分离株BTV/XJYL/2016/01进行全基因组的测序,测序结果说明BTV/XJYL/2016/01毒株与新疆分离的BTV V196毒株和XJ1407毒株相似度最高,BTV/XJYL/2016/01毒株确实为蓝舌病病毒且为新的血清型,是新疆首次从牛上分离的蓝舌病毒。
刘帅[5]（2017）在《新疆尉犁县库蠓种类鉴定及其盖塔病毒分离和遗传特性研究》文中研究指明盖塔病毒（Getah virus,GETV）是披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）西门利克病毒复合组的一种单链RNA病毒。由吸血节肢动物传播,现广泛分布于东南亚、太平洋岛屿及澳大利亚等地。该病毒可感染马、猪等多种动物,引起发热、荨麻疹、全身淋巴结肿大、流产等症状;在人体内也检测到抗盖塔病毒抗体。盖塔病毒对家畜乃至人类的健康是一个潜在的巨大威胁。本研究于2016年7月中、下旬在新疆尉犁县墩阔坦牛、羊圈内采集库蠓约20000只、羊血清10份和牛血清5份。随机抽取2000只库蠓,经75%酒精固定,用于库蠓种类鉴定;其余18000只库蠓每50只为一组进行研磨,分别接种于BHK-21、C6/36和Vero细胞,盲传5代,用于分离病毒;用RT-PCR、中和试验、免疫电镜观察等方法对分离病毒进行鉴定;对分离到的盖塔病毒非结构蛋白区、衣壳蛋白区、E2蛋白区和3’非翻译区4个基因片段测序,进行遗传特性分析;将分离到的盖塔病毒与采集的5份牛血清、10份羊血清进行中和试验,以了解盖塔病毒对当地牛羊的感染情况。通过库蠓翅膀斑纹形态观察和分子生物学方法鉴定出尉犁县五个种类库蠓,分别为:伪盐库蠓（40.9%）、刺螯库蠓（20.25%）,环斑库蠓（15.55%）、和田库蠓（4.15%）和帛琉库蠓（4.00%）,其中伪盐库蠓属于绝对优势库蠓种,未鉴定出种的库蠓有323只,占总数16.15%。将库蠓研磨液接种细胞后,C6/36和Vero细胞盲传5代均无细胞病变（CPE）,XJ73在BHK-21细胞盲传第2代出现CPE,收获病毒液,先用5-氟脱氧尿核苷鉴定其为RNA病毒,随后通过甲病毒属通用引物PCR,中和试验和免疫电镜观察等方法鉴定其为盖塔病毒。通过对XJ73毒株的非结构蛋白区、衣壳蛋白区、E2蛋白区和3’非翻译区4个基因片段测序后,与GenBank数据库中其它盖塔病毒比较发现,XJ73毒株与2005年从日本高知县猪的盖塔毒株（AB859822.1）同源性高达99%,而与我国海南、云南、河北、甘肃、上海分离到的盖塔毒株亲缘关系相对较远,同源性在97%98%之间。另外,XJ73毒株与采集的15份牛、羊血清的中和试验结果显示,有2份牛血清和1份羊血清可与XJ73毒株发生中和反应。本研究鉴定出新疆尉犁县五个库蠓种类,其中伪盐库蠓为绝对优势库蠓种;首次从新疆库蠓体内分离到盖塔病毒,其同源性与日本株最高,达99%,与我国分离株在97%98%之间;新疆牛、羊存在盖塔病毒感染现象。
李明骏[6]（2017）在《玉米AKINβγ蛋白与水稻黑条矮缩病毒P8蛋白的分子互作研究》文中指出水稻黑条矮缩病毒（Rice black streaked dwarfvirus,RBSDV）引起的玉米粗缩病是危害我国玉米生产的一种主要病害。RBSDV是呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）的成员,目前关于其与玉米寄主的分子互作报道较少。本文以RBSDV副核心蛋白P8为诱饵筛选玉米茎叶cDNA文库,获得与之互作的寄主因子ZmAKINβγ蛋白,研究了 P8与ZmAKINβγ蛋白的相互作用以及ZmAKINβγ与RBSDV之间的相互影响,初步探索了 ZmAKINβγ在RBSDV侵染玉米过程中的功能以及ZmAKINβγ影响病毒侵染所参与的生理路径。利用酵母双杂交（yeast-two hybrid,Y2H）和双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation,BiFC）实验证明了 P8与ZmAKINβy-2以及玉米中ZmAKINβγ基因另一拷贝编码蛋白ZmAKINβy-1在酵母、本生烟和玉米原生质体细胞中的互作。P8与AKINβγ蛋白的互作不具有寄主特异性,而是依赖于ZmAKINβγ蛋白N端的KIS（kinase interacting sequence）和第一个CBS（cystathionine β-synthase）保守结构域。对P8与ZmAKINβy-1/-2蛋白的亚细胞定位研究表明,P8与ZmAKINβy-1/-2均定位于本生烟细胞和玉米原生质体细胞的细胞质与细胞核中,且P8可在核仁中聚集,ZmAKINβy-1/-2与P8共表达使P8无法聚集于核仁中。而P8的表达会抑制ZmAKINβγ-1/-2作为γ亚基参与snf4Δ酵母突变体细胞糖代谢途径的功能。RBSDV侵染后不同时间点差异调控ZmAKINβγ-1/-2基因的表达。基因枪轰击介导的瞬时表达实验表明RBSDV侵染改变ZmAKINβγ-1/-2在玉米叶片中的亚细胞定位。为解析ZmAKINβγ-1/-2基因的生理功能及其在RBSDV侵染过程中的作用,用雀麦花叶病毒（Brome mosaic virus,BMV）VIGS系统同时沉默ZmAKINβγ-1/-2基因,结果显示,ZmAKINβγ-1/-2的沉默会影响蔗糖和淀粉代谢途径中多个基因的表达,并提高葡萄糖和蔗糖的积累量。同时,沉默ZwAKINβγ-1/-2基因后的RBSDV挑战接种实验表明ZmAKINβγ1/-2基因的下调表达会促进RBSDV的积累,进一步发现外施葡萄糖促进RBSDV的积累。RBSDV侵染调控糖代谢途径相关基因的表达,上调葡萄糖的含量而下调蔗糖的含量。ZmAKINβγ-2以及水稻和本生烟编码的AKINβγ同源物均可诱导本生烟细胞坏死反应,但P8的表达并不影响ZmAKINβγ-2诱导细胞坏死的活性。ZmAKINβγ除可响应RBSDV的侵染,甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV）或玉米褪绿斑驳病毒（Maize chlorotic mottle virus,MCMV）的侵染均可调控ZmAKINβγ基因的表达,说明ZmAKINβγ基因可响应不同类型病毒的侵染。本论文的研究表明ZmAKINβγ作为普遍响应病毒侵染的寄主蛋白,在RBSDV侵染玉米过程中与P8蛋白直接互作并参与抵抗RBSDV的侵染;本文明确了 ZmAKINβγ可以参与玉米糖代谢调控,并且糖代谢路径在RBSDV与玉米互作过程中发挥重要作用。本研究有助于揭示玉米寄主抵御RBSDV侵染的抗病机制,对于玉米抗粗缩病基因的挖掘和抗病玉米种质的创制可能具有重要的参考价值。
邢闪闪[7]（2016）在《蓝舌病毒感染细胞（A.albopictus和PST）miRNA表达谱的鉴定与功能分析》文中指出蓝舌病（Bluetongue）是由蓝舌病毒（Bluetongue virus,BTV）引起的以媒介昆虫库蠓为主要传播媒介的一种非接触性传染病,其易感动物为绵羊、山羊、牛和鹿等反刍动物。蓝舌病的暴发经常给家畜养殖业造成巨大经济损失,因此世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须上报的动物传染病。BTV隶属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）。microRNA（miRNA）是大小约为19-25个核苷酸具有调控功能的一类非编码单链小RNA。近年来研究表明,miRNA在病原-媒介-宿主相互作用过程中发挥重要的调控作用,可通过调控靶基因的表达影响病毒的感染与复制,在宿主细胞的免疫调控和抗病毒反应中发挥重要作用。目前,人们对BTV与细胞相互作用的理解非常有限,细胞miRNA在BTV感染过程中的作用仍不清楚。本研究首先利用Solexa高通量测序技术对BTV感染的白纹伊蚊（Aedes albopictus,A.albopictus）细胞和原代绵羊睾丸（primary sheep testis,PST）细胞及其未感染样品进行miRNA测序,借助生物信息学技术对差异表达miRNA及其靶基因进行功能注释和分析,通过实时定量PCR方法对部分差异miRNA和靶基因的表达丰度进行了验证。同时选择了三个表达差异的miRNA,对其在BTV复制过程中的作用机制进行了初步研究,结果如下:1.BTV感染A.albopictus细胞组和对照组经高通量测序获得11,206,854和12,125,274个可信序列标签,分别含89和92个已知miRNA,266和181个新预测miRNA。两组之间有15个已知miRNA和125个新miRNA发生显着差异表达。GO和KEGG分析显示靶基因主要参与内吞作用、代谢途径、FoxO、Hippo、Jak-STAT和MAPK等信号通路,表明miRNA在BTV感染媒介细胞过程中发挥广泛的调控作用。2.选取具有差异表达的aae-miR-1889-5p和aae-miR-2940-5p为靶标,将其模拟体、抑制剂及对照转染A.albopictus细胞,并利用qRT-PCR和噬斑试验分析BTV在转染细胞中的增殖效率,结果表明两种miRNA模拟体可分别上调BTV NS3基因表达1.55-2.88倍和2.00-3.22倍,且病毒滴度均增加,而miRNA抑制剂可明显分别下调BTV NS3基因的表达0.54-0.64倍和0.55-0.86倍,且病毒滴度均降低,表明aae-miR-1889-5p和aae-miR-2940-5p均可促进BTV在A.albopictus细胞中复制。3.BTV感染PST细胞组和对照组经高通量测序获得10,908,164和11,920,794个可信序列标签,分别含87和90个已知miRNA,182和155个新预测miRNA。两组之间有2个已知miRNA和70个新miRNA发生显着的差异表达。GO功能和KEGG路径分析显示差异表达miRNA的靶基因主要参与催化活性、病毒感染、内吞作用、代谢途径等信号通路,表明miRNA在BTV感染宿主细胞的多个环节同样具有潜在的调控作用。4.进而选取novel-mir-105为靶标,将其模拟体、抑制剂及对照转染PST细胞,并利用qRT-PCR和噬斑试验分析BTV在转染细胞中的增殖效率,结果表明miRNA模拟体转染组BTV NS3基因下调0.32-0.80倍,且病毒滴度降低,而miRNA抑制剂转染组BTV NS3基因上调2.09-2.41倍,且病毒滴度增加,表明novel-mir-105抑制BTV在PST细胞中复制。
李琼毅[8]（2015）在《细胞内表达抗独特型单链抗体抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞的研究》文中提出猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）为单股正链RNA病毒,与鼠乳酸脱氢酶增高病毒、马动脉炎病毒和猴出血热病毒同属套氏病毒目动脉炎病毒科,是全球性猪传染病—猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）的病原。该病以母猪发生繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高热和高死亡率、免疫抑制和持续性感染等为主要特征。由于PRRSV表现出较其他RNA病毒更高的突变率,同时具有破坏宿主固有免疫系统的潜能,且迄今为止尚无有效的弱毒苗或灭活疫苗控制该病的发生与传播,PRRS几乎在世界上所有的养猪国家均有流行,造成了巨大的经济损失。本实验室早期研究证明PRRSV感染可产生针对GP5蛋白的抗独特型抗体,该抗体在机体抗病毒免疫应答及疾病转归中发挥重要作用;并且通过顺序免疫法得到了在功能上模拟PRRSV GP5蛋白的单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2,研究证实该抗体仍保留自身抗独特型抗体的特性并且可下调弱毒苗对猪只的免疫保护作用。前期研究结果提示抗独特型抗体的功能较为复杂,其调控机体免疫应答的机制尚需要深入研究。然而,通过猪血清获得抗独特型抗体的数量有限且动物试验花费较大耗力较多,因此,构建细胞内表达单链抗体的细胞模型用于抗独特型抗体功能和免疫机制的前期研究更为理想。本论文的主要研究目的是构建抗独特型单链抗体的真核表达载体,经慢病毒转导使其在MARC-145细胞中表达,通过研究胞内表达抗独特型抗体后PRRSV的复制和增殖情况,验证其对病毒感染的影响并初步探索其产生机制。本课题研究的内容和结果如下:1.通过RT-PCR方法从Mab2-5G2杂交瘤细胞中分别扩增出重链可变区和轻链可变区基因,测序正确后通过弹性连接子（GGGGS）3经Overlap PCR连接组成一个完整的单链可变区抗体（scFv）;再用GPGP连接子将5G2scFv和EGFP融合表达并连接至慢病毒表达载体;以抗禽戊型肝炎病毒E抗原单克隆抗体1B5为模板,构建1B5scFv作为对照,构建质粒分别命名为pTRIP-CMV-5G2scFv-GPGP-EGFP-IRES-Puro和pTRIP-CMV-1B5scFv-GPGP-EGFP-IRES-Puro。测序结果证实慢病毒载体构建成功。2.使用293T细胞包装重组慢病毒,收集细胞上清将表达5G2scFv和1B5scFv的重组慢病毒转导MARC-145细胞,经嘌呤霉素抗性筛选和增强绿色荧光蛋白（EGFP）筛选单克隆。间接免疫荧光试验和Western blot试验证实5G2scFv或1B5scFv在MARC-145细胞中稳定表达,细胞系构建成功,分别命名为MARC-5G2scFv和MARC-1B5scFv。细胞活力试验结果提示细胞内表达单链抗体不影响细胞活力。3.为了验证细胞内表达5G2scFv是否抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制增殖,本研究对MARC-5G2scFv细胞系进行了攻毒试验。SD16和VR-2332毒株感染48h后,通过Western blot和TCID50方法分别检测N蛋白和子代病毒的产生。试验结果显示N蛋白表达量在MARC-5G2scFv细胞中显着下降,而在MARC-1B5scFv细胞和MARC-145中不受影响;与上述发现一致,同一时间MARC-5G2scFv上清中的病毒滴度也显着降低（P<0.05）。而且,该抑制作用在0.01MOI、0.1MOI和1MOI的接毒剂量时均可出现。接毒后不同时间收集上清并测定各组样品毒价后提示MARC-5G2sc Fv细胞上清中病毒滴度显着低于MARC-1B5scFv细胞和MARC-145细胞（P<0.05）,且在接毒后12h最为明显（P<0.001）。4.通过病毒吸附试验和检测I型干扰素表达初步探讨胞内表达5G2scFv下调病毒复制增殖的机制。荧光定量PCR和病毒滴度检测结果显示病毒吸附并无明显改变（P>0.05）,提示胞内表达5G2scFv不影响病毒吸附MARC-145细胞。I型干扰素转录和表达检测结果显示,接毒48h后,MARC-5G2scFv细胞中IFN-α的转录和表达较未感染的MARC-5G2scFv细胞及感染后MARC-1B5scFv和MARC-145细胞明显升高（P<0.05）,而在MARC-1B5scFv和MARC-145细胞中无明显变化（P>0.05）;但是三组细胞中IFN-β的转录和表达在感染前后均无明显改变（P>0.05）。以上结果提示胞内表达5G2scFv抑制病毒感染可能与IFN-α表达上调有关。综上所述,本研究通过构建抗独特型单链抗体并使其在MARC-145细胞中稳定表达,对5G2scFv胞内表达会否影响的PRRSV感染及其机制进行了一系列的研究。本试验首次构建稳定表达抗独特型单链抗体的MARC-145细胞系;证明其胞内表达可抑制病毒复制增殖;该作用并非通过抑制病毒吸附实现而与IFN-α分泌增加相关。本研究拓展了抗独特型单链抗体的应用,为寻找新的治疗方法和疫苗提供了新思路。
郑雅匀[9]（2014）在《我国山西、河南虫媒病毒调查及西藏新分离环状病毒分子进化遗传分析》文中进行了进一步梳理背景山西省地处黄河流域中部、华北平原的西侧,四周分别与内蒙古、河北、河南、陕西四省相邻。省内四周山环水绕,大部分地区海拔在1000米左右,全省自北向南分布有6大盆地,地形复杂、气候多样,促成了媒介生物种类的多样性和繁杂性。河南省位于我国中部偏东、黄河中下游地区,属于北亚热带、暖温带气候,这里日照充足、降水丰沛,同样存在种类丰富的媒介昆虫。对山西省和河南省的病毒性脑炎流行病学监测结果显示,在蚊虫活动高峰的夏秋季节,当地存在病毒性脑炎患者。两个省份也一直存在乙型脑炎的病例,其中河南省至今仍为乙脑病例的高度流行区。上一个十年,我国科学工作者分别对山西和河南省进行虫媒病毒病原学调查,分离到乙脑,盖塔,版纳病毒以及发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）等,对于解释当地虫媒病毒感染提供了重要的基础数据。但是10年来,经济的快速发展,农村城镇化,农业生产方式的改变等使得当地虫媒病毒滋生环境发生较大变化,为此,再次开始调查对于了解当地存虫媒病毒种类及分布情况,预测相关病原潜在致病性和致病能力,预防和控制当地虫媒病毒病等方面均具有重要意义。本实验室于2009年在西藏林芝地区墨脱县和米林县开展蚊虫及蚊传虫媒病毒调查工作,在蚊虫标本中分离到两株可以引起BHK-21细胞病变的病毒,本实验对以上两个病毒分离物开展生物学表型、病毒分子鉴定、病毒分子遗传进化研究,以及病毒与当地动物感染性关系等研究。目的本课题通过在山西、河南省、西藏自治区蚊传虫媒病毒的调查研究,掌握当地蚊媒及其携带病毒的种类和分布信息,开展相关蚊传病毒的深入研究,为当地蚊传虫媒病毒病的预防和控制提供本底信息和理论依据。研究方法2012年夏季在山西省、河南省多地采集蚊虫标本,将标本现场分类鉴定后液氮保存,运送至实验室备用。将蚊虫标本,分批研磨离心,取上清接种组织细胞进行培养,对阳性分离物首先使用种属特异引物进行扩增测序,对于未知病毒,使用454高通量测序等技术获得序列信息,使用Clustal X2.1、MegAlign、Genedoc3.2和Mega v5.1生物信息学软件进行病毒核苷酸和氨基酸序列比对及系统进化分析；使用马尔科夫蒙特卡洛方法,对我国新分离双链RNA病毒（环状病毒和Seadornavirus属病毒）进行系统进化分析及病毒共同进化祖先分析（tMRCA）.结果1、山西省蚊传病毒分离鉴定本研究于2012年夏季,在山西省运城市临猗县和永济市8个乡镇设立19个采集点,共采集蚊虫10455,经鉴定分为4属7种,其中库蚊属两种：淡色库蚊、三带喙库蚊；伊蚊属3种：背点伊蚊、白蚊伊蚊、刺扰伊蚊；按蚊属1种：中华按蚊；阿蚊属1种：骚扰阿蚊。不同地区的蚊种构成和优势蚊种存在明显差异,临猗县优势蚊种为淡色库蚊（91.96%,3911/4253）；永济市优势蚊种为三带喙库蚊（72.85%,4518/6202）。本研究中共使用5种诱蚊灯（器材）,其中功夫小帅和CDC诱蚊灯采蚊效果最佳,能够满足捕捉蚊虫数量和种类的多样性。采用组织细胞培养法,将10455只蚊虫标本按照蚊种、采集工具和采集时间地点分190批进行研磨,上清接种细胞连续传代3次,结果分离到23株阳性分离物,来自于4个蚊种。包括三带喙库蚊、淡色库蚊、白蚊伊蚊和骚扰阿蚊。经过分子生物学鉴定,共得到15株乙脑病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、4株库蚊黄病毒（Culex Flavivirus, CxFV）、3株淡色库蚊浓核病毒（Culex pipiens pallens densovirus, CppDNV）和1株盖塔病毒（Getah virus, GETV）从三带喙库蚊和淡色库蚊中分离到病毒最多,分别是12株和10株,其中三带喙库蚊中乙脑病毒的批次阳性率和现场最低感染率最高,分别为14.1%和1：405。所有JEV病毒均为经过C6/36细胞扩增培养后,转接BHK21、Vero细胞可导致二者出现细胞病变效应（Cytopathic effect, CPE）。对新分离病毒进行分子生物学特征分析显示,15株JEV均为基因Ⅰ型病毒,各分离株之间E基因核苷酸和氨基酸序列同源性为99.6%～100%和99.80%～100%。新分离株与疫苗株SA14-14-2在E基因区段存在11处共同的氨基酸差异,但差异位点均不处在决定抗原性的关键氨基酸位点。首次从山西省分离到4株CxFV,各分离株之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.9%-100%和99.8%-100%,系统进化分析显示山西分离株与我国山东分离株亲缘关系最接近,其次与辽宁株较为接近。本研究中GETV亦为山西省首次分离,该毒株与我国上海2005年GETV分离株遗传关系相近,二者E2基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性在99%以上。2、河南省蚊传病毒分离鉴定本研究于2012年5月～8月在河南省洛阳市新安县、信阳市息县采集蚊虫标本,共采集淡色库蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、中华按蚊、白蚊伊蚊4属5种共计7149只蚊虫标本。其中洛阳市新安县的优势蚊种为骚扰阿蚊,淡色库蚊是信阳市息县优势蚊种。对所有标本分170批进行研磨和病毒分离,结果分离到5个阳性分离物均为JEV,其中2株来自于三带喙库蚊,3株分自于淡色库蚊。新分离病毒的分子生物学特征分析显示,所有5株JEV均为基因Ⅰ型病毒,分离株之间E基因核苷酸和氨基酸序列同源性为98.6%～99.9%和99.8%～100%。新分离JEV与疫苗株SA14-14-2在E基因区段存在11处共同的氨基酸差异,差异位点均未处于决定抗原性的关键氨基酸位点。与山西省JEV分离株相同,该5株JEV是经过C6/36细胞培养扩增后再接种BHK21,Vero细胞才可增殖并导致哺乳动物细胞CPE。3、西藏新分离环状病毒的鉴定及系统进化分析在中国西藏采集的多斑按蚊中分离到两株病毒（XZ0906、XZ0923）,可引起哺乳动物细胞（BHK-21）圆缩、破碎；不能致昆虫细胞（C6/36）明显病变但可以在该种细胞中复制。聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）结果提示两株分离物均为10节段双链RNA病毒,RNA带型完全一致,均为3-3-3-1布局。使用454高通量测序技术初步测定两株病毒各节段核酸序列,结合5’RACE、3’RACE及Sanger测序技术完成毒株XZ0906全基因组（Seg1-Seg10）核苷酸序列测定（GenBank登录号：KF746187to KF746196）,序列分析显示XZ0906基因组全部10个节段RNA序列的5’、3’非编码区末端6个核苷酸序列均各自保守（5’-GUAAAA-----ACUUAC-3’）。与其他已报道环状病毒代表株相比较,XZ0906各基因节段氨基酸序列均差异较大,其中VP3（T2）蛋白氨基酸序列同源性仅为22.9-75.9%。基于呼肠孤病毒VP1蛋白氨基酸序列分子遗传进化分析结果,XZ0906病毒属于环状病毒属成员,进一步对环状病毒属病毒T2蛋白氨基酸序列进行系统进化分析,结果显示XZ0906不属于任何一种已知环状病毒,为呼肠孤病毒科环状病毒属新成员,定名为西藏环状病毒（Tibet orbivirus, TIBOV）.对XZ0906和XZ0923的10个基因节段比较分析,发现除第6、2节段氨基酸同源性仅为80.39%和39.16%以外,其余各节段氨基酸同源性均大于94%,其中第3、5节段达到100%,T2蛋白氨基酸同源性为100%,提示两株病毒为同一种环状病毒。对同期在当地采集的66份健康猪血清进行IFA检测,结果提示当地家猪血清标本TIBOV IgG抗体阳性率为14.0%（8/57）。本研究采用贝叶斯马尔科夫蒙特卡洛方法,对包括TIBOV在内的12种、78株环状病毒属成员的VP1蛋白氨基酸序列数据集进行分子遗传进化分析,通过对Orbivirus病毒属病毒分歧时间分析发现,Orbivirus病毒属最近共同祖先（Time to most recent common ancestor, tMRCA）约出现在5051年（置信度1984～8893年）以前,其中西藏环状病毒TIBOV出现在大约距今43年前,与分离自澳大利亚的EUBV病毒具有较近的亲缘关系,并与主要由蠓携带传播的EHDV,BTV, EEV等能够引起家畜疾病和死亡的的虫媒病毒处于同一进化分支。4、其他工作对我国新分离Seadornavirus病毒属进行病毒分子遗传进化分析。基于LNV第10节段碱基替换值推算,LNV最近共同进化祖先出现时间分别在距今约316（95%HPD为70-800）年前,其中最早进化出现的为吉林分离株NE9731；基于BAV第12节段碱基替换值推算其最近共同进化祖先出现时间约在距今241年（95%HPD为89-500）前,我国最古老的BAV应当属于中国南方分离株,即中国云南分离株。结论及意义本课题对山西、河南省部分地区开展蚊传虫媒病毒调查。在山西省分离到4种病毒,其中CxFV和GETV均为山西省首次分离到；在河南省蚊虫标本分离到5株乙脑病毒,山西和河南两省蚊虫标本中分离JEV均为基因Ⅰ型。本研究结果显示,乙脑病毒仍然是山西、河南两地蚊虫携带的最主要的虫媒病毒,以上研究结果对当地虫媒病毒病的防控具有重要意义。同时,本课题通过病毒生物学和病毒分子遗传进化分析首次阐明我国西藏分离的两株病毒为环状病毒新种（TIBOV）,病毒基因组信息已经提交至基因库（GenBank）注册。研究结果还提示,西藏当地家猪血清标本中存在西藏新分离环状病毒的IgG抗体,提示该病毒与当地动物感染有关,本结果为当地动物疾病的预防控制提供了基础数据。
谭晖[10]（2013）在《携带卵清蛋白T细胞表位的兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究》文中研究指明兔出血症（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）是由兔出血症病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV）引起的兔的一种急性、败血性、高度接触性传染病,以致死性和全身实质器官出血为主要特征。RHDV是杯状病毒科成员,结构简单,在兔体内可以诱导机体产生体液免疫应答、细胞免疫应答和粘膜免疫应答,还有极强的诱导干扰素产生的能力。RHDV仅有一个主要结构蛋白VP60, VP60在动物体内可诱导产生中和抗体,与免疫反应直接相关,是病毒免疫保护性抗原。VP60衣壳蛋白在体外可自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）、这种病毒样颗粒具有良好的免疫原性,本身可作免疫佐剂,通过胞吞或胞饮途径进入抗原提呈细胞,分别诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。有研究证实这种病毒样颗粒也可嵌合表达外源基因,或作为疫苗载体。为了探究兔出血症病毒样颗粒（RHDV-VLPs）容纳外源表位的能力,了解其适宜的外源片段插入位点,探索嵌合VLPs的组装及其免疫原性,初步评价RHDV VLPs作为外源表位展示系统的可行性,本研究在RHDV衣壳蛋白VP60的C末端插入OVAT细胞抗原表位,将VP60的502-510位、411.417位、302-309位氨基酸分别替换为OVAT细胞抗原表位（鸡源卵清蛋白OVA257-264位氨基酸,序列SIINFEKL）,通过杆状病毒表达系统构建4种重组兔出血症病毒样颗粒（RHDV-VLPs）,通过电镜观察和动物实验,研究外源片段对VLPs的组装及免疫原性的影响。主要试验和结果如下：1.重组穿梭载体的构建通过PCR,在RHDV VP60基因序列的特定区域直接插入OVA CD8+T细胞表位（SIINFEKL）,或通过SOE法对RHDV VP60基因序列的特定区域进行部分缺失并用OVA CD8+T细胞表位（SIINFEKL）替换,将PCR扩增产物克隆入载体pMD19-T,经酶切鉴定后,将目的片段连接至真核表达载体pFastBacl,并对目的片段进行测序,测序正确的重组质粒转化DH10Bac菌,经蓝白斑筛选及PCR鉴定后获得重组质粒,分别命名为Bacmid-V-579、Bacmid-V-502-510、 Bacmid-V-411-417、Bacmid-V-302-309。2.蛋白表达及鉴定将获得的阳性重组质粒转染Sf9细胞。逐日观察,当出现明显的细胞病变时,收获病毒rBac-v-579、rBac-v-502-510、rBac-v-411-417、rBac-v-302-309.提取细胞内总RNA进行RT-PCR扩增,阳性样品作为重组杆状病毒原液进行扩增和传代,并通过间接免疫荧光试验（IFA）、血凝试验（HA）、蛋白质电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹（Western-blot）等鉴定嵌合蛋白vp60-ova/579、 vp60-ova/502-510、vp60-ova/411-417、vp60-ova/302-309的表达。RT-PCR结果证实4组目的基因mRNA在转染的细胞中发生转录；IFA结果显示4种重组杆状病毒在Sf9细胞内表达；SDS-PAGE电泳结果显示,4种嵌合蛋白均在Sf9细胞内表达,大小约为60kDa；Western-blot结果显示,4种嵌合蛋白均能被RHDV单抗A3C特异性识别,证明4种嵌合蛋白的载体具有良好的反应原性；此外,血凝实验结果显示4种嵌合蛋白中,vp60-ova/579和vp60-ova/302-309有血凝性, vp60-ova/502-510和vp60-ova/411-417血凝性消失。3.嵌合蛋白的电镜观察和免疫原性分析对4种嵌合蛋白进行浓缩纯化及定量分析,通过电镜观察嵌合蛋白形成病毒样粒子的能力。将4种纯化定量的嵌合蛋白（vp60-ova/579. vp60-ova/502-510. vp60-ova/411-417和vp60-ova/302-309）,免疫接种7-8周龄C57BL/6雌性小鼠,设VP60、OVA多肽、无菌PBS为对照,各免疫三次,间隔两周,每只小鼠每次免疫40μg蛋白,分别在未免、二免后2周及三免后2周采集小鼠血清,间接ELISA测定0d、28d、42d血清中VP60抗体水平,试剂盒检测各组小鼠血清中TNF-α含量。结果显示：4种嵌合蛋白中,vp60-ova/579、vp60-ova/502-510、 vp60-ova/411-417及vp60-ova/302-309均可形成VLPs,大小约为40nm,形态与天然兔出血症病毒样粒子类似。4种嵌合蛋白均可诱导小鼠产生不同程度的针对VP60载体的体液免疫应答和针对OVAT细胞表位的细胞免疫应答。其中,vp60-ova/579能引起较低的针对VP60的体液免疫应答和较高的针对OVA T细胞表位的细胞免疫应答。初步推测,VP60579位氨基酸可能是4个位点中携带外源T细胞表位的较优位点。本实验构建了携带CD8+T细胞表位的VP60嵌合蛋白。该T细胞表位来自鸡源卵清蛋白OVA257-264（SIINFEKL）,受MHC I类分子限制。T细胞表位分别嵌合在RHDV VLP的不同位置：1)直接插入VP60的C末端,即第579位aa之后；2)取代VP60502-510位氨基酸；3)取代VP60411-417位氨基酸；4)取代VP60302-309位氨基酸。嵌合RHDV病毒样粒子作为载体的研究结果表明,四组嵌合蛋白不同程度的诱发VP60特异性体液免疫应答和针对OVAT细胞表位的细胞免疫应答。本研究为以RHDV VLPs为载体的疫苗研究提供理论依据。
二、用RT-PCR检测篮舌病毒（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、用RT-PCR检测篮舌病毒（论文提纲范文）
（1）非洲猪瘟相关检测及猪场生物安全防控研究进展（论文提纲范文）
| 1 ASF相关诊断方法 |
| 1.1 分子生物学检测方法 |
| 1.1.1 聚合酶链式反应(PCR) |
| 1.1.2 等温扩增法 |
| 1.2 血清学检测方法 |
| 1.2.1 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.2.2 直接免疫荧光试验(DFA) |
| 1.2.3 间接免疫荧光抗体试验(IFA) |
| 1.2.4 胶体金免疫层析试纸条(GICA) |
| 1.2.5 其他血清学检测方法 |
| 1.3 其他检测方法 |
| 1.3.1 红细胞吸附试验(HAD) |
| 1.3.2 液态芯片技术 |
| 1.3.3 生物传感器法 |
| 1.3.4 聚合酶交联螺旋反应(PCLSR)检测方法 |
| 1.3.5 基于CRISPR/CAS的检测方法 |
| 2 规模化猪场生物安全防控 |
| 2.1 对携带病原的猪肉产品及猪场饲料和饮用水的消毒 |
| 2.2 对猪舍环境的消毒 |
| 2.3 对猪场人员和车辆的消毒 |
| 2.4 对猪场动物媒介管理 |
| 3 讨论 |
（2）草鱼呼肠孤病毒基因Ⅱ型病毒样颗粒的制备及免疫效果评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 草鱼呼肠孤病毒研究进展 |
| 1.1.1 我国草鱼养殖概况 |
| 1.1.2 草鱼出血病简介 |
| 1.1.3 草鱼呼肠孤病毒的形态、组成和理化特征 |
| 1.1.4 GCRV-Ⅱ各基因节段编码的蛋白及其功能 |
| 1.2 草鱼出血病疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 灭活疫苗 |
| 1.2.2 弱毒疫苗 |
| 1.2.3 亚单位疫苗 |
| 1.2.4 DNA疫苗 |
| 1.3 病毒样颗粒的概述 |
| 1.3.1 病毒样颗粒的分类 |
| 1.3.2 病毒样颗粒的表达系统 |
| 1.3.3 鱼类VLPs疫苗的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 GCRV-Ⅱ S3、S6、S9和S10基因重组杆状病毒的构建及目的蛋白的表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒及细胞 |
| 2.1.2 实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 实验仪器及设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 总RNA的提取及c DNA合成 |
| 2.2.3 目的片段S3、S6、S9、S10 的扩增及胶回收 |
| 2.2.4 克隆质粒pMD18T-S3、S6、S9、S10的构建及鉴定 |
| 2.2.5 重组供体质粒的构建及鉴定 |
| 2.2.6 重组穿梭质粒的构建及鉴定 |
| 2.2.7 重组杆状病毒的构建 |
| 2.2.8 重组杆状病毒目的mRNA转录检测 |
| 2.2.9 间接免疫荧光鉴定 |
| 2.2.10 Western Blot鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 目的片段S3、S6、S9、S10 的扩增及胶回收 |
| 2.3.2 克隆质粒pMD18T-S3/S6/S9/S10的构建及鉴定 |
| 2.3.3 重组供体质粒的鉴定 |
| 2.3.4 重组穿梭质粒的鉴定 |
| 2.3.5 重组杆状病毒的构建 |
| 2.3.6 重组杆状病毒目的mRNA转录检测 |
| 2.3.7 间接免疫荧光(IFA)鉴定重组杆状病毒 |
| 2.3.8 Western Blot鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 GCRV-Ⅱ S6、S9和S10 基因的密码子优化和重组杆状病毒的构建及表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞 |
| 3.1.2 实验试剂及器材 |
| 3.1.3 实验仪器及设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 S6、S9和S10基因节段ORF优化 |
| 3.2.2 重组供体质粒的构建及鉴定 |
| 3.2.3 重组穿梭质粒的构建及鉴定 |
| 3.2.4 重组杆状病毒的构建 |
| 3.2.5 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.2.6 Western Blot鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 S6、S9和S10 密码子优化结果 |
| 3.3.2 重组供体质粒的构建及鉴定 |
| 3.3.3 重组穿梭质粒的构建及鉴定 |
| 3.3.4 重组杆状病毒的构建 |
| 3.3.5 间接免疫荧光鉴定 |
| 3.3.6 Western Blot鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于六种重组杆状病毒不同组合共感染策略分别构建GCRV-Ⅱ VLPs |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 实验试剂及耗材 |
| 4.1.3 实验仪器及设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组杆状病毒共感染 |
| 4.2.2 间接免疫荧光鉴定VLPs |
| 4.2.3 细胞超薄切片电镜观察 |
| 4.2.4 VLPs的纯化及电镜观察 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 间接免疫荧光鉴定VLPs |
| 4.3.2 细胞超薄切片电镜观察 |
| 4.3.3 VLPs电镜观察 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 GCRV-Ⅱ三种VLPs免疫效果评价 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株、及实验动物 |
| 5.1.2 实验试剂及耗材 |
| 5.1.3 实验仪器及设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 草鱼免疫实验 |
| 5.2.2 样品采集与处理 |
| 5.2.3 ELISA法检测血清IgM特异性抗体水平 |
| 5.2.4 组织中免疫相关因子表达水平检测 |
| 5.2.5 攻毒感染 |
| 5.2.6 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 血清Ig M特异性抗体水平变化 |
| 5.3.2 组织中免疫相关因子表达水平检测 |
| 5.3.3 免疫保护率 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 主要符号对照表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间论文发表情况 |
（3）蓝舌病毒RT-PCR检测方法的建立及对云南省库蠓蓝舌病流行病学检测（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 引物的设计与筛选 |
| 1.2 RT-PCR条件优化 |
| 1.3 特异性试验 |
| 1.4 灵敏性试验 |
| 1.5 蠓虫样品采集 |
| 1.6 样品分装 |
| 1.7 病毒RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.8 RT-PCR扩增 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR引物筛选及特异性试验 |
| 2.2 RT-PCR优化结果 |
| 2.3 灵敏性试验 |
| 2.4 样品检测结果 |
| 3 讨论 |
（4）新疆牛蓝舌病病毒的分离及全基因组测序（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 病毒的结构 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 致病机理、临床症状和病理变化 |
| 1.5 检测方法 |
| 1.6 疫苗 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第2章 新疆巴州尉犁县哨兵动物血清学检测 |
| 2.1 建立监控群 |
| 2.2 血清学检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 新疆巴州尉犁县哨兵动物BTV的分离 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 新疆巴州尉犁县哨兵动物牛源BTV分离株的鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 新疆巴州尉犁县哨兵动物牛源BTV分离株的全基因组测序 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）新疆尉犁县库蠓种类鉴定及其盖塔病毒分离和遗传特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 盖塔病毒流行情况 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 传播媒介 |
| 1.4 临床症状 |
| 1.5 病毒分离技术 |
| 1.6 检测方法 |
| 1.7 疫苗研究 |
| 1.8 防控措施 |
| 1.9 研究目的与意义 |
| 第2章 新疆尉犁县库蠓种类鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 新疆尉犁县库蠓盖塔病毒的分离与鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 分析 |
| 第4章 新疆库蠓源性盖塔病毒的遗传特性分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 尉犁县牛、羊盖塔病毒血清抗体初步调查 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）玉米AKINβγ蛋白与水稻黑条矮缩病毒P8蛋白的分子互作研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 玉米粗缩病和水稻黑条矮缩病发生概况 |
| 1.1.1 玉米粗缩病发生概况 |
| 1.1.2 玉米粗缩病的病害症状和病原 |
| 1.1.3 水稻黑条矮缩病发生概况 |
| 1.1.4 水稻黑条矮缩病的症状及病原 |
| 1.2 水稻黑条矮缩病毒研究概述 |
| 1.2.1 水稻黑条矮缩病毒的分类地位 |
| 1.2.2 RBSDV的传播 |
| 1.2.3 RBSDV病毒粒体和基因组特征 |
| 1.2.4 RBSDV编码蛋白的功能研究 |
| 1.2.5 RBSDV P8蛋白的功能研究 |
| 1.2.6 Reoviridae病毒副核心蛋白研究进展 |
| 1.2.7 RBSDV与寄主植物的相互作用 |
| 1.3 AKINβγ蛋白研究进展 |
| 1.3.1 SNF1/AMPK/SnRK1蛋白激酶复合体的构成 |
| 1.3.2 SNF1/AMPK/SnRK1蛋白激酶复合体的功能研究 |
| 1.3.3 SNF4、AMPKγ、AKINβγ蛋白的功能保守性 |
| 1.3.4 SNF4蛋白的功能 |
| 1.3.5 AMPKy蛋白的功能 |
| 1.3.6 植物中AKINγ蛋白的功能 |
| 1.3.7 植物中AKINβγ蛋白的功能 |
| 1.4 植物糖代谢 |
| 1.4.1 植物中的糖代谢途径 |
| 1.4.2 糖代谢调控植物生长和发育 |
| 1.4.3 植物糖代谢响应病原物侵染 |
| 1.4.4 植物糖代谢响应病毒侵染 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒、载体和菌种 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 酶和生化试剂 |
| 2.2 常用溶液、试剂和培养基的配置 |
| 2.3 基本实验方法 |
| 2.3.1 RBSDV接种 |
| 2.3.2 植物总RNA的提取 |
| 2.3.3 去除总RNA中的基因组DNA |
| 2.3.4 RNA的纯化 |
| 2.3.5 反转录反应 |
| 2.3.6 PCR反应 |
| 2.3.7 PCR或酶切产物直接或切胶回收 |
| 2.3.8 酶切和连接反应 |
| 2.3.9 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与转化 |
| 2.3.10 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 2.3.11 农杆菌浸润法瞬时表达目的蛋白 |
| 2.3.12 酵母双杂交(yeast-two hybrid,Y2H)筛选玉米cDNA文库及回转验证 |
| 2.3.13 酵母互补实验 |
| 2.3.14 玉米原生质体制备与转化 |
| 2.3.15 基因枪轰击玉米叶片瞬时表达蛋白 |
| 2.3.16 实时荧光定量RT-PCR |
| 2.3.17 Western blotting分析 |
| 2.3.18 BMV VIGS沉默玉米寄主基因 |
| 2.3.19 可溶性糖含量的测定 |
| 2.3.20 淀粉含量的测定 |
| 第三章 与RBSDV P8蛋白互作的寄主因子筛选 |
| 3.1 RBSDV侵染玉米后的症状发生 |
| 3.1.1 RBSDV接种玉米自交系Va35 |
| 3.1.2 RBSDV接种玉米后的症状发生情况 |
| 3.2 与RBSDV P8蛋白互作的玉米寄主因子筛选 |
| 3.2.1 载体构建 |
| 3.2.2 P8蛋白的自激活检测 |
| 3.2.3 筛选玉米中与P8互作的寄主蛋白 |
| 3.2.4 ZmAKINβγ-2蛋白的生物信息学分析 |
| 3.2.5 小结与讨论 |
| 第四章 P8与ZmAKINβγ的互作分析 |
| 4.1 BiFC验证P8与ZmAKINβγ-2的互作 |
| 4.1.1 载体构建 |
| 4.1.2 BiFC验证P8与ZmAKINβγ-2在本生烟细胞中互作 |
| 4.1.3 BiFC验证P8与ZmAKINβγ-2在玉米原生质体细胞中互作 |
| 4.2 ZmAKINβγ-2与P8互作的关键结构域鉴定 |
| 4.2.1 ZmAKINβγ-2的结构域分析及载体构建 |
| 4.2.2 Y2H分析ZmAKINβγ-2与P8互作的关键结构域 |
| 4.3 P8与ZmAKINβγ-2互作的关键结构域 |
| 4.3.1 P8的结构域分析及载体构建 |
| 4.3.2 Y2H分析P8与ZmAKINβγ-2互作的关键结构域 |
| 4.4 P8与ZmAKINβγ的互作分析 |
| 4.4.1 基因克隆及载体构建 |
| 4.4.2 ZmAKINβγ-2与RBSDV编码其它病毒蛋白的互作分析 |
| 4.4.3 P8与AKINβγ同源蛋白的互作分析 |
| 4.4.4 ZmAKINβy-2与SRBSDV编码SP8蛋白的互作分析 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第五章 ZmAKINβγ的表达分析 |
| 5.1 RBSDV侵染对ZmAKINβγ转录水平的影响 |
| 5.1.1 ZmAKINβγ在苗期玉米不同组织中的表达水平分析 |
| 5.1.2 RBSDV侵染不同阶段对ZmAKINβγ达水平的影响 |
| 5.2 ZmAKINβy在玉米原生质体细胞中的亚细胞定位 |
| 5.2.1 载体构建 |
| 5.2.2 ZmAKINβγ在玉米原生质体细胞中的亚细胞定位 |
| 5.2.3 ZmAKINβγ在本生烟细胞中的亚细胞定位 |
| 5.3 RBSDV侵染影响ZmAKNβγ的亚细胞定位 |
| 5.4 P8影响ZmAKINβγ的生物学活性 |
| 5.4.1 载体构建 |
| 5.4.2 P8影响ZmAKINβy的γ亚基功能 |
| 5.5 小结与讨论 |
| 第六章 ZmAKINβγ对RBSDV侵染的影响及参与的生理途径 |
| 6.1 BMV VIGS沉默ZmAKINβγ基因 |
| 6.1.1 构建沉默载体并在本生烟中扩繁BMV病毒粒子 |
| 6.1.2 沉默ZmAKINβγ基因的玉米无明显表型变化 |
| 6.1.3 沉默玉米ZmAKINβγ基因促进RBSDV侵染 |
| 6.2 BMV VIGS沉默ZmAKINβγ因影响玉米糖代谢 |
| 6.2.1 沉默ZmAKINβγ基因影响糖代谢相关基因的表达 |
| 6.2.2 沉默ZmAKINβγ基因调控糖类物质积累量 |
| 6.3 ZmAKINβγ影响RBSDV侵染所参与的生理途径 |
| 6.3.1 RBSDV侵染影响玉米糖代谢相关基因的表达 |
| 6.3.2 RBSDV侵染影响糖类物质积累量 |
| 6.3.3 葡萄糖处理促进RBSDV积累 |
| 6.3.4 蔗糖和硝酸银处理不影响RBSDV积累 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 ZmAKINβγ生理功能的探索 |
| 7.1 ZmAKINβγ响应不同类型病毒的侵染 |
| 7.2 ZmAKINβγ-2在本生烟叶片中诱发细胞坏死反应 |
| 7.3 小结与讨论 |
| 结论与展望 |
| 1. 主要结果和结论 |
| 2. 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ: RBSDV侵染玉米产生的病毒源小干扰RNA的特征 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅱ 引物列表 |
| 附表1 实时荧光定量RT-PCR所用的引物 |
| 附表2 载体构建和检测所用引物 |
| 个人简介 |
（7）蓝舌病毒感染细胞（A.albopictus和PST）miRNA表达谱的鉴定与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 蓝舌病概况 |
| 1.2 蓝舌病毒 |
| 1.2.1 蓝舌病毒形态和基因组结构 |
| 1.2.2 蓝舌病毒复制周期 |
| 1.3 microRNA概述 |
| 1.3.1 miRNA生物起源 |
| 1.3.2 miRNA作用机制 |
| 1.3.3 miRNA研究方法-高通量测序技术 |
| 1.4 细胞miRNA与病原相互作用的研究 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 蓝舌病毒感染A. albopictus细胞miRNA表达谱的鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞与病毒 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 BTV感染A.albopictus细胞的收集和总RNA提取 |
| 2.2.3 RT-PCR和噬斑试验 |
| 2.2.4 高通量测序 |
| 2.2.5 测序数据分析 |
| 2.2.6 miRNA分析 |
| 2.2.7 miRNA靶基因预测 |
| 2.2.8 实时定量PCR验证miRNA及其靶基因 |
| 2.2.9 miRNA靶基因的GO和KEGG分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 BTV在A.albopictus细胞中的增殖特性 |
| 2.3.2 测序数据分析 |
| 2.3.3 已知miRNA的鉴定和差异表达分析 |
| 2.3.4 新miRNA的预测和差异表达分析 |
| 2.3.5 miRNA靶基因的GO及KEGG分析 |
| 2.3.6 实时定量PCR验证miRNA及其对应靶基因 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 蓝舌病毒感染PST细胞miRNA表达谱的鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞、病毒和抗体 |
| 3.1.2 主要实验试剂与仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PST细胞的制备与培养 |
| 3.2.2 细胞免疫荧光试验 |
| 3.2.3 BTV感染PST细胞的收集和RNA提取 |
| 3.2.4 RT-PCR和噬斑试验 |
| 3.2.5 测序样品收集 |
| 3.2.6 高通量测序 |
| 3.2.7 生物信息学分析 |
| 3.2.8 新miRNA和对应靶基因的预测 |
| 3.2.9 miRNA差异分析 |
| 3.2.10 GO功能和KEGG路径分析 |
| 3.2.11 实时定量PCR验证mi RNA |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 BTV在PST细胞中的生长增殖特性 |
| 3.3.2 测序数据分析 |
| 3.3.3 显着差异表达miRNA分析 |
| 3.3.4 miRNA靶基因分析 |
| 3.3.5 GO功能和KEGG路径分析 |
| 3.3.6 实时定量PCR验证显着差异表达miRNA |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 蓝舌病毒感染细胞后3个细胞miRNA功能初步研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞与病毒 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 miRNA模拟体和抑制剂的设计与合成 |
| 4.2.2 siRNA的设计与合成 |
| 4.2.3 PST细胞转染miRNA最佳条件摸索 |
| 4.2.4 A.albopictus细胞转染miRNA和siRNA最佳条件摸索 |
| 4.2.5 转染实验 |
| 4.2.6 转染样品收集及RNA提取 |
| 4.2.7 实时定量PCR和噬斑试验验证miRNA和靶标基因对BTV复制的调节作用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 miRNA和siRNA转染实验最佳条件的确定 |
| 4.3.2 Novel-mir-105抑制BTV在PST细胞中复制 |
| 4.3.3 Aae-miR18895p和aae-miR29405p均促进BTV在A.albopictus细胞中复制 |
| 4.3.4 靶标基因AAEL012723和AAEL018190表达量下调抑制BTV在A.albopictus细胞中复制 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）细胞内表达抗独特型单链抗体抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 PRRSV的分类 |
| 1.1.3 PRRSV的基因组结构及其编码蛋白的功能 |
| 1.1.4 PRRSV的致病机制 |
| 1.1.5 PRRSV免疫学研究进展 |
| 1.1.5.1 固有免疫应答 |
| 1.1.5.2 体液免疫应答 |
| 1.1.5.3 细胞免疫应答 |
| 1.1.6 PRRSV的诊断 |
| 1.1.6.1 临床症状和病理变化 |
| 1.1.6.2 实验室诊断 |
| 1.1.7 PRRSV的防治与疫苗研究进展 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒的流行及传播 |
| 1.3 免疫网络调节与抗独特型抗体 |
| 1.4 单链抗体 |
| 1.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展 |
| 1.5.1 硫酸乙酰肝素（HS） |
| 1.5.2 唾液酸粘附素 （Sn） |
| 1.5.3 CD163分子 |
| 1.5.4 CD151分子 |
| 1.5.5 波形蛋白 (Vimentin) |
| 第二章 本研究工作的目的和意义 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的和意义 |
| 第三章 单链可变区抗体的克隆及真核表达载体的构建 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细胞和菌株 |
| 3.1.2 主要试剂及载体 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 杂交瘤细胞的复苏、培养和冻存 |
| 3.2.2 Mab2‐5G2杂交瘤细胞总RNA的提取 |
| 3.2.3 VH和VL cDNA的扩增与序列分析 |
| 3.2.3.1 RT‐PCR |
| 3.2.3.2 VH和VL PCR产物回收及序列比对 |
| 3.2.4 5G2scFv的构建与序列分析 |
| 3.2.5 融合表达EGFP的 5G2scFv真核表达载体的设计 |
| 3.2.5.1 构建融合表达EGFP的 5G2scFv |
| 3.2.5.2 融合表达scFv和EGFP的真核表达载体的构建 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 VH和VL的PCR扩增结果与序列分析 |
| 3.3.2 全长 5G2scFv的PCR扩增结果与序列分析 |
| 3.3.3 pTRIP‐CMV‐5G2scFv‐EGFP/pTRIP‐CMV‐1B5scFv‐EGFP‐Puro载体的构建 |
| 3.3.3.15G2scFv‐EGFP扩增结果及鉴定 |
| 3.3.3.2 真核表达载体pTRIP‐CMV‐5G2scFv‐EGFP和pTRIP‐CMV‐1B5scFv‐ ‐EGFP‐Puro的构建及鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于scFv中VH和VL之间弹性连接子（Flexial Linker）的选择 |
| 3.4.2 关于在 5G2scFv和EGFP之间GPGP连接子的选择 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 稳定表达 5G2scFv-EGFP和 1B5scFv-EGFP的MARC-145细胞系的建立 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 细胞和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 嘌呤霉素对MARC‐145细胞最小致死浓度的测定 |
| 4.2.2 重组慢病毒的包装 |
| 4.2.3 表达 5G2scFv/1B5scFv慢病毒的转导和细胞系的筛选 |
| 4.2.3.1 表达 5G2scFv/1B5scFv慢病毒转导MARC‐145 |
| 4.2.3.2 转导细胞系的筛选 |
| 4.2.4 稳定表达 5G2scFv‐EGFP和 1B5scFv‐EGFP细胞系的鉴定 |
| 4.2.4.1 RT‐PCR检测 5G2scFv/1B5scFv基因的表达 |
| 4.2.4.2 间接免疫荧光试验鉴定 5G2scFv的表达 |
| 4.2.4.3 Western blot检测筛选细胞系中scFv的表达 |
| 4.2.5 5G2scFv表达对细胞生长的影响 |
| 4.2.5.1 标准曲线的制备 |
| 4.2.5.2 生长曲线的测定 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 嘌呤霉素对MARC‐145细胞最小致死浓度的确定 |
| 4.3.2 稳定表达 5G2scFv和 1B5scFv的细胞系的筛选 |
| 4.3.3 稳定表达 5G2scFv和 1B5scFv细胞系的建立及鉴定 |
| 4.3.3.1 RT‐PCR检测 5G2scFv基因的表达 |
| 4.3.3.2 间接免疫荧光试验鉴定 5G2scFv及 1B5scFv的表达 |
| 4.3.3.3 Western blot鉴定筛选细胞系中scFv的表达 |
| 4.3.45G2scFv胞内表达对细胞生长的影响 |
| 4.3.4.1 标准曲线构建 |
| 4.3.4.2 生长曲线构建 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 选择慢病毒载体系统的原因 |
| 4.4.2 表达scFv的细胞系筛选及其表达对细胞生长的影响 |
| 4.4.3 稳定表达 5G2scFv的细胞系的鉴定 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 MARC-145细胞内稳定表达 5G2scFv对PRRSV感染的影响 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 细胞和病毒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 稳定表达 5G2scFv的MARC‐145细胞对不同PRRSV毒株感染的影响 |
| 5.2.1.1 不同毒株在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖情况 |
| 5.2.1.2 间接免疫荧光检测不同剂量SD16在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖 |
| 5.2.25G2scFv胞内表达后对子代病毒产生的影响 |
| 5.2.3 MARC‐145细胞内稳定表达 5G2scFv对PRRSV吸附的影响 |
| 5.2.3.1 荧光定量RT‐PCR检测MARC‐5G2scFv细胞系对PRRSV吸附的影响 |
| 5.2.3.2 TCID50检测MARC‐145细胞内表达 5G2scFv后对PRRSV吸附的影响 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1MARC‐145细胞内稳定表达 5G2scFv对PRRSV增殖的影响 |
| 5.3.1.1 不同毒株PRRSV在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖 |
| 5.3.1.2 不同浓度SD16在MARC‐5G2scFv细胞中的增殖 |
| 5.3.2 MARC‐145细胞内表达 5G2scFv后病毒的生长动力学曲线检测 |
| 5.3.3 MARC‐145细胞内稳定表达 5G2scFv细胞对PRRSV吸附的影响 |
| 5.3.3.1 荧光定量PCR检测胞内表达 5G2scFv对病毒吸附的影响 |
| 5.3.3.2 TCID50检测胞内表达 5G2scFv对PRRSV吸附的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.15G2scFv胞内表达抑制PRRSV在MARC‐145细胞中的增殖 |
| 5.4.2 胞内表达 5G2scFv不影响PRRSV吸附MARC‐145细胞 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 胞内表达 5G2scFv上调IFN-α 抑制PRRSV增殖 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 细胞和病毒 |
| 6.1.2 试剂和仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 荧光定量RT‐PCR检测IFN‐α 和IFN‐β 转录水平变化 |
| 6.2.2 ELISA检测IFN‐α 和IFN‐β 蛋白水平变化 |
| 6.2.2.1 绘制标准曲线 |
| 6.2.2.2 ELISA法检测IFN‐α 和IFN‐β 浓度 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 荧光定量RT‐PCR检测IFN‐α 和IFN‐β 转录水平变化 |
| 6.3.2 ELISA检测IFN‐α 和IFN‐β 蛋白水平变化 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 论文创新点和进一步研究课题 |
| 创新点 |
| 下一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）我国山西、河南虫媒病毒调查及西藏新分离环状病毒分子进化遗传分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 ABSTRACT 符号说明 前言 第一章 |
| 山西省蚊虫及蚊传病毒的调查与病毒分子生物学特征研究 第一节 |
| 标本采集 第二节 |
| 病毒的分离鉴定与分子特征研究 第二章 |
| 河南省蚊传虫媒病毒的调查及病毒分子特征分析 第一节 |
| 标本采集和病毒分离 第二节 |
| 新分离病毒的鉴定与分子特征研究 第三章 |
| 西藏新分离环状病毒的鉴定及系统进化分析 第一节 |
| 西藏环状病毒鉴定及环状病毒系统进化分析 第二节 |
| 西藏环状病毒的家猪自然感染状况调查 第四章 |
| 其他内容 结论 创新之处 附录 参考文献 致谢 攻读学位期间发表的学术论文目录 附件 学位论文评阅及答辩情况表 |
（10）携带卵清蛋白T细胞表位的兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述：兔出血症(RHD)的研究进展 |
| 1 兔病毒性出血症的流行现状 |
| 2 RHDV的分类 |
| 3 RHDV的形态特征 |
| 4 RHDV病毒基因组结构与功能 |
| 5 结构蛋白 |
| 5.1 VP60 |
| 5.2 VP10 |
| 6 非结构蛋白 |
| 7 病毒的理化特性 |
| 8 病毒的血凝性 |
| 9 血清型及进化特点 |
| 10 RHDV致病性 |
| 11 RHDV的培养 |
| 12 RHDV的实验室检测 |
| 13 不同载体表达兔出血症病毒VP60蛋白的研究进展 |
| 13.1 杆状病毒—昆虫细胞表达系统 |
| 13.2 大肠杆菌表达系统 |
| 13.3 酵母表达系统 |
| 13.4 植物表达系统 |
| 13.5 腺病毒表达载体 |
| 14 兔出血症灭活疫苗研究进展 |
| 15 兔出血症病毒重组病毒疫苗 |
| 16 关于RHDV疫苗存在的问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 ：四种携带OVA CD8~+T细胞表位重组穿梭载体的构建 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌种 |
| 1.2 主要试剂与工具酶 |
| 1.3 核酸序列分析 |
| 1.4 构建图示 |
| 1.5 引物设计 |
| 1.6 目的基因的扩增 |
| 1.6.1 常规方法PCR构建目的基因G-V-0-579 |
| 1.6.2 重叠区扩增基因拼接法(SOE法)构建目的基因G-v-o-502-510、G-v-o-411-417、G-v-o-302-309 |
| 1.7 T/A克隆与鉴定 |
| 1.8 重组转移载体的构建与鉴定 |
| 1.9 穿梭载体Bacmid的构建与鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组穿梭载体Bacmid-V-579的构建 |
| 2.2 重组穿梭载体Bacmid-V-502-510、Bacmid-V-411-417、Bacmid-V-302-309的构建 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源表位插入位置的选择 |
| 3.2 SOE法操作要点 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 ：四种嵌合蛋白的表达及鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株与细胞 |
| 1.2 主要试剂与工具酶 |
| 1.3 重组杆状病毒的构建和筛选 |
| 1.4 重组病毒的传代与初步鉴定 |
| 1.5 表达产物的鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白的表达鉴定 |
| 2.2 红细胞凝集特性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 嵌合蛋白的红细胞凝集特性 |
| 3.2 免疫荧光和western blot |
| 3.3 RHDV VLPs的构建 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第四章 嵌合蛋白的电镜观察和免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试剂、培养基及重组病毒 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 嵌合蛋白的电镜观察 |
| 1.4 嵌合蛋白免疫原性的研究 |
| 2 结果 |
| 2.1 电镜观察 |
| 2.2 小鼠血清中VP60抗体水平的检测 |
| 2.3 小鼠血清中TNF-α的含量检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 电镜观察重组蛋白VLPs的形成 |
| 3.2 插入位点与体液免疫应答相关性 |
| 3.3 VLPs与细胞免疫应答相关性 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、用RT-PCR检测篮舌病毒（论文参考文献）
- [1]非洲猪瘟相关检测及猪场生物安全防控研究进展[J]. 孙爱军,王芮,朱潇静,孟泽锟,刘思源,张帅,靳家鑫,张改平,庄国庆. 中国兽医学报, 2021(05)
- [2]草鱼呼肠孤病毒基因Ⅱ型病毒样颗粒的制备及免疫效果评价[D]. 高彩霞. 天津农学院, 2020(07)
- [3]蓝舌病毒RT-PCR检测方法的建立及对云南省库蠓蓝舌病流行病学检测[J]. 李成辉,肖朋朋,赵冠宇,张克龙,李卓昕,南福龙,陈竞,张涵,马彬尧,韩继成,金鑫,田明尧,鲁会军,金宁一. 中国兽医学报, 2019(05)
- [4]新疆牛蓝舌病病毒的分离及全基因组测序[D]. 丁梦玥. 新疆农业大学, 2018(05)
- [5]新疆尉犁县库蠓种类鉴定及其盖塔病毒分离和遗传特性研究[D]. 刘帅. 新疆农业大学, 2017(02)
- [6]玉米AKINβγ蛋白与水稻黑条矮缩病毒P8蛋白的分子互作研究[D]. 李明骏. 中国农业大学, 2017(05)
- [7]蓝舌病毒感染细胞（A.albopictus和PST）miRNA表达谱的鉴定与功能分析[D]. 邢闪闪. 中国农业科学院, 2016(02)
- [8]细胞内表达抗独特型单链抗体抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞的研究[D]. 李琼毅. 西北农林科技大学, 2015(06)
- [9]我国山西、河南虫媒病毒调查及西藏新分离环状病毒分子进化遗传分析[D]. 郑雅匀. 山东大学, 2014(12)
- [10]携带卵清蛋白T细胞表位的兔出血症病毒VP60蛋白病毒样颗粒的表达及其免疫原性研究[D]. 谭晖. 南京农业大学, 2013(08)