一、腺病毒介导的P16/CDKN_2基因对TJ899细胞系活性的影响（论文文献综述）
张桂冀[1]（2021）在《囊泡蛋白分选相关蛋白35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖的机制研究》文中研究指明背景:原发性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率居全球癌症发病第六位,死亡率居全球癌症死亡第四位,而中国肝癌新发病例和死亡病例数约占全球总数的50%以上[1]。在癌症总体发病率和死亡率呈下降趋势的情况下,肝癌的发病率仍以每年2%-3%的增速增长[2]。肝炎病毒感染、过量摄入酒精,黄曲霉毒素等是肝癌发生的高危因素。我国肝癌患者中,约90%为慢性乙型肝炎病毒（Chronic Hepatitis B virus,CHB）感染,因此HBV感染仍是我国肝癌最主要的病因。由于肝癌恶性程度高、较早发生转移,5年生存率在5%-30%之间。目前肝细胞癌的治疗仍是一个医学难题,尤其是对于没有显着血管浸润,局部淋巴结或远端转移的早期肝细胞肝癌病人。因此,深入研究肝细胞肝癌发生发展过程中的具体分子事件,有望为肝癌的早期诊断和治疗提供理论依据以及新的治疗策略。在肝癌的发病过程中往往伴随肝细胞炎症,纤维化和肝细胞异常再生,增生性结节形成过程中遗传变异不断积累,为发育异常的细胞提供增殖、侵袭和生存优势,最终导致肝癌的发生[3]。基因突变及其表达调控的改变与HCC的发生发展有着重要联系,高通量的下一代测序技术解析了HCC的突变图谱,目前已报道的与人类肝癌发生密切相关的驱动基因主要包括TERT、TP53、CTNNB1、NRAS、ARID1A和AXIN1等,对于鉴定HCC中具有抑癌或促癌功能的癌症驱动基因起到了极大的推动作用（表1）。TERT启动子区突变,HBV病毒基因组插入TERT启动子区,染色体易位和基因扩增等导致端粒酶激活是最常见的遗传变异,其突变频率达60%[4]。在30%-50%的HCC样本中发现了编码β-catenin的基因CTNNB1的突变,以及Wnt通路抑制剂AXIN1或APC失活,导致Wnt-β-catenin信号通路激活[5]。其他如TP53,RB1,PTEN,CCNA2,CCNE1,ARID1A基因突变或遗传变异等导致肝癌细胞周期调控异常。ARID1A,ARID2,KMT2家族基因突变引起表观修饰的改变[6,7]。FGF3,FGF4和FGF19基因扩增,TSC1,TSC2和PTEN的失活突变激活AKT-m TOR-MAPK信号通路。NFE2L2,KEAP1突变激活氧化应激途径[8,9]。此外,CCND1,FGF19,VEGFA,MYC和MET基因扩增导致多种致癌信号途径（包括受体酪氨酸激酶）的激活[10]。总体而言,每个HCC患者约含有50个基因组异常改变,其中约20%-25%的HCC患者含有一种以上的致癌突变。根据不同的转录图谱和组织学表型,特定的驱动基因突变可以对HCC进行分子分型[11-13]。由于肝癌的高度异质性,目前仍有必要深入研究HCC发病过程中的相关驱动事件,进一步阐明其在HCC发生发展过程中的作用及具体分子机制。课题组前期对临床HBV相关肝细胞癌队列进行了全外显子测序（whole-exome sequencing,WES）和转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）。通过聚类算法分析,筛选出四个枢纽基因:VPS35,SH3BP4,PPP1R12C和PNO1,与肝癌中已报道的致癌突变存在重叠的功能簇,提示其在肿瘤中的恶性生物学行为,有可能成为新的肿瘤相关基因。通过细胞功能学实验我们发现过表达VPS35在体外显着促进肝癌细胞增殖。囊泡蛋白分选相关蛋白35（Vacuolar Protein Sorting-Associated Protein 35,VPS35）是retromer复合物的关键组分。VPS35的C端与VPS29结合,N端与VPS26结合形成异源三聚体,即货物识别复合物（Cargo recognition complex,CRC）,主要功能是识别并结合细胞内的货物蛋白。CRC复合物与分选连接蛋白（Sorting nexin,SNX）形成的异二聚体一起,构成retromer复合物。最初在酵母中发现retromer复合物介导羧肽酶受体从内体转运至高尔基体[14]。Retromer作为内体蛋白分选机制的重要组成成分,介导货物蛋白从内体转运至高尔基体或直接从内体转运至细胞膜表面（图1）,其功能异常参与神经退行性疾病的发病。通过介导细胞膜上多种货物蛋白的分选,retromer复合物的功能与细胞内重要的生理过程如溶酶体起源、自噬、信号受体的调节和细胞扩散等密切相关。此外,retromer通过调控信号受体的转运和回收,参与了细胞内信号通路的调控,如β2-肾上腺素能受体（β2-adrenergic receptor,β2-AR）[15],甲状旁腺素受体（Parathyroid hormone receptor,PTHR）[16-18]和干扰素受体2（Interferon receptor 2,IFNAR2）[19]等。VPS35与N-Ras相互作用,促进黑素瘤细胞的增殖,沉默VPS35下调丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号,抑制黑素瘤细胞增殖[20,21]。目前VPS35在肝细胞癌和癌旁组织中的表达水平及其在肝癌发生发展过程中的作用和具体机制尚未见相关文献报道。课题组前期通过对临床肝癌组织和癌旁组织进行WES和RNA-Seq测序,通过图表聚类算法筛选枢纽基因,这些枢纽基因可能在HCC中发挥关键作用,因此可能成为功能研究的候选基因。联合细胞功能学鉴定我们筛选出潜在的肝癌驱动相关新基因VPS35,在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中对VPS35基因进行深度挖掘,分析其在肝癌中的致癌作用和调控的关键信号通路。在体内外实验中,我们首先明确了VPS35在临床肝癌样本中的表达水平,证实过表达VPS35促进肝癌细胞增殖,进一步对VPS35敲除的肝癌细胞进行RNA-Seq测序,研究其发挥促癌效应的具体分子机制。本研究在临床HCC队列中鉴定了潜在的HCC候选基因,对于retromer复合物在肿瘤发生发展中的作用提供了新的见解,有望为临床肝癌个性化防治策略提供新的思路。实验方法:1.鉴定潜在的肝癌驱动基因。首先通过图表聚类算法筛选可能在HCC中发挥关键作用的枢纽基因。然后通过细胞功能学验证筛选出潜在的肝癌驱动基因VPS35。利用TCGA数据库资料对VPS35基因进行深度挖掘,分析其在肝细胞癌中的致癌作用和调控的关键信号途径。进一步明确VPS35在肝癌组织中的表达情况。通过TCGA数据库分析VPS35在肝癌组织中的表达及与预后的关系。采用Real-time PCR,Western blot和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）的方法检测VPS35在临床肝癌和癌旁组织中的表达情况。通过Western blot,Real-time PCR实验以及分析TCGA数据库资料从HBV感染、转录因子调控和DNA甲基化三个方面探讨VPS35在肝癌组织中表达上调的机制。2.通过体外细胞功能学实验观察VPS35对肝癌细胞系增殖能力和细胞周期的影响。利用Ad Easy腺病毒载体系统构建过表达VPS35的重组腺病毒表达载体,获得过表达VPS35的肝癌细胞模型;利用CRISPR/Cas9技术构建VPS35特异性敲除的肝癌细胞模型。通过MTS实验、克隆形成实验和Ed U细胞增殖检测观察VPS35对肝癌细胞增殖能力的影响;通过流式细胞术和Western blot实验观察VPS35对肝癌细胞的细胞周期的调控作用;在裸鼠皮下移植瘤模型中观察VPS35基因敲除对肿瘤生长的影响:皮下注射VPS35敲除的肝癌细胞,观察VPS35敲除对肿瘤生长速度、大小的调控,通过Ki67染色观察肿瘤内细胞增殖能力变化,验证体外实验结果。3.检测VPS35对PI3K/AKT信号通路的调控。对VPS35敲除的肝癌细胞和对照Parental细胞进行转录组测序,对差异表达基因进行通路富集分析,发现这些差异基因主要富集在溶酶体和PI3K/AKT信号通路。通过Real-time PCR在m RNA水平验证VPS35过表达和基因敲除对PI3K/AKT和RAS信号通路相关分子的调控。采用Western blot在蛋白水平验证VPS35过表达和基因敲除对AKT信号活化的影响。采用AKT抑制剂MK2206处理后,通过MTS和克隆形成实验观察MK2206对肝癌细胞增殖的影响,流式细胞术和Western blot实验观察MK2206对肝癌细胞周期的影响。在裸鼠原位移植瘤模型中观察过表达VPS35对PI3K/AKT信号通路的调控:肝脏原位注射VPS35过表达的肝癌细胞,设置MK2206处理组,观察过表达VPS35对肿瘤生长速度、大小的调控,通过Western blot和IHC染色观察肿瘤内细胞增殖能力的变化,观察MK2206是否可以逆转VPS35的致癌效应,验证体外实验结果。4.探索VPS35激活PI3K/AKT信号的具体机制。通过TCGA数据库HCC队列资料进行相关性分析,发现VPS35表达与RTK家族成员（FGFR3,FGFR3,和NTRK1）呈正相关。通过流式细胞术,Western blot和免疫荧光实验检测VPS35敲除后细胞膜上RTKs表达水平。进一步在VPS35敲除肝癌细胞中重新过表达VPS35,通过Western blot和免疫荧光实验观察回复VPS35是否可以调控细胞膜上FGFR3的表达。结果:1.运用图表聚类算法对发生转录的238个突变等位基因进行蛋白-蛋白相互作用（Protein-protein interaction,PPI）网络分析和基因本体论（Gene ontology,GO）分析,挖掘潜在的肝癌相关新基因。联合MTS和克隆形成实验在体外进行验证,我们筛选出肝癌相关新基因VPS35。通过TCGA数据库分析发现VPS35在肝癌组织中的表达显着上调（P<0.05）。Real-time PCR、Western blot和免疫组化染色检测结果显示与癌旁组织相比,肿瘤组织中VPS35表达水平明显上调。VPS35在肝癌组织中表达上调的机制探讨:HBV感染对VPS35表达水平无明显影响;两个重要的转录因子TBP和TCF3与VPS35的表达成正相关,Real-time PCR实验提示肿瘤组织中TBP和VPS35均表达上调,TCF3表达水平无明显变化;Meth HC DNA甲基化数据库分析显示肝癌组织内（n=204）VPS35启动子甲基化水平显着降低（P=0.037）,因此,基于转录水平和表观修饰的调控可能均参与了VPS35在肝癌组织中的高表达。VPS35与PI3K/AKT信号通路相关基因的体细胞突变互相协同,如FGFR3（P=0.05）。在TCGA数据库中,体细胞VPS35突变或表达上调均与肝癌预后不良相关,提示VPS35在肝癌中的恶性生物学效应。2.VPS35过表达显着促进肝癌细胞增殖能力和肝癌细胞周期G1/S期转换和细胞周期进程;而敲除VPS35显着抑制肝癌细胞增殖,肝癌细胞周期阻滞于G1期。裸鼠皮下移植瘤实验显示VPS35基因敲除显着抑制肿瘤生长。3.RNA-Seq结果显示差异基因主要富集在PI3K/AKT信号通路中,Real-time PCR和Western blot实验验证了过表达VPS35激活RAS和PI3K/AKT信号,VPS35敲除抑制PI3K/AKT信号活化。AKT抑制剂MK2206在体内外可逆转VPS35促肝癌细胞生长和细胞周期进程效应。4.VPS35敲除后肝癌细胞FGFR3染色阳性的细胞百分比显着减少,细胞膜成分中FGFR3表达显着下调。而在VPS35敲除细胞中过表达VPS35可以回复细胞膜上FGFR3的表达水平,提示FGFR3在细胞内的回收增多和（或）溶酶体降解减少,从而激活下游PI3K/AKT信号,促进肝癌细胞增殖。结论:课题组前期通过对临床肝癌组织和匹配的癌旁硬化组织进行WES和RNA-Seq测序,通过图表聚类算法和细胞功能学验证,我们鉴定了一个潜在的肝癌驱动候选基因VPS35。VPS35在肝癌组织的表达明显高于癌旁组织,体内外实验中均证明VPS35通过促进肝癌细胞周期G1/S期转换促进肝癌细胞增殖。研究其机制发现:VPS35作为retromer复合物的关键组分,通过介导细胞膜表面FGFR3受体的循环,激活下游PI3K/AKT信号,促进肝癌细胞G1期到S期转换和细胞周期进程,促进肝癌细胞增殖;而AKT抑制剂MK2206可逆转VPS35的致癌效应。本课题阐释了VPS35通过激活PI3K/AKT信号促进肝癌增殖的具体分子机制,对于retromer复合物在肿瘤发生发展中的作用提供了新的见解,有望为临床肝癌个性化防治策略提供新的思路。
徐阳[2]（2020）在《阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究》文中研究说明背景:近年来,采用微生物载体递送靶向炎症通路的基因在肿瘤治疗中取得了良好的效果。微生物载体主要包括病毒与细菌。病毒类载体可以分成两类:整合型和非整合型病毒载体,细菌主要包括厌氧菌和兼性厌氧菌。尽管已有大量的研究表明,应用减毒沙门菌体内递送基因能取得良好的治疗效果,但是,由于生物载体的安全性问题,限制了其临床转化过程。近期,人工合成载体递送基因抗肿瘤成为研究热点。人工合成载体包括脂质体和阳离子聚合物。聚醚酰亚胺（Polyetherimide,PEI）是经典的阳离子聚合物,并作为阳离子基因载体研究的金标准被广泛应用。但是PEI毒性较高,体内转染效率不高,这使得开发新型阳离子基因载体成为现阶段的研究热点。现阶段国内已开发出一系列合成基因载体用于治疗肿瘤,但是相关的体内研究仅局限于肿瘤本身,机体对合成载体递送基因抗肿瘤的综合反应仍未知。神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤,最常见的发生部位是肾上腺。约有50%以上的患儿生存率低于40%,探寻有效的治疗靶点是神经母细胞瘤研究的热点。在临床上,神经母细胞瘤组织血运丰富,常出现早期转移,且伴有大量出血、坏死和钙化。抑制炎症致癌信号通路在该肿瘤的治疗中发挥明显作用。维甲酸/干扰素联合应用诱导的细胞凋亡调控基因19（Genes associated with retinoid-interferon-induced mortality 19,GRIM-19）可以通过抑制转录因子信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription-3,STAT3）通路抑制恶性肿瘤的生长。虽然近期的研究表明,STAT3信号通路在神经母细胞瘤转移和化疗耐药的患儿中至关重要,但是尚缺乏临床病理分期与GRIM-19的相关性报道。异种移植瘤的体内实验提示抑制STAT3信号通路可以抑制神经母细胞瘤的生长,但是不足以评估抑制该通路后肿瘤局部微环境的改变。我们推测在神经母细胞瘤同种移植瘤中,过表达GRIM-19可能通过抑制STAT3信号通路的机制,抑制肿瘤细胞的生长,促进凋亡,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血,提高治疗效果。众所周知,多数肿瘤化疗的一线药物顺铂具有明显的内皮细胞毒性,治疗后可明显增加血浆血管性血友病因子（Von Willebrand factor,v WF）水平。针对致病机制的基因治疗具有高效低毒的特点,理论上对机体毒副作用较小。虽然已经开发出许多脂质体、阳离子载体用于神经母细胞瘤的治疗研究,可是如何在体内达到最大的治疗效果仍需仔细评估。方法:1、基因载体的合成与表征:通过酶促聚合反应合成双亲性嵌段共聚物PCL-b-P（GMA-EA）（PCG）,核磁检测PCG的化学结构,凝胶电泳检测PCG与GRIM-19质粒的结合能力,动态光散射评估PCG与GRIM-19质粒复合物的粒径和ζ电位。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,用细胞增殖活性检测（CCK-8）检测PCG与EGFP-N1质粒复合物的细胞毒性,用流式细胞仪或荧光显微镜检测PCG的转染效率。2、临床样本的分析:收集吉林大学白求恩第一医院住院确诊为神经母细胞瘤的28例患儿手术标本的石蜡切片,通过免疫组化分析GRIM-19的表达与神经母细胞瘤患儿年龄、性别、肿瘤大小、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移的相关性。3、PCG递送GRIM-19基因抑制神经母细胞瘤的体内外研究:用PEI作为阳性对照,采用Western blot检测PCG介导的GRIM-19在鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中的转染效率。体外实验分为6组,分别为对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组,应用细胞增殖实验（CCK-8）、克隆形成实验、Brd U检测、流式凋亡检测、免疫荧光、划痕及Transwell实验,探讨PCG介导的GRIM-19过表达对肿瘤增殖、凋亡及转移的影响。体内实验中,分为对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19共3组,应用免疫组化及Western blot检测GRIM-19的转染效率,通过免疫组化检测PCNA的表达,细胞凋亡检测（TUNEL）及Western blot检测分析裸鼠移植瘤治疗后增殖及凋亡的改变。进一步的体内实验分为对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组共3组,检测各组裸鼠生存期的差异,自动血液分析仪检测裸鼠血红蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中v WF,HE染色检测荷瘤鼠肺部改变,免疫组化检测肿瘤组织p-STAT3、MMP-9的表达,评价肿瘤组织学、瘤内出血、贫血及肺栓塞等肿瘤相关并发症改变。结果:1、N/P=1（阳离子聚合物中的N和DNA中的P的摩尔比）时,PCG完全阻止GRIM-19质粒DNA在凝胶电泳中的泳动。在w/w（质量比）为5-50的范围内,PCG能将p GRIM-19质粒压缩成200-400 nm大小,表面电势为25-30 m V的纳米粒子。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,PCG（w/w=20）在细胞中有效递送EGFP-N1质粒,同时对细胞的毒性较小。2、神经母细胞瘤组织中GRIM-19蛋白表达水平较癌旁正常组织下调或缺失。肿瘤组织中GRIM-19表达水平与年龄（P=0.0012）、INSS分期（P=0.0012）、INPC分期（P=0.0299）、淋巴结和/或脉管转移（P=0.0062）呈负相关,与性别及肿瘤原发部位无关。3、体外实验中,PCG载体可以将GRIM-19基因转染进Neuro2a细胞并提高GRIM-19基因的蛋白表达水平,其转染效率高于PEI。在对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组细胞凋亡增加,细胞增殖和细胞迁移抑制。PCG介导细胞内过表达GRIM-19蛋白抑制了STAT3信号通路,抑制了Cyclin D1、Bcl-2、MMP2和MMP9的表达。体内实验中,在对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组移植瘤生长抑制最明显,该组GRIM-19蛋白表达增加,PCNA表达下调,TUNEL染色及Cleaved caspase-3上调。在对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组小鼠生存期延长最明显,该组大体观见瘤内出血减少,裸鼠血红蛋白升高,v WF下调,HE提示肺栓塞减少,肿瘤组织内p-STAT3下调,下游靶基因MMP-9表达下调。结论:1.人工合成的双亲性阳离子聚合物PCG能在体内外进行有效的基因转染。2.神经母细胞瘤肿瘤组织中GRIM-19的表达下调或缺失,其表达水平与年龄、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移呈负相关。3.在裸鼠同种移植瘤模型中,PCG递送p GRIM-19可以有效抑制STAT3信号通路,不仅直接抑制肿瘤细胞的生长,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血。顺铂化疗引起荷瘤裸鼠内皮损伤及肺血栓增加,基因递送组v WF下调,肺血栓减少,小鼠生存期延长。阳离子PCG载体递送p GRIM-19抑制神经母细胞瘤的治疗策略可能为肿瘤治疗提供有价值的参考。
王梅[3]（2019）在《Bach2通过自噬调控成纤维细胞光老化的作用机制研究》文中进行了进一步梳理皮肤光老化是皮肤长期暴露于紫外线（Ultraviolet,UV）引起的光损伤的累积,持续发展或治疗不当可引发日光性角化（Actinic keratosis,AK）等皮肤疾病,甚至导致皮肤肿瘤。对人的健康,美观,心理和生活质量造成严重的影响。因此,光老化的机制研究具有十分重要的科学意义。Bach2（BTB and CNC homolog 2）是一个具有碱性亮氨酸拉链结构（bZIP domain）的转录因子,参与细胞转录调控,既往的研究主要集中在其参与调节淋巴细胞发育、分化与肿瘤免疫等方面。近年来发现Bach2参与细胞衰老的调节:敲除Bach2促进淋巴细胞衰老;而且在小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast,MEF）中,Bach2在UV引起的损伤细胞中表达显着下调,可能潜在地作为转录阻断DNA损伤的靶点。但这方面的研究尚少,且具体的分子机制不明确。本研究前期发现,Bach2在AK患者皮肤组织中较正常皮肤组织中表达降低,这些均提示Bach2可能在UV引起的光老化及相关疾病中发挥调节作用,而这方面的研究目前尚未见相关报道。因此,本研究从UVA（Ultraviolet A）照射损伤皮肤的角度出发,探索转录因子Bach2在光老化过程中的功能作用,通过自噬信号途径阐释Bach2参与光老化的生物学机制,及Bach2在临床光老化治疗上的应用等展开研究。主要包括以下内容:（1）Bach2在UVA介导的光老化成纤维细胞中减少首先,通过UV照射的小鼠成纤维细胞的转录组数据分析,发现UV照射后小鼠成纤维细胞中Bach2表达降低,同时p21与MMP3的表达增加。及Bach2在AK患者皮肤组织中表达较正常皮肤组织低。预示Bach2可能与UV及UV导致的疾病相关。其次,检测发现Bach2在成纤维细胞及角质细胞中均有表达。同时模拟日光中生理剂量UVA照射,构建UVA诱导的慢性光老化模型并通过相关指标SA-β-gal,p16,p21,Lamin B1,γ-H2AX等鉴定,确保其构建成功。最后考察Bach2在光老化模型中的表达改变,结果表明Bach2在UVA诱导的光老化的成纤维细胞中表达减少,且随照射时间增加其表达减少。提示Bach2可能与UV介导的小鼠和人的皮肤成纤维细胞光老化相关。（2）Bach2抵抗UVA辐射损伤,减少成纤维细胞光老化首先构建Bach2腺病毒干扰载体,扩增病毒并感染原代成纤维细胞,结果表明Bach2下调后SA-β-gal染色活性、细胞周期蛋白p16及炎性因子IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-8及TNFα等衰老相关标记的表达均显着增加,提示Bach2下调可能促进皮肤成纤维细胞衰老。另外,Bach2水平降低（基因干扰）的细胞,采用UVA照射可进一步促进细胞光老化。说明Bach2下调增加UVA辐射引起的损伤。相反,高水平Bach2（外源过表达）降低复制型衰老及SASP（Senescence associated secretory phenotype）等相关衰老标志物的表达。提示,Bach2过表达可能降低细胞衰老。而且,增加Bach2水平后再进行UVA照射,UVA辐射导致的细胞衰老得到控制,说明Bach2水平增加能够抵御光老化的损害。分别从正反两方面证明Bach2具有降低UVA引起的光老化的作用。提示Bach2参与调控成纤维细胞光老化,但具体机制有待研究。（3）Bach2与自噬通路相关蛋白相互作用并增加自噬,延缓成纤维细胞衰老为探究Bach2参与调控光老化的分子机制,分别从自噬和蛋白酶体途径出发,首先,使用蛋白酶体抑制剂MG-132处理发现Bach2无显着改变,提示蛋白酶体途径可能不是Bach2蛋白降解的主要途径。其次,Bach2过表达增加LC3自噬斑的形成,提示Bach2可能与细胞自噬相关。进一步通过增加Bach2（过表达）可促进成纤维细胞中自噬相关基因及蛋白的（Atg3,Atg5,Atg7,p62,Beclin-1,LC3）表达。相反,Bach2下调抑制自噬相关基因及蛋白表达水平。说明Bach2参与调控成纤维细胞自噬。通过自噬抑制剂3-MA（3-methyladenine）处理Bach2过表达的成纤维细胞,及Atg5,Atg7基因敲除考察细胞衰老的发生。结果发现3-MA处理成纤维细胞,Atg5-/-及Atg7-/-的小鼠成纤维细胞（MEF）均显示自噬抑制,并增加衰老相关蛋白p16及p21的表达,且一定程度地降低Bach2的表达。说明药理及基因敲除等均抑制自噬并增加成纤维细胞衰老。为进一步明确Bach2如何调控细胞自噬,荧光共定位实验发现外源性及内源性Bach2均与LC3存在内源共定位信号,但未发现其p62的共定位信号。此外,外源及内源免疫共沉淀实验显示Bach2与自噬相关蛋白Beclin-1,Atg3,Atg5,Atg7及LC3等存在相互作用。以上结果表明Bach2与自噬主要参与蛋白相互作用来调控自噬,进而调节成纤维细胞衰老。（4）体内验证Bach2参与皮肤光老化,并在光老化小鼠皮肤组织中表达减少首先构建UVA慢性照射诱导小鼠皮肤光老化模型,并通过皮肤组织HE染色,及p16,p21等衰老相关指标证明光老化模型构建成功。小鼠皮肤组织免疫荧光实验表明Bach2荧光信号在光老化的小鼠皮肤组织中分布较对照组少,且Bach2蛋白水平在光老化小鼠皮肤组织中降低,且随UVA照射时间增加而进一步减少。以上结果说明Bach2在体内参与皮肤光老化。（5）小剂量PDT治疗通过Bach2减少成纤维细胞光老化使用一系列浓度剂量（0-5 mM ALA）的光动力治疗（Photodynamic therapy,PDT）处理UVA诱导的光老化的成纤维细胞,随着ALA-PDT浓度增加,衰老相关指标SA-β-gal,p16及p21等表达下调。说明一定浓度剂量的PDT可降低细胞衰老。其中1.0 mM ALA-PDT可降低光老化成纤维细胞中p16及p21的表达,同时增加Bach2蛋白水平。且体内实验显示Bach2荧光信号在PDT治疗的光老化小鼠皮肤组织中分布较对照组高。细胞及体内实验说明PDT治疗可改善光老化,且Bach2可能与PDT治疗光老化有关。干扰Bach2可促进成纤维细胞衰老,使用PDT处理Bach2干扰的细胞,实验结果发现1.0 mM ALA-PDT处理后SA-β-gal的活性一定程度地增加,但Bach2及p16的表达无显着性改变。预示低剂量PDT不能改善Bach2下调导致的细胞衰老。说明低剂量PDT可能通过Bach2调控成纤维细胞光老化。综上所述,本课题从病理、细胞、分子及动物水平探究Bach2参与调控光老化的作用,以及其作用的分子机制与临床应用的指导等。为光老化及光线性相关疾病治疗提供新的研究视角与思路。以及为光老化防治提供理论基础及新的靶标。
张遥[4]（2019）在《靶向抑制Id1通过AKT/mTOR信号通路介导的自噬对骨肉瘤细胞MG63恶性生物学行为及成骨分化的影响》文中研究指明第一部分靶向调控AKT/mTOR信号通路对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、自噬及成骨分化的研究目的探究靶向调控AKT/mTOR信号通路后,对人骨肉瘤细胞株（MG63）增殖、凋亡、自噬及成骨分化的影响,并探讨其机制。方法（1）RT-PCR检测AKT/mTOR在不同恶性程度骨肉瘤细胞中基因表达情况;（2）以骨肉瘤MG63细胞为研究对象,选取mTOR抑制剂（雷帕霉素）和激活剂（3-苄基-5-（2-硝基苯氧甲基）-γ-丁内酯（3-BDO））处理MG63细胞,运用Western blot技术验证两种药物对AKT/mTOR信号通路的调控;（3）运用Western blot方法检测自噬相关蛋白;（4）CCK-8法检测靶向调控AKT/mTOR信号通路后骨肉瘤细胞MG63活力;（5）DAPI染色、Annexin V-FITC/PI双染法检测靶向调控AKT/mTOR信号通路后细胞凋亡;（6）碱性磷酸酶（ALP）染色检测早期成骨能力,茜素红染色检测中晚期成骨能力;（7）Western blot技术检测分化抑制因子（Id1）的表达。结果（1）RT-PCR结果表明AKT、mTOR基因表达水平由高到低依次为143b、MG63、TE85;（2）雷帕霉素可抑制mTOR信号通路,3-BDO可激活mTOR信号通路;（3）靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,可上调自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin1表达（P<0.05）;靶向激活AKT/mTOR信号通路后,可下调自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin1表达（P<0.05）;（4）靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,可抑制骨肉瘤细胞MG63增殖（P<0.05）;靶向激活AKT/mTOR信号通路后,对骨肉瘤细胞MG63增殖无明显影响;（5）靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,可促进骨肉瘤细胞MG63凋亡（P<0.05）;靶向激活AKT/mTOR信号通路后,对骨肉瘤细胞MG63凋亡无明显影响;（6）靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,可抑制骨肉瘤细胞早、晚期成骨分化;靶向激活AKT/mTOR信号通路后,可促进其早、晚期成骨分化;（7）靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,分化抑制因子（Id1）的表达水平上调（P<0.05）;靶向激活AKT/mTOR信号通路后,分化抑制因子（Id1）的表达水平下调（P<0.05）。结论（1）AKT/mTOR信号通路表达水平与骨肉瘤细胞恶性程度呈正相关;（2）在骨肉瘤细胞MG63中,靶向抑制AKT/mTOR信号通路后可上调自噬水平,抑制骨肉瘤细胞增殖,促进细胞凋亡;靶向激活AKT/mTOR信号通路后可下调自噬水平,对细胞增殖、凋亡无明显影响;（3）靶向抑制AKT/mTOR信号通路后抑制其成骨分化,其机制可能与上调分化抑制因子（Id1）有关,为进一步阐明骨肉瘤发病机制,为诱导分化治疗提供理论依据。第二部分靶向抑制Id1联合mTOR抑制剂介导的自噬对骨肉瘤细胞MG63恶性生物学行为及成骨分化的影响目的在靶向抑制AKT/mTOR信号通路后,探讨靶向调控Id1介导的自噬对人骨肉瘤细胞MG63恶性生物学行为及成骨分化的影响。方法（1）采用构建的重组腺病毒AdsiId1,扩增腺病毒siId1,运用荧光显微镜观察细胞荧光表达情况并以RT-PCR和Western blot验证Id1在m RNA和蛋白水平表达;（2）将MG63细胞分为对照组、mTOR抑制剂组（Rapamycin组）、siId1组（AdsiId1感染组）、siId1+Rapamycin组（AdsiId1+Rapamycin组）,运用Western blot检测自噬关键蛋白表达情况;（3）运用m GFP-RFP-LC3双荧光质粒转染法检测各组细胞自噬水平;（4）运用透射电镜检测各组细胞自噬小体数量;（5）CCK-8法检测骨肉瘤细胞MG63活力;（6）Transwell实验检测骨肉瘤细胞MG63迁移和侵袭;（7）流式细胞术检测骨肉瘤细胞MG63周期、凋亡;（8）ALP染色检测细胞早期成骨能力,茜素红染色检测细胞晚期成骨能力;（9）运用Western blot方法检测AKT/mTOR信号通路的表达情况。结果（1）AdsiId1可成功感染骨肉瘤细胞MG63,细胞中Id1在m RNA和蛋白水平均表达下调（P<0.05）;（2）与对照组相比,siId1组自噬相关蛋白Beclin1、LC3II/I表达升高,P62的蛋白表达下调（P<0.05）,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,Beclin1、LC3II/I蛋白表达水平比siId1组升高,P62蛋白表达比siId1组低（P<0.05）;（3）自噬双标质粒转染后,共聚焦结果显示,siId1组较对照组自噬流数增多（P<0.05）,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,自噬流进一步增多（P<0.001）;（4）透射电镜结果显示,siId1组较对照组自噬小体数量增多,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,自噬小体数量进一步增多;（5）与对照组相比,siId1组可抑制细胞增殖（P<0.05）,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,可进一步抑制细胞增殖能力;（6）与对照组相比,siId1组可抑制细胞迁移、侵袭（P<0.05）,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,可进一步抑制细胞迁移、侵袭能力（P<0.001）;（7）与对照组相比,siId1组可阻滞细胞周期于G0/G1期（P<0.05）,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,G0/G1期细胞比例明显增多（P<0.001）;siId1组可促进细胞凋亡（P<0.05）,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,细胞凋亡比例进一步增多（P<0.001）;（8）与对照组相比,siId1组可促进骨肉瘤细胞早期成骨分化,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,细胞早期成骨分化能力明显增强;siId1组对晚期骨肉瘤细胞成骨分化无明显作用,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,细胞晚期成骨分化能力明显增强。（9）与对照组相比,siId1组中p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平下调（P<0.05）,加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平进一步下调（P<0.05）。结论（1）siId1联合mTOR抑制剂可明显抑制骨肉瘤细胞MG63恶性生物学行为,同时促进骨肉瘤细胞成骨分化;（2）骨肉瘤是一种分化疾病,本研究表明靶向抑制Id1通过AKT/mTOR信号通路介导的自噬促进骨肉瘤细胞成骨分化,为揭示骨肉瘤的发病机制提供基础;同时siId1联合mTOR抑制剂可能成为骨肉瘤新的治疗策略。
李亚伟[5]（2013）在《CDKN2A与EGFR基因在胶质细胞瘤中的表达及对化疗敏感性的影响》文中研究指明摘要：目的1.探讨CDKN2A在胶质瘤中的表达及其在胶质瘤发生、发展过程中的作用机制；2.探讨EGFR基因在胶质瘤中的表达及其对化疗敏感性的影响；3.了解促进CDKN2A过表达、干扰EGFR表达在抑制胶质瘤生长及增强化疗敏感性方面是否具有协同作用。方法（一）1.选取中南大学湘雅二医院2007～2011年61例神经胶质细胞瘤患者肿瘤组织作为研究标本,所有病例未进行术前化疗和放疗；2.分别用免疫组化及Western blot方法检测神经胶质瘤组织及神经胶质瘤细胞系U251-MG、T98G、U87-MG、A172、SW1783、 U118-MG、U138-MG、H4和HS-683中CDKN2A的表达,经统计学分析CDKN2A在不同胶质瘤病例和胶质瘤细胞系中的表达量与胶质瘤恶性程度之间的关系；3.利用空载体或CDKN2A重组表达载体转染胶质瘤细胞系,应用免疫组化及Western blot方法检测转染后CDKN2A的表达,倒置显微镜观察转染CDKN2A后神经胶质瘤细胞系形态及生长变化,进行细胞集落计数,绘制生长曲线；4.设计合成CDKN2A特异的siRNA,应用siRNA沉默胶质瘤细胞系HS-683和H4中CDKN2A, Western blot方法检测细胞中CDKN2A、Cyclin D和pRb蛋白的表达,倒置显微镜观察和活细胞计数分析siRNA沉默CDKN2A的表达后神经胶质瘤细胞系形态及生长变化,进行细胞集落计数,绘制生长曲线；5.在siRNA沉默CDKN2A的表达后神经胶质瘤细胞中加入Cyclin D1抑制剂-flavopiridol,倒置显微镜观察胶质瘤细胞形态变化,进行细胞集落计数,绘制生长曲线,并利用Western blot方法检测pRb蛋白的磷酸化水平和cyclin D1表达变化；（二）1.分别用免疫组化及Western blot方法检测上述61例神经胶质瘤患者肿瘤组织中EGFR的表达,经统计学分析EGFR在不同胶质瘤病例中的表达与胶质瘤恶性程度之间的关系；2.用EGFR-siRNA沉默U251细胞EGFR表达,倒置显微镜观察慢病毒干扰EGFR表达后U251细胞形态及生长变化,进行细胞集落计数,绘制生长曲线；3.MTT法分别检测EGFR干扰组-RNAi, BCNU处理组-BCNU,联合组-BCNU+RNAi和空白组的胶质瘤细胞生长增殖的变化,并进行统计学分析；（三）1.利用基因修饰技术,建立联合CDNK2A过表达和干扰EGFR表达的胶质瘤细胞模型,倒置显微镜观察胶质瘤细胞形态及生长变化；2.MTT法分别检测对照干扰组、EGFR干扰组、CDKN2A转染组及CDKN2A转染和EGFR干扰联合组的胶质瘤细胞分别在相同浓度的BCNU作用下生长增殖的变化,并进行统计分析。结果（一）1.CDKN2A在不同恶性程度的胶质瘤肿瘤组织中表达量不同,在低分化胶质瘤患者的肿瘤组织中CDKN2A表达量显着低于高分化胶质瘤患者；同样,在不同恶性级别的胶质瘤细胞株中,高级别胶质瘤细胞中的表达水平亦显着低于低级别胶质瘤细胞；2.CDKN2A过表达可以有效的抑制集落形成活性和降低细胞生长率；3.siRNA沉默CDKN2A的表达后肿瘤细胞生长速度明显增高,而flavopiridola可以逆转这种作用,从而延缓HS-683和H4细胞株的生长；4. siRNA沉默CDKN2A的表达后肿瘤细胞降低pRb磷酸化和细胞周期蛋白cyclin D1的表达,同样flavopiridola可以逆转这种趋势；5.与较低级别胶质瘤细胞系相比,cyclin D1在高级别胶质瘤细胞系中的表达水平增高。（二）1.在不同级别胶质瘤组织中,EGFR在高级别胶质瘤组织中的表达水平明显高于低级别脑胶质瘤；2.靶向干扰EGFR的表达可以显着抑制胶质瘤细胞系U251增殖活性,增强其对化疗药物BCNU的化疗敏感性。（三）EGFR干扰组、CDKN2A转染组均可以有效的抑制U251胶质瘤细胞的生长率,而CDKN2A转染和EGFR干扰联合组亦可以抑制胶质瘤细胞的增殖,并且显着优于其它各组。结论1.CDKN2A的表达量与胶质瘤的恶性程度呈负相关,而EGFR的表达量与胶质瘤的恶性程度呈正相关；2.在恶性胶质瘤细胞周期中,可能存在CDKN2A表达水平负反馈机制,其抗肿瘤作用对cyclin D1具有依赖性,该位点的突变和缺失在神经胶质瘤肿瘤的发生、发展中发挥着关键作用；3. CDKN2A过表达和靶向干扰EGFR的表达均可增强胶质瘤细胞对BCNU的化疗敏感性,并且两者具有协同作用,证实联合基因治疗胶质瘤可以提高治疗的有效性,从而弥补单基因治疗的不足,为新药研发及制定新的治疗方案提供了可靠的理论基础。
冯云鹏[6]（2012）在《p16INK4a基因表达受可逆的乙酰化修饰调控》文中提出p16通过抑制细胞周期依赖性激酶CDK4／6的活性，在细胞周期的进程中起着关键性的调节作用。我们过去的研究表明，组蛋白乙酰转移酶p300对p16基因启动子活性有正向调节作用，而去乙酰化酶HDAC3／4可以抑制其活性。在本文中，我们对是否可逆的乙酰化修饰可以调控p16基因表达，从而影响细胞命运的机制进行了深入的研究。我们的工作证实去乙酰化酶HDAC3／4可以削弱p300介导的p16基因启动子活性的上调，抑制p16基因的转录和表达。我们发现在293T细胞中ZBP-89通过表观修饰，即组蛋白乙酰化修饰，参与p16INK4a的表达抑制，去乙酰化酶HDAC3和HDAC4以剂量依赖的的方式抑制p16INK4a启动子活性，染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实HDAC3/4被ZBP-89和／或YY1招募至p16INK4a启动子上。p300的过表达可以促进p16INK4a的表达并且可以逆转HDAC3／4介导的组蛋白的低乙酰化状态。免疫共沉淀分析的结果表明，ZBP-89、 YY1、HDAC3和HDAC4存在于共同的复合物之中。免疫荧光实验结果显示HDAC4的核质穿梭可能在这一调节过程中起到重要所用。去乙酰化酶抑制剂丁酸钠（NaBu）通过上调p16基因启动子的乙酰化水平从而促进其表达。我们的研究工作将有助于更好的阐明p16INK4a基因转录调控的特异机制，并为基于p16INK4a的基因治疗提供重要的理论基础。
苏加强[7]（2012）在《双特异性溶瘤腺病毒对人食管癌细胞EC-109的体内外抑制作用研究》文中提出在所有恶性肿瘤中食管癌是导致病人死亡的第六位病因，该病是目前应用传统治疗方法最难治愈的恶性肿瘤之一。令人担忧的是，尽管在过去的几十年里食管癌的治疗已经采用了以侵入性外科手术为中心的多模式治疗策略，但病人的总体生存率没有得到实质性的改善。目前，食管癌的发病率与死亡率几乎相等，这说明现在该病的治疗方法是不成功的，现在急需一种新的治疗策略来改变这种局面。以腺病毒为基础发展起来的载体被广泛应用于肿瘤的基因治疗策略之中，然而，肿瘤基因治疗的成败取决于它的特异性及有效性。为了达到以上目的，近年研发的条件复制型腺病毒给肿瘤基因治疗提供了新的平台。依据条件复制型腺病毒的设计理念，我们在既往的工作中应用RAPAd.I载体系统，整合了肿瘤特异性启动子PEG-3p和肿瘤特异性抗癌基因Apoptin成功构建了具有肿瘤特异性启动复制及肿瘤特异性杀伤功能的双特异性溶瘤腺病毒Ad-VP（Ad-PEG-3p-E1a-Apoptin），而且在实验中观察到了Ad-VP这种条件复制型腺病毒比复制缺陷型重组腺病毒Ad-Apoptin及Ad-EGFP更有效力。细胞凋亡是一种生理性的、程序化的细胞主动消亡过程，这种自主的细胞死亡过程除去了正常组织中多余或者衰老无效的细胞，从而保证了机体的正常代谢和功能。在人类许多恶性肿瘤组织中细胞凋亡时常发生，因此，诱导肿瘤细胞凋亡可能是一种强有力的肿瘤治疗方法。Apoptin来自于鸡的贫血因子，它具有不依赖于p53基因，不能被Bcl-2基因抑制的方式诱导多种人类癌症细胞发生凋亡，其中包括肝细胞癌、恶性淋巴瘤、胆管上皮细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌以及大肠癌等。值得欣喜的是，Apoptin对正常的非转化细胞却没有凋亡诱导作用，比如：成纤维细胞、角质形成细胞以及平滑肌细胞等。Apoptin特异性肿瘤凋亡诱导功能的机制虽然没有完全阐明，但与caspase-3活化有关。Apoptin特异性肿瘤凋亡诱导功能与其亚细胞定位有关，正常细胞中Apoptin主要位于细胞质当中，而在转化细胞之中主要在细胞核中定位。有意思的是，caspase上游的抑制因素或者p53的缺失没有阻止Apoptin的凋亡诱导功能，而且抗凋亡基因Bcl-2、BAG-1以及Bcr-Abl也不能抑制Apoptin的凋亡诱导功能。并且因为VP3基因体积很小可以很容易插入到乳多泡病毒、腺病毒等多种病毒的基因组内，以上这些优点提示Apoptin在未来的肿瘤基因治疗中会很有潜力。PEG-3p是PEG-3启动子的最小功能单位。有研究表明，PEG-3p能够在人类肝癌细胞HepG-2、肺癌细胞A549以及宫颈癌细胞HeLa中驱动基因表达，而这种驱动作用在正常的人胚肺细胞WI-38及非洲绿猴肾细胞Vero中却不起作用。近年来，以溶瘤腺病毒为基础的癌症基因治疗在临床前及临床试验中有了广泛的研究。我们先前构建了双特异性溶瘤腺病毒Ad-VP（Ad-PEG-3p-E1a-Apoptin），本实验即应用Ad-VP作用于人食管癌EC-109细胞，在体外通过MTT分析发现在感染剂量为100MOI的条件下，72小时Ad-VP达到了杀伤作用的顶峰，而在1MOI或10MOI时，肿瘤抑制作用明显降低。这说明Ad-VP对EC-109细胞杀伤作用具有剂效及时效关系。相反，这种关系在Ad-Apoptin和Ad-EGFP感染的实验中却没有体现。进一步的AO/EB,DAPI和Annexin V染色分析证明了Ad-VP对EC-109细胞具有明显的杀伤作用。而Ad-VP感染的正常人胚肝细胞L02却没有受到抑制。线粒体途径是细胞凋亡的重要信号通路，细胞凋亡时通常会发生线粒体跨膜电位的丧失，并导致细胞色素C的释放。而且，caspases的活化在细胞凋亡过程中起到核心的作用，无论外源性凋亡途径还是内源性凋亡途径，均通过caspase酶达成凋亡效果。本研究还进一步探讨了Ad-VP诱导凋亡的途径。结果表明，Ad-VP感染EC-109细胞后，造成EC-109细胞线粒体膜电位下降和细胞色素c释放。同时，Ad-VP感染还导致caspase酶活化及caspase酶底物裂解。然而，Ad-VP感染L02细胞后，对线粒体膜电位、细胞色素c和caspase酶均无影响。研究表明，Ad-VP通过线粒体途径诱导了EC-109细胞凋亡，caspase-3、-6和-7在此过程中发挥了重要作用。本研究的动物实验表明，瘤内注射Ad-VP可以显着抑制肿瘤的生长并提高了荷瘤动物的生存率，但是没有彻底消灭荷载的肿瘤，以上结果补充了体内研究的实验数据。总之，双特异性溶瘤腺病毒Ad-VP诱导EC-109细胞发生了显着的凋亡，而这种细胞凋亡诱导作用是通过caspases激活的线粒体途径实现的。Ad-VP在今后食管癌的临床基因治疗中可能会具有很大的潜力。
武海英[8]（2012）在《p16基因与宫颈癌干细胞特性的相关性》文中进行了进一步梳理背景宫颈癌是发生在全球女性中第二常见恶性肿瘤,发病仅次于乳腺癌。世界范围内每年约有50万新发病例,其中80%发生在发展中国家。目前已证实,高危型人乳头瘤样病毒（HPV）是宫颈癌发生的最主要危险因素,但仅少数持续性感染最终可能发展成为宫颈癌。HPV感染和宫颈癌的发生具有直接关系,高危型HPV可以与宿主染色体整合,是宫颈早期癌变/癌前病变最直接的始动因素。HPV病毒的E6、E7蛋白可与P53、Rb相互作用,其中E6蛋白通过细胞泛素连接酶E6AP与P53结合,导致抑癌基因P53降解,破坏了P53介导的P14-MDM2-P53途径,失去正常调控引起无限增殖；E7蛋白竞争优先与pRb结合,使pRb与E2F解离,游离E2F增多,导致P16-cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F途径调控失调,启动G1-S期进展,引起细胞无限增殖。p16在多数肿瘤中扮演着抑癌基因的角色,由于它的基因突变、缺失或启动子区甲基化,造成p16基因表达下调,参与多种肿瘤的发生和发展。目前,已经有报道显示,p16基因表达异常和宫颈癌发生有密切的关系,但在宫颈癌中,p16基因的作用似乎和大多数肿瘤有着明显的区别。为了进一步探讨p16基因在宫颈癌发生发展中的作用机制,本研究检测p16基因与其它抑癌基因pRb、癌基因c-myc、端粒酶Terc在宫颈癌的表达情况。宫颈癌和其他恶性肿瘤一样,存在着转移和复发的问题,制约着宫颈癌治疗的效果和预后,尤其是中晚期的患者,严重影响患者和生活质量和寿命。自从干细胞学说在近几年被逐渐接受后,肿瘤干细胞的概念也得到大家的重视,目前人们猜测肿瘤干细胞的存在是肿瘤转移和复发的重要原因,而且不断在众多肿瘤特性的研究中发现新的证据。目前认为CSC是肿瘤细胞中具有自我更新、多向分化和成瘤性的特殊细胞亚群,具有放化疗引起的凋亡抵抗性以及高侵袭转移性,不易被常规治疗手段根除,导致肿瘤复发。宫颈癌中的CSC研究也取得了一定的结果,其中的ABCG2+、ALDH+、耐药性、体内成瘤能力等特点和其他组织类型的肿瘤CSC特性类似,而且一些成体或胚胎干细胞的标志物如Oct4、Nanog、Nestin等基因表达明显上调。因此,宫颈癌的CSC可能决定着癌的发生、发展、转移和复发。为了进一步探讨p16基因在宫颈癌发生发展中的作用机制,本研究构建了p16基因shRNA慢病毒载体,建立稳定表达pl6shRNA的细胞系,观察p16基因对宫颈癌干细胞的作用,为p16作为靶点的治疗提供理论依据。材料与方法1.本研究收集了在我院门诊及住院不同程度宫颈病变患者,标本为活检或手术切除后经病理诊断证实。其中宫颈癌患者52例,宫颈病变患者193例,正常对照组40例。2.分别采用免疫组化方法检测了p16蛋白及pRb蛋白,采用FISH方法检测了c-myc基因,Terc基因在正常宫颈组织,癌前病变组织及宫颈癌组织中的表达。3.利用Invitrogene公司的慢病毒载体系统PLenti6/BLOCK-iT-DEST,构建p16基因的小发夹RNA载体,并转染宫颈癌Hela细胞系,建立稳定的p16基因沉默Hela细胞株,用RT-PCR和western-blot方法鉴定p16基因沉默情况。4.体外进行细胞球形成实验,检测Hela细胞球中p16基因表达的变化,以及p16基因沉默后,Hela细胞的细胞球形成情况。5.流式细胞学或western-blot方法检测宫颈癌干细胞标志物CD44、CD24、ABCG2、CK17的表达情况。6.用Transwell和Matrigel观察p16基因沉默后Hela细胞的侵袭能力：用体内实验观察p16基因沉默后,Hela组胞的小鼠体内成瘤能力。结果1. p16蛋白、c-myc基因和Terc基因在慢性宫颈炎、上皮内瘤变（CIN）、宫颈癌病变组织中阳性表达率有明显差异（p=0.000）；随宫颈病变级别的加重,阳性率呈逐渐增高的趋势。pRb在不同宫颈病变组织中蛋白阳性表达率有明显差异（p=0.000）,随宫颈病变级别的加重,阳性率呈逐渐降低趋势。2.在宫颈癌的各组临床病理参数分析中可以看出,p16蛋白、pRb蛋白和Terc基因表达与病理分类、临床分期、有无明显转移均无明显相关性（P>0.05）,c-myc基因表达随分化程度的加重,组织学分类为G3的c-myc基因阳性表达率高于G2/G1的患者（P<0.05）。3.针对P16基因设计的3个shRNA序列中,经过293FT细胞包装,以及p16基因mRNA和蛋白检测,sh289效果抑制p16基因表达的效果最好,同时pl4ARF基因表达无明显改变。4. Hela细胞无血清培养基进行细胞球培养,获得的细胞球细胞pl6mRNA和蛋白表达均高于Hela母细胞系。5和Hela母细胞系相比,P16基因沉默后,Hela细胞系中CD44+/CD24-、 ABCG2+细胞数量减少,CK17表达改变不明显,成球能力和侵袭能力均降低。6和Hela母细胞系相比,p16基因沉默后,Hela细胞穿过Matrigel的细胞数量减少。体内实验证明,p16基因沉默后,需要更多的瘤细胞才能在裸鼠体内成瘤,同等细胞数量接种裸鼠时,体内肿瘤的体积和重量均低于接种Hela母细胞所形成的肿瘤。结论1.在从慢性宫颈炎、上皮内瘤变（CIN）到宫颈癌病过程中,p16蛋白表达增高是早期事件,在CIN阶段即开始出现明显异常；pRb蛋白阳性率呈逐渐降低趋势；随恶性程度增加,c-myc基因阳性率呈逐渐增高趋势;Terc基因阳性率逐渐增高。2. p16在宫颈癌中高表达,与其它抑癌基因pRb,癌基因c-myc基因、端粒酶（Terc）改变有一定相关性。3. p16基因沉默载体pl6-sh289,具有抑制宫颈癌Hela细胞p16基因表达的作用,不影响p14ARF表达。4. Hela细胞球细胞p16基因表达增高。p16基因沉默可使Hela细胞中CD44+/CD24-、ABCG2+细胞群体数量减少,但对CK17蛋白表达影响不明显。5. p16基因沉默使Hela细胞体外侵袭能力降低,使Hela细胞小鼠体外成细胞球能力和体内成瘤能力下降。
吴开福,徐培坤,朱立新[9]（2011）在《p16基因及其与胶质瘤的相关性研究进展》文中指出胶质瘤是神经系统最常见的原发性恶性颅内肿瘤,尽管其治疗方法已经由单一的手术治疗发展到手术加放疗和化疗等综合治疗,但患者的预后并没有得到明显的改善[1]。p16基因是近年来发现的一种新型肿瘤抑制基因,它与胶质瘤的发生发展密切相关。肿瘤组织及外周组织检测p16基因可以作为胶质瘤早期预测标记和分型的敏感指标。围绕p16基因开展的
李文烨[10]（2011）在《重组腺病毒介导的人乳铁蛋白抗宫颈癌作用及其机理研究》文中认为宫颈癌在女性恶性肿瘤中发病率居第二位,仅次于乳腺癌。全球每年新增发病人数约49.3万,死亡人数约23万,并呈逐年上升的趋势,已成为一个严重威胁人民健康和生命的问题,我国属于低发国家,但是由于人口基数大,每年的新发病例约14万。宫颈癌传统的疗法多采用常规手术切除、放疗及化疗等,但预后不佳。近年来,随着分子生物学技术的进步和人类对肿瘤免疫、肿瘤病因及分子机制等研究的深入,肿瘤基因治疗取得了突飞猛进的发展,为恶性肿瘤的治疗开辟了新的途径。腺病毒载体由于宿主范围广、感染效率高、可插入外源基因片段大、病毒载体容易制备、不与宿主细胞染色体发生整合等诸多优点而受到大家的重视,成为肿瘤基因治疗中应用最为广泛的载体之一。乳铁蛋白（Lactoferrin,LF）是一种多功能糖蛋白,具有抗肿瘤作用,能明显抑制多种器官包括食道、口腔、肺、肝、结肠和膀胱等多种肿瘤发生、生长和转移。目前,关于人乳铁蛋白（Human Lactoferrin,hLF）对宫颈癌作用的研究尚未见报道,尤其对乳铁蛋白诱导癌细胞凋亡的分子机制尚不清楚。因此,本研究采用MTT、荧光染色、流式细胞术、Western blot、ELISA、免疫组化等技术,探讨了复制缺陷性腺病毒介导的人乳铁蛋白（Ad-hLF）抗宫颈癌的作用及机理,从肿瘤组织细胞周期、细胞凋亡和对机体免疫调节等方面进行了深入的研究,并获得如下研究结果。（1）重组腺病毒的扩增、纯化、鉴定和滴度测定。本试验通过对重组腺病毒Ad-hLF和空载体病毒Ad-GFP转染HEK293细胞,经扩增,纯化,滴度测定,获得了较高的滴度,分别为2.1×109pfu/mL和3.4×109pfu/mL（2） Ad-hLF对宫颈癌HeLa细胞增殖及机理的影响。本试验采用腺病毒介导的人乳铁蛋白（Ad-hLF）感染宫颈癌HeLa细胞。通过MTT、荧光染色、细胞划痕试验、细胞周期分析、RT-PCR等技术检测Ad-hLF对HeLa细胞的影响。结果发现,Ad-hLF处理可显着抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖和迁移（P<0.05）;阻碍HeLa细胞细胞周期进程,使HeLa细胞发生G0/G1期阻滞; Ad-hLF可诱导HeLa细胞凋亡;Ad-hLF可诱导HeLa细胞Bcl-2 mRNA表达的下调,而上调Bax mRNA的表达,导致Bcl-2/Bax比值的下降,促进细胞凋亡。（3）Ad-hLF对荷瘤小鼠实体瘤生长及机理的研究。Ad-hLF可显着抑制U14实体瘤的生长（P<0.05）,肿瘤抑制率达53.51%,并能有效延长其存活时间;流式细胞术分析发现Ad-hLF处理可使荷瘤小鼠肿瘤组织细胞中游离[Ca2+]显着升高（P<0.05）,Ad-hLF处理可下调细胞周期蛋白CyclinE蛋白的表达（P<0.05）,显着上调P21,P27蛋白的表达（P<0.05）,致使肿瘤组织细胞阻滞于G0/G1期。而且Western blot结果表明,Ad-hLF处理可上调荷瘤小鼠肿瘤组织细胞中Fas蛋白的表达;下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达;同时活化caspase-3,通过死亡受体和线粒体途径同时诱导肿瘤组织凋亡。（4）瘤内注射Ad-hLF对荷瘤小鼠免疫调节作用的影响。Ad-hLF处理可以刺激荷瘤小鼠机体产生抗肿瘤免疫效应,提高NK细胞的活性;Ad-hLF可使荷瘤小鼠外周血CD4+和CD8+ T淋巴细胞亚群的数量显着增加（P<0.05）,通过对血清相关细胞因子进行测定发现,荷瘤小鼠血清IFN-γ和IL-2水平均显着升高（P<0.05）,IL-4水平显着下降（P<0.05）,从而逆转由于肿瘤生成而发生的Th1/Th2平衡向Th2漂移;同时,Ad-hLF处理可降低血清TNF-α水平,使肿瘤细胞失去生长和转移的必要基质条件。而且,Ad-hLF处理可抑制肿瘤血管内皮生长因子VEGF的表达。
二、腺病毒介导的P16/CDKN_2基因对TJ899细胞系活性的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、腺病毒介导的P16/CDKN_2基因对TJ899细胞系活性的影响（论文提纲范文）
（1）囊泡蛋白分选相关蛋白35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中英缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 筛选潜在的肝癌相关基因 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 VPS35促进肝细胞癌增殖 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 VPS35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四部分 VPS35通过促进细胞膜上FGFR3受体的分选和转运激活下游PI3K/AKT信号 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Rettromer复合物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 攻读学位期间发表论文,申请课题和专利,参加会议及获奖情况 |
（2）阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 基因治疗载体的研究进展 |
| 1.1.1 病毒载体 |
| 1.1.2 细菌载体 |
| 1.1.3 人工合成载体 |
| 1.1.4 结语与展望 |
| 1.2 神经母细胞瘤 |
| 1.2.1 神经母细胞瘤的发生及流行病学 |
| 1.2.2 神经母细胞瘤分子生物学特征及动物研究模型 |
| 1.2.3 神经母细胞瘤的临床表现及分期分层 |
| 1.2.4 神经母细胞瘤的治疗 |
| 1.2.5 结语与展望 |
| 1.3 GRIM-19的研究进展 |
| 1.3.1 GRIM-19的发现、结构及分布 |
| 1.3.2 GRIM-19的突变及下调与恶性肿瘤的关系 |
| 1.3.3 GRIM-19的功能 |
| 1.3.4 结语与展望 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 PCG阳离子聚合物的合成及转染肿瘤细胞的检测 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 材料和方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 GRIM-19蛋白在神经母细胞瘤组织中的表达 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 阳离子聚合物递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的作用及机制研究 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 材料和方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）Bach2通过自噬调控成纤维细胞光老化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词对照表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 问题的提出及研究意义 |
| 1.2 国内外现状研究 |
| 1.2.1 衰老相关疾病的危害 |
| 1.2.2 皮肤光老化的危害及诱因 |
| 1.2.3 Bach2 在衰老调控中的重要 |
| 1.2.4 自噬在细胞衰老中的作用 |
| 1.2.5 Bach2 调控自噬发生 |
| 1.3 课题的研究目的与意义 |
| 1.3.1 研究目的： |
| 1.3.2 课题研究内容 |
| 1.3.3 课题研究技术路线 |
| 1.3.4 课题的特色及创新点 |
| 2 UVA诱导细胞光老化模型的构建及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器设备 |
| 2.2.1 主要实验仪器及耗材 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 主要实验试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 成纤维细胞光老化模型构建 |
| 2.3.3 SA-β-gal染色 |
| 2.3.4 实时荧光定量PCR |
| 2.3.5 免疫印迹 |
| 2.3.6 免疫组化 |
| 2.3.7 免疫荧光 |
| 2.4 数据统计分析 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 Meta分析鉴定对光损伤的相关基因 |
| 2.5.2 UVA慢性照射诱导原代成纤维细胞光老化 |
| 2.6 分析与讨论 |
| 2.7 小结 |
| 3 Bach2 参与调控成纤维细胞光老化发生 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 主要实验材料与仪器设备 |
| 3.2.1 主要实验仪器及耗材 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 Bach2 超表达质粒构建 |
| 3.3.3 质粒转染 |
| 3.3.4 SA-β-gal染色 |
| 3.3.5 实时荧光定量PCR |
| 3.3.6 免疫印迹 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Bach2 下调后促进成纤维细胞的衰老发生 |
| 3.4.2 Bach2 下调后增加UVA介导的成纤维细胞光老化 |
| 3.4.3 Bach2 过表达后抑制HDF成纤维细胞光老化 |
| 3.4.4 Bach2 抑制UVA介导的成纤维细胞的光老化 |
| 3.4.5 Bach2 的调控依赖于DNA损伤反应激酶ATM及 ATR |
| 3.5 分析与讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 Bach2 通过细胞自噬调节成纤维细胞衰老 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 主要实验材料与仪器设备 |
| 4.2.1 主要实验仪器及耗材 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞核质分离 |
| 4.3.2 免疫共沉淀 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 Bach2 过表达后主要定位于成纤维细胞的细胞质中 |
| 4.4.2 Bach2 过表达促进成纤维细胞自噬发生 |
| 4.4.3 Bach2 下调后抑制成纤维细胞自噬相关基因及蛋白的表达 |
| 4.4.4 自噬抑制成纤维细胞衰老相关 |
| 4.4.5 Bach2 参与调控成纤维细胞自噬的作用机制 |
| 4.5 分析与讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 Bach2在UVA诱导的光老化小鼠皮肤中的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 主要实验材料和仪器设备 |
| 5.2.1 主要实验仪器及耗材 |
| 5.2.2 主要实验试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 组织免疫荧光 |
| 5.3.2 免疫印迹 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 UVA诱导小鼠皮肤光老化的鉴定 |
| 5.4.2 Bach2在UVA介导的衰老小鼠皮肤中表达降低 |
| 5.5 分析与讨论 |
| 5.6 小结 |
| 6 光动力治疗通过Bach2 调控UVA介导的成纤维细胞的光老化 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 主要实验材料和仪器设备 |
| 6.2.1 主要实验仪器及耗材 |
| 6.2.2 主要实验试剂 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 细胞培养 |
| 6.3.2 成纤维细胞光老化模型构建 |
| 6.3.3 SA-β-gal染色 |
| 6.3.4 实时荧光定量PCR |
| 6.3.5 免疫印迹 |
| 6.3.6 组织免疫荧光 |
| 6.3.7 红光照射参数设置 |
| 6.3.8 PDT处理光老化的成纤维细胞 |
| 6.3.9 PDT处理光老化的小鼠 |
| 6.4 实验结果 |
| 6.4.1 PDT(0-5.0 mM)降低UVA介导的光老化 |
| 6.4.2 PDT(0-1.0 mM)处理增加Bach2 的表达 |
| 6.4.2.1 0mM ALA-PDT降低Bach2 下调引起的成纤维细胞的衰老 |
| 6.4.3 Bach2在PDT处理的光老化小鼠皮肤中表达上调 |
| 6.5 分析与讨论 |
| 6.6 小结 |
| 7 结论与展望 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.1.1 Bach2 参与UVA介导的皮肤成纤维细胞光老化 |
| 7.1.2 Bach2 在皮肤成纤维细胞中且具有抵抗UVA引起的光老化 |
| 7.1.3 Bach2 与自噬相关蛋白相互作用介导自噬的发生,抑制成纤维细胞衰老 |
| 7.1.4 Bach2 在光老化小鼠皮肤组织中表达减少 |
| 7.1.5 PDT通过Bach2 调控成纤维细胞光老化 |
| 7.2 后续工作展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A 作者在攻读学位期间发表的论文目录 |
| B 作者在攻读学位期间发表的会议论文目录 |
| C 作者在攻读学位期间参加科研项目目录 |
| D 学位论文数据集 |
| 致谢 |
（4）靶向抑制Id1通过AKT/mTOR信号通路介导的自噬对骨肉瘤细胞MG63恶性生物学行为及成骨分化的影响（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 靶向调控AKT/mTOR信号通路对骨肉瘤细胞MG63增殖、凋亡、自噬及成骨分化的研究 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 靶向抑制Id1联合mTOR抑制剂介导的自噬对骨肉瘤细胞MG63恶性生物学行为及成骨分化的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 ID蛋白在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及学术成果 |
（5）CDKN2A与EGFR基因在胶质细胞瘤中的表达及对化疗敏感性的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 CDKN2A在胶质细胞瘤中的表达及其意义 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 胶质瘤组织及细胞中CDKN2A表达 |
| 2.2 外源性CDKN2A对细胞集落形成及生长率的影响 |
| 2.3 CDKN2A的抗肿瘤作用依赖于Cyclin D1 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 4.1 胶质瘤中的CDKN2A表达水平 |
| 4.2 CDKN2A表达对胶质瘤细胞生长的影响 |
| 4.3 CDKN2A在胶质瘤发病机制中的作用 |
| 第二章 EGFR基因对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 胶质瘤患者组织中EGFR表达 |
| 2.2 重组质粒鉴定结果 |
| 2.3 干扰EGFR对胶质瘤细胞生长的影响 |
| 2.4 干扰EGFR对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 4.1 胶质瘤中的EGFR表达水平 |
| 4.2 靶向干扰EGFR的表达对胶质瘤细胞BCNU的敏感性影响 |
| 第三章 CDKN2A联合EGFR对胶质瘤化疗敏感性影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CDKN2A联合EGFR基因修饰胶质瘤细胞 |
| 2.2 外源性CDKN2A联合EGFR干扰对U251细胞化疗敏感性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 4.1 外源性CDKN2A联合EGFR干扰对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
| 致谢 |
（6）p16INK4a基因表达受可逆的乙酰化修饰调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一部分 研究背景 |
| 一 人 P16INK4A基因及其转录调控机制的研究进展 |
| （一） 细胞周期调控的分子机制 |
| （二） 人 p16~(INK4a)基因的概述 |
| （三） DNA 水平的调控 |
| （四） 转录水平的调控 |
| （五） p16 蛋白翻译后水平调控 |
| （六） 人 p16~(INK4a)基因与肿瘤 |
| 二 转录因子 ZBP-89、YY1 的研究进展 |
| （一） 转录因子 ZBP-89 概述 |
| （二） 转录因子 YY1 概述 |
| 三 组蛋白乙酰化修饰与真核生物基因的转录调控 |
| （一） 组蛋白乙酰化／去乙酰化修饰与转录调控 |
| （二） 蛋白乙酰化修饰酶 |
| 四 本论文的研究内容和意义 |
| （一） 立题依据 |
| （二） 本文的研究内容和意义 |
| 第二部分 实验材料与方法 |
| 一、 实验材料 |
| （一） 质粒 |
| （二） 报告基因质粒的构建 |
| （三） 蛋白质和抗体 |
| （四） 哺乳动物细胞系 |
| （五） 试剂 |
| 二、 实验方法 |
| I. 分子生物学试验方法 |
| （一） 分子克隆 |
| （二） DNA 的琼脂糖电泳 |
| （三） 质粒大量制备的方法 |
| （四） 哺乳动物细胞总 RNA 的提取和反转录 |
| （五） 逆转录（Reverse Transcription, RT） |
| （六） PCR 和荧光实时定量 realtime PCR |
| （七） 染色质免疫沉淀实验（Chromatin immunoprecipitation，ChIP） |
| （八） RNA 干涉（RNAi） |
| II. 细胞生物学实验方法 |
| （一） 哺乳动物细胞系的培养 |
| （二） 真核生物细胞的瞬时转染和萤光素酶报告基因检测 |
| （三） 蛋白质的 Western Blotting 分析 |
| （四） 免疫共沉淀（coimmuno-precipitation assay, CoIP）实验 |
| III 统计分析 |
| 第三部分 实验结果与分析 |
| （一） 多种转录因子调控 p16 基因启动子活性 |
| （二） 鉴定 p16 基因启动自上转录因子调控元件 |
| （三） HDAC3 和 HDAC4 通过下调组蛋白的乙酰化水平来抑制 p16 转录 |
| （四） HDAC3/4 和 p300 在 p16 启动子上的招募被不同转录因子所介导 |
| （五） 可逆的组蛋白乙酰化参与 p16 基因的转录调控 |
| （六） 组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸盐（NaBu）上调 p16 的表达 |
| 第四部分 讨论 |
| 主要结论和创新点 |
| 一、 主要结论 |
| 二、 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 附录（Ⅰ） |
| 附录（Ⅱ） |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（7）双特异性溶瘤腺病毒对人食管癌细胞EC-109的体内外抑制作用研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 食管癌的研究进展 |
| 1.3 溶瘤腺病毒的研究进展 |
| 第2章 表达 Apoptin 双特异性溶瘤腺病毒对人食管癌细胞 EC-109 的抑制作用 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 表达 Apoptin 双特异性溶瘤腺病毒对 EC-109 细胞的作用方式 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 表达Apoptin 双特异性溶瘤腺病毒对信号分子的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 表达 Apoptin 双特异性溶瘤腺病毒对荷瘤模型动物的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 结论 |
| 第7章 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在攻读学位期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）p16基因与宫颈癌干细胞特性的相关性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一部分：P16、PRB、C-MYC、TERC与宫颈癌的相关性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 标本来源与临床资料 |
| 2.2 主要试剂和设备 |
| 2.3 实验相关试剂配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 FISH(荧光原位杂交技术)实验方法 |
| 3.2 免疫组化染色方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 5.1 p16功能与肿瘤关系 |
| 5.2 p16基因与宫颈癌 |
| 5.3 宫颈癌中p16与pRb,c-myc,Terc基因的相关性 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第二部分：P16基因沉默载体构建和HELA细胞转染实验 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要仪器设备 |
| 2.2 细胞株、菌株 |
| 2.3 载体 |
| 2.4 主要试剂 |
| 2.5 基因表达检测引物 |
| 2.6 常用试剂配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 p16 shRNA慢病毒载体构建 |
| 3.2 Hela细胞慢病毒感染和稳定细胞株筛选 |
| 3.3 p16基因表达检测 |
| 3.4 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 p16基因发卡DNA的退火 |
| 4.2 慢病毒入门载体和基因沉默载体质粒构建和鉴定 |
| 4.3 基因沉默慢病毒质粒包装和病毒载体收获 |
| 4.4 RT-PCR结果 |
| 4.5 Westren-blot结果 |
| 4.6 p16shRNA载体对p14ARF蛋白的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 siRNA, ShRNA, dsRNA, miRNA间的区别 |
| 5.2 Plenti6/Block-iT-DEST shRNA慢病毒载体系统的优点 |
| 5.3 Hela细胞的基因沉默载体转染 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分：P16基因表达对宫颈癌HELA干细胞生物学特性的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要实验设备 |
| 2.2 细胞株 |
| 2.3 主要试剂和耗材 |
| 2.4 实验动物 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞冻存和复苏 |
| 3.2 常规细胞培养 |
| 3.3 肿瘤细胞球培养 |
| 3.4 流式细胞检测 |
| 3.5 RT-PCR方法和Western-blot方法检测p16基因表达情况 |
| 3.5.1 RT-PCR检测 |
| 3.5.2 pl6蛋白表达检测 |
| 3.6 细胞体外侵袭实验 |
| 3.7 裸鼠体内实验 |
| 3.8 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 Hela细胞球细胞p16基因表达情况 |
| 4.2 p16基因沉默的Hela干细胞标志物检测 |
| 4.3 p16基因沉默对细胞成球能力的影响 |
| 4.4 p16基因沉默对Hela细胞侵袭能力的影响 |
| 4.5 p16基因沉默对Hela细胞体内成瘤的影响 |
| 5 讨论 |
| 5.1 Hela肿瘤细胞球细胞高表达p16基因 |
| 5.2 p16基因沉默可改变宫颈癌干细胞数量 |
| 5.3 p16基因沉默不影响Hela细胞中CK17基因的表达 |
| 5.4 p16基因沉默对Hela细胞体外侵袭能力的影响 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤干细胞和宫颈癌干细胞研究进展 |
| 1 肿瘤干细胞 |
| 1.1 肿瘤干细胞的概念 |
| 1.2 肿瘤干细胞的来源——肿瘤细胞还是成体干细胞? |
| 1.3 肿瘤干细胞和放疗、化疗耐药的关系 |
| 1.4 肿瘤干细胞和转移的关系 |
| 1.5 肿瘤干细胞的标志物 |
| 2 宫颈癌干细胞研究进展 |
| 2.1 宫颈储备细胞和宫颈癌干细胞的关系 |
| 2.2 宫颈癌干细胞研究新展 |
| 参考文献 |
| 个人简历和在学期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 在学期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）p16基因及其与胶质瘤的相关性研究进展（论文提纲范文）
| 1 p16基因的分子生物学作用 |
| 2 P16基因异常与胶质瘤 |
| 2.1 p16基因缺失、点突变 |
| 2.2 p16基因甲基化 |
| 3 p16基因检测及意义 |
| 4 p16基因与胶质瘤治疗 |
| 4.1 P16基因替代治疗 |
| 4.2 p16基因联合治疗 |
| 4.3 P16基因与传统治疗结合 |
| 5结语和展望 |
（10）重组腺病毒介导的人乳铁蛋白抗宫颈癌作用及其机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 前言 |
| 第一章 乳铁蛋白的研究现状 |
| 1.1 乳铁蛋白的基本结构与分布 |
| 1.1.1 乳铁蛋白的结构 |
| 1.1.2 乳铁蛋白的分布 |
| 1.2 乳铁蛋白的生物学功能 |
| 1.2.1 促进铁的吸收 |
| 1.2.2 抗菌活性 |
| 1.2.3 免疫调节活性 |
| 1.2.4 抗病毒活性 |
| 1.2.5 抗氧化活性 |
| 1.2.6 抗肿瘤活性 |
| 第二章 基因治疗的研究进展 |
| 2.1 病毒载体 |
| 2.1.1 腺病毒载体（adenovirus, AV） |
| 2.1.2 逆转录病毒载体（retrovirus vectors, RV） |
| 2.1.3 腺相关病毒载体（adeno-associated virus，AVV） |
| 2.1.4 慢病毒载体（lentivirus） |
| 2.2 非病毒载体 |
| 2.2.1 裸DNA |
| 2.2.2 脂质体或脂质复合物 |
| 第三章 宫颈癌发生的分子机制 |
| 3.1 细胞周期调控与宫颈癌 |
| 3.1.1 细胞周期蛋白(Cyclin) |
| 3.1.2 细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin-dependent kinases, CDKs) |
| 3.1.3 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（Cyclin dependent kinase inhibitors, CKIs） |
| 3.2 宫颈癌与细胞凋亡 |
| 3.2.1 内源性途径（线粒体凋亡途径） |
| 3.2.2 外源性途径（死亡受体途径） |
| 3.2.3 内质网通路 |
| 3.2.4 细胞凋亡基因 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第四章 重组腺病毒的扩增、纯化、鉴定和滴度测定 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 重组腺病毒的扩增 |
| 4.2.2 重组腺病毒Ad-hLF 的鉴定 |
| 4.2.3 重组腺病毒滴度测定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 腺病毒的转染 |
| 4.3.2 重组腺病毒在HEK923 细胞中的扩增 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 腺病毒介导的人乳铁蛋白对HeLa 细胞增殖及机理研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 重组腺病毒感染效率的确定 |
| 5.2.2 hLF 感染对宫颈癌HeLa 细胞蛋白表达的影响 |
| 5.2.3 MTT 法检测细胞体外增殖活性影响 |
| 5.2.4 细胞划痕试验 |
| 5.2.5 转染细胞凋亡核细胞周期的检测 |
| 5.2.6 Hoechst 33342 荧光染色观察细胞凋亡 |
| 5.2.7 Annexin V-FITC/PI 凋亡检测 |
| 5.2.8 单细胞凝胶电泳（Single cell gel electrophoresis, SCGE）实验 |
| 5.2.9 Ad-hLF 对HeLa 细胞Bcl-2 和Bax 基因mRNA 表达水平的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 Ad-hLF 感染 HeLa 细胞后的表达 |
| 5.3.2 Ad-hLF 对HeLa 细胞增殖的影响 |
| 5.3.3 Ad-hLF 对HeLa 细胞周期的影响 |
| 5.3.4 Ad-hLF 诱导 HeLa 细胞凋亡的评价 |
| 5.3.5 Ad-hLF 诱导 HeLa 细胞凋亡分子机制 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 腺病毒介导的人乳铁蛋白体内抗宫颈癌作用及其机理的研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 试验材料 |
| 6.1.2 试验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 小鼠U14 宫颈癌模型的建立 |
| 6.2.2 Ad-hLF 对U14 宫颈癌生长的影响 |
| 6.2.3 hLF 在小鼠肿瘤组织中的表达 |
| 6.2.4 Ad-hLF 处理对小鼠肿瘤组织细胞周期的影响 |
| 6.2.5 Ad-hLF 处理对小鼠肿瘤组织显微结构的影响 |
| 6.2.6 TUNEL 染色检测Ad-hLF 对肿瘤凋亡细胞数量的影响 |
| 6.2.7 肿瘤组织胞浆内Ca2+的测定 |
| 6.2.8 Ad-hLF 处理对肿瘤组织细胞周期相关蛋白的影响 |
| 6.2.9 Ad-hLF 处理对肿瘤组织细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 Ad-hLF 对荷瘤小鼠肿瘤组织细胞周期的影响 |
| 6.3.2 Ad-hLF 诱导小鼠肿瘤细胞的凋亡形态学改变及评价 |
| 6.3.3 Ad-hLF 处理对肿瘤组织细胞周期相关蛋白表达的影响 |
| 6.3.4 Ad-hLF 处理对肿瘤组织细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 腺病毒介导的人乳铁蛋白对荷瘤小鼠机体免疫调节作用的研究 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 试验材料 |
| 7.1.2 试验方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 Ad-hLF 处理对荷瘤小鼠瘤体重和生命延长率的影响 |
| 7.2.2 Ad-hLF 对荷瘤小鼠胸腺、脾脏重量的影响 |
| 7.2.3 小鼠NK 细胞活性测定 |
| 7.2.4 Ad-hLF 对荷瘤小鼠外周血单核淋巴细胞亚群的影响 |
| 7.2.5 Ad-hLF 处理对荷瘤小鼠血清IL-2, IL-4, IFN-γ,TNF-α |
| 7.2.6 Ad-hLF 对荷瘤小鼠肿瘤组织中VEGF 表达的影响 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 Ad-hLF 对免疫器官及 NK 细胞活性的影响 |
| 7.3.2 Ad-hLF 对荷瘤小鼠外周血单核淋巴细胞亚群的影响 |
| 7.3.3 Ad-hLF 对荷瘤小鼠血清细胞因子的影响 |
| 7.3.4 Ad-hLF 对荷瘤小鼠肿瘤组织VEGF 表达的影响 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 缩略词语表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、腺病毒介导的P16/CDKN_2基因对TJ899细胞系活性的影响（论文参考文献）
- [1]囊泡蛋白分选相关蛋白35通过激活PI3K/AKT信号通路促进肝细胞癌增殖的机制研究[D]. 张桂冀. 重庆医科大学, 2021(01)
- [2]阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究[D]. 徐阳. 吉林大学, 2020(03)
- [3]Bach2通过自噬调控成纤维细胞光老化的作用机制研究[D]. 王梅. 重庆大学, 2019(10)
- [4]靶向抑制Id1通过AKT/mTOR信号通路介导的自噬对骨肉瘤细胞MG63恶性生物学行为及成骨分化的影响[D]. 张遥. 重庆医科大学, 2019(01)
- [5]CDKN2A与EGFR基因在胶质细胞瘤中的表达及对化疗敏感性的影响[D]. 李亚伟. 中南大学, 2013(02)
- [6]p16INK4a基因表达受可逆的乙酰化修饰调控[D]. 冯云鹏. 东北师范大学, 2012(05)
- [7]双特异性溶瘤腺病毒对人食管癌细胞EC-109的体内外抑制作用研究[D]. 苏加强. 吉林大学, 2012(10)
- [8]p16基因与宫颈癌干细胞特性的相关性[D]. 武海英. 郑州大学, 2012(10)
- [9]p16基因及其与胶质瘤的相关性研究进展[J]. 吴开福,徐培坤,朱立新. 安徽医学, 2011(09)
- [10]重组腺病毒介导的人乳铁蛋白抗宫颈癌作用及其机理研究[D]. 李文烨. 西北农林科技大学, 2011(06)