黏附分子与​​肾移植急性排斥反应

一、粘附分子与肾移植急性排斥反应（论文文献综述）

柴云霞^[1]（2020）在《关于抗T淋巴细胞球蛋白-Fresenius作为诱导剂在公民逝世器官捐献肾移植中功效的队列研究》文中研究表明目的目前在肾移植学科领域延长移植肾的存活时间是一项重要的临床目标,而在同种异体肾移植中采用抗体疗法诱导免疫抑制是延长移植肾存活时间的一种重要手段。诱导免疫抑制疗法能为同种异体肾移植带来更佳的治疗效果。抗胸腺细胞免疫球蛋白-Fresenius（Antithymocyte Globulin-Fresenius,ATG-Fresenius）、巴利昔单抗和抗T淋巴细胞球蛋白（Anti-T-lymphocyte globulin,ATG）是三种常见的用于同种异体肾移植免疫诱导疗法中的抗体。肾移植术前给予这三种抗体用于预防急性排斥反应及降低慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host disease cGVHD）的风险。虽然抗T淋巴细胞球蛋白（Anti-T-lymphocyte globulin,ATG）和巴利昔单抗常用于肾移植的诱导方案并且对降低急性排斥反应发生率以提高移植物存活率是有效的,但其诱导剂量尚未标准化。本研究回顾性分析了不同剂量的抗胸腺细胞免疫球蛋白-Fresenius（ATG-Fresenius,ATG-F）在肾移植接受者中的疗效。方法本次研究纳入了自2015年8月1日至2018年7月31日在青岛大学附属医院肾脏移植科首次接受同种异体肾移植并接受ATG-F作为诱导剂诱导的131例成人肾移植受者。根据诱导剂累积剂量分为ATG-F累积剂量<7 mg/kg和ATG-F累积剂量≥7 mg/kg两组,除了肾移植受者体重和体重指数有所差异,关于人口统计学和免疫学危险因素两个剂量组的肾移植供受体匹配良好。通过卡方检验分别比较两剂量组器官捐献者的年龄、性别、死亡原因和缺血时间。采用t检验和单因素方差分析分别比较肾移植术后12月内两剂量组经活检确认的急性排斥反应发生率、移植物功能延迟恢复发生率、移植物和患者存活率以及副作用（包括血液学和感染相关副作用）的发生率有无统计学差异,连续变量表示为平均值±标准差,P值<0.05是有显着统计学差异的。结果活检证实的急性排斥反应的发生率在ATG-F累积剂量<7mg/kg和≥7 mg/kg两组的患者中（前者与后者,分别为7.5%和4.7%,p=0.766）无统计学差异。ATG-F累积剂量<7 mg/kg组的患者移植后12个月内感染发生率低于ATG-F累积剂量≥7 mg/kg组（26.9%vs.50.0%,p=0.006）,ATG-F累积剂量≥7 mg/kg组的患者尿路感染发生率高于ATG-F累积剂量<7 mg/kg组（20.4%对7.46%,p=0.033）,但移植后12个月内肺炎的发生率在ATG-F累积剂量<7mg/kg和≥7 mg/kg（10.4%vs 20.3%,p=0.117）无统计学差异。而两组之间的贫血程度和淋巴细胞减少持续时间是相似的。两组之间总体上移植物功能,移植物功能延迟恢复以及移植物存活率无明显统计学差异。结论数十年来ATG-F被广泛用作同种异体肾移植诱导剂,但其最佳使用剂量仍不清楚。本研究表明ATG-F累积剂量的适度降低对急性排斥反应风险的增加无明显关系,而与此同时降低了肾移植受者感染特别是尿路感染的风险。因此优化ATG-F（本研究结果建议<7mg/kg）用于诱导的剂量可以降低感染风险,而不会损害对肾移植受者的诱导功效。

谢宇^[2]（2019）在《心脏移植急性排斥反应淋巴细胞-微泡复合物超声分子成像实验研究》文中研究说明第一部分心脏移植急性排斥反应淋巴细胞趋化性测定与淋巴细胞-微泡复合物构建背景:急性排斥反应是心脏移植术后的重要并发症,目前临床尚无有效的无创影像检测方法。心脏移植急性排斥反应主要由淋巴细胞介导。本研究拟利用淋巴细胞构建靶向超声探针,以期进行心脏移植急性排斥反应超声显像。方法:手术构建大鼠心脏移植模型。①异基因移植组:Brown Norway大鼠为供体,Lewis大鼠为受体;同基因移植组:Lewis大鼠同为供体和受体;②心脏移植受体体内输入DiR标记的淋巴细胞,2小时后离体荧光成像,观察DiR-淋巴细胞在心脏移植受体各器官中的分布;③异基因移植受体体内输入DiI标记的淋巴细胞,15分钟后移植心脏切片,观察DiI-淋巴细胞血管粘附和组织浸润情况;④制备抗大鼠CD4抗体修饰的微泡（MBCD4）,MBCD4与大鼠脾脏淋巴细胞孵育,构建淋巴细胞-微泡复合物（cell-MBs）,光镜下观察cell-MBs形态并测量粒径。结果:①心脏移植受体输入DiR-淋巴细胞2小时后,异基因移植心脏DiR荧光强度显着高于同基因移植心脏（p<0.05）;②异基因移植受体输入DiI-淋巴细胞15分钟后,免疫荧光切片显示DiI-淋巴细胞粘附移植心脏血管内皮并浸润组织间隙;③体外光学显微图片显示淋巴细胞与微泡结合,cell-MBs制备成功;颗粒计数仪测得其粒径为 3.16±0.2 μm。结论:①异基因移植心脏中淋巴细胞与血管内皮粘附,具有向异基因移植心脏趋化特性。②淋巴细胞-微泡复合物可作为超声分子成像探针检测心脏移植急性排斥反应。第二部分超声分子成像检测心脏急性排斥反应背景:迄今为止,心电图、常规超声心动图、磁共振等临床方法尚不能特异性检测心脏急性排斥反应。心内膜心肌活检是确诊急性排斥反应的金标准,但有创且并发症多。本研究拟利用淋巴细胞-微泡复合物（cell-MBs）实施移植心脏超声分子成像,以期无创检测心脏急性排斥反应。方法:手术构建大鼠心脏移植模型。①异基因移植组:Brown Norway大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,受体未接受药物处理;异基因环孢素A（CsA）组:Brown Norway大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,受体术后第0-3天接受7.5 mg/kg/d CsA皮下注射;同基因移植组:Lewis大鼠同为供体和受体;②三组移植心脏均以普通微泡（MBs）、抗CD4抗体修饰的微泡（MBCD4）和cell-MBs三种超声造影剂进行超声分子成像。③组织学检查评价各组移植心脏排斥反应等级。结果:①在异基因移植组,cell-MBs超声分子影像信号显着高于MB CD4和MBs（p<0.05）,MBCD4超声分子影像信号显着高于MBs（p<0.05）;在异基因CsA组,cell-MBs超声分子影像信号显着高于MBCD4和MBs（p<0.05）,MBCD4超声分子影像信号与MBs无显着差异（p>0.05）;在同基因移植组,cell-MBs、MBCD4、MBs的超声分子影像信号均无显着性差异（p>0.05）;②Cell-MBs超声分子影像信号在异基因移植组显着高于异基因CsA组（p<0.05）,在异基因CsA组显着高于同基因移植组（p<0.05）;MBCD4超声分子影像信号在异基因移植组显着高于异基因CsA组（p<0.05）,在异基因CsA组与同基因移植组无显着差异（p>0.05）;③组织切片HE染色显示异基因移植组移植心脏发生3R级急性排斥反应,异基因CsA组移植心脏发生2R级急性排斥反应,同基因移植心脏无排斥反应。结论:Cell-MBs超声分子成像是一种新的无创检测2R级及以上程度心脏移植急性排斥反应的有效方法。第三部分心脏急性排斥反应中趋化因子与粘附分子对淋巴细胞-微泡复合物超声分子成像的影响背景:趋化因子和粘附分子是参与淋巴细胞炎症趋化和血管粘附的重要因子。本研究拟探讨心脏急性排斥反应中趋化因子与粘附分子对淋巴细胞-微泡复合物超声分子成像的影响。方法:手术构建大鼠心脏移植模型。①异基因移植组:BN大鼠为供体,Lewis大鼠为受体;同基因移植组:Lewis大鼠同为供体和受体;②术后第三天,RT-PCR分析两组移植心脏CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL4和CCL5 mRNA表达情况,免疫组织化学染色分析细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）表达情况;③大鼠异基因心脏移植术后第三天行cell-MBs超声分子成像,体内输入CXCL9、ICAM-1或VCAM-1中和抗体后重复cell-MBs超声分子成像,比较抗体封闭前后cell-MBs超声分子影像信号差异。结果:①RT-PCR显示CXCL9mRNA在异基因移植心脏中的表达显着高于同基因移植心脏（p<0.05）,CXCL10、CCL2、CCL4和CCL5的mRNA在两组间表达无显着性差异;免疫组织化学染色显示ICAM-1和VCAM-1在异基因移植心脏中表达显着高于同基因移植心脏;②CXCL9体内封闭显着下降异基因移植心脏的cell-MBs超声分子影像信号（p<0.05）,ICAM-1和VCAM-1体内封闭未能显着下降异基因移植心脏的cell-MBs超声分子影像信号（p>0.05）。结论:CXCL9是参与心脏急性排斥反应cell-MBs超声分子影像信号的关键分子。

张岩^[3]（2019）在《沙利度胺对大鼠肾移植模型慢性排斥反应的保护作用及机制研究》文中研究说明诱导成功的移植耐受可以使人类跨过免疫系统的天然障碍,真正的完成器官“置换”的终极目标;成功的免疫耐受不仅可以延长移植物存活时间,而且可以缓解器官移植带来的巨大经济负担、患者身心压力和器官短期的医疗局面。现阶段治疗方案虽然能减少急慢性排斥反应发生,却无法达到耐受。肾移植术后随访4至5年,大约30%病人会呈现慢性排斥的病理表现。因此,当前移植学界的首要目标就是探求新的免疫抑制方案。大鼠肾脏移植模型具有通过可适用于人类情况的手段研究耐受性诱导的潜力,研究者可以通过操控大鼠肾移植排斥反应,理解其发病机制。泌尿道的重建技术是大鼠肾移植模型的关键技术之一,因为大鼠输尿管的口径极窄,易导致尿漏、输尿管坏死和输尿管狭窄等并发症,可致移植肾积水或移植肾功能恶化。不同的泌尿道重建术式也会导致肾移植的不同结局。我们在建立大鼠肾移植模型时采用包含输尿管的供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合技术重建泌尿道,同时与供体膀胱瓣-受体膀胱吻合的方法进行比较,以期改良泌尿道重建方法,减少并发症的产生。我们前期的研究发现沙利度胺可以显着减轻大鼠血管移植物动脉粥样硬化,减轻移植物血管病。其机制为改善炎症反应,减轻淋巴细胞的浸润,减少VEGF、PDGF、ICAM、TNF-α及PCNA的表达,延缓移植血管的硬化进程以及减轻内膜增生。在本实验中我们通过建立改良的供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合尿路重建建立大鼠肾移植模型,观察沙利度胺对大鼠肾移植急、慢性排斥的作用,并阐明其免疫学机制。通过混合淋巴细胞培养,观察沙利度胺在体外对异体反应性T细胞的增殖及分化等情况的影响,阐明其对反应性淋巴细胞的调控机制。第一部分:改良的供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合建立大鼠肾移植模型目的:应用改良的供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合泌尿道重建建立大鼠肾移植模型,与供体膀胱瓣-受体膀胱吻合的方法进行比较,明确改良的大鼠肾移植泌尿道重建方式的效果。方法:分别以供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合泌尿道重建及供体膀觥瓣-受体膀胱吻合泌尿道重建的方式建立大鼠肾移植模型:A组,供体小膀胱瓣-受体膀胱粘膜层浆肌层双层缝合（n=12）:B组,供体膀胱瓣-受体膀胱单层缝合（n=11）。对比泌尿道重建时间及并发症。结果:A组尿路重建时间为14.12±1.73min、B组尿路重建时间为10.16±1.19min,两组差异有统计学意义（P<0.05）;A组泌尿道并发症发生率为25%,B组泌尿道并发症发生率为9.09%,两组差异有统计学意义（P<0.05）。结论:改良的供体小膀胱瓣-受体膀胱双层缝合的泌尿道重建方式能减少大鼠肾移植术后泌尿系统并发症,尽管尿路重建时间时间较传统的单层缝合时间长,但可以显着减少尿漏的可能性,为可靠性高的重建术式。第二部分:沙利度胺对大鼠肾移植急性排斥反应的作用目的:阐明沙利度胺在大鼠肾移植急性排斥反应中的作用。方法:建立Fischer到Lewis大鼠肾移植模型。使用同系LEW-LEW移植物作为对照。将受体大鼠分为同系移植组（Isograft,Iso）、异系移植组（Allograft,Allo）、环孢素组（CsA）和沙利度胺组（Thalidomide,Tha）。动态监测术后肌酐（Scr）的变化,观察至术后5天,留取血液标本检测白细胞介素（IL）-2、IL-6、IL-17和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的浓度,移植肾行病理检查。结果:急性排斥模型中Allo组及Tha组大鼠肌酐均进行性升高,Tha组肌酐水平与Allo组相比无明显差异,均显着高于同时间点Iso组及CsA组。Tha组移植肾病理学改变与Allo组相似,均可见急性肾小管损伤表现,弥漫性重度炎症浸润伴严重肾小球病,内膜动脉炎和小动脉透明变性。Allo组IL-2、IL-6、IL-17和TNF-α的浓度显着升高,Tha组血清中IL-6、IL-17和TNF-α的浓度显着低于Allo组,但IL-2的浓度显着高于Allo组。结论:这些结果表明,沙利度胺的免疫抑制作用较弱,对急性排斥反应效果较差。第三部分:沙利度胺对大鼠肾移植慢性排斥反应的作用及其免疫调节机制的初步研究目的:观察沙利度胺对大鼠肾移植模型慢性排斥反应的作用,并明确其确切的机制。方法:建立Fischer到Lewis大鼠肾移植模型。使用同系LEW-LEW移植物作为对照。将受体大鼠分为同系移植组（Isograft,Iso）、异系移植组（Allograft,Allo）和沙利度胺组（Thalidomide,Tha）。术后8周取血液测定受者血清中肌酐,IL-2、IL-6、IL-17和TNF-α的浓度;流式细胞术检测外周血中T细胞亚群分布。取移植肾行病理检查;免疫荧光、蛋白印迹实验检测各组肾组织中转换生长因子β1（TGF-βl）、平滑肌肌动蛋白α（α-SMA）和血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达。结果:肾移植后8周,移植肾出现不同程度的单个核细胞浸润、肾小球硬化、肾小管萎缩、间质纤维化和小动脉内膜厚等病理学改变。Tha组大鼠移植肾的病理改变明显轻于Allo组。Tha组大鼠血肌酐水平及血清中炎性细胞因子的浓度显着低于Allo组,Tha组外周血中CD4+CD25+、CD4+CD25+FoxP3+T细胞比例显着升高、CD4+Th17+T细胞比例显着降低,TGF-β1,α-SMA和VEGF蛋白的表达显着降低。结论:沙利度胺可以显着减轻慢性排斥反应,其机制可能为沙利度胺减少炎症因子的分泌,改变T细胞亚群的分布,并降低相关致纤维化蛋白表达有关。第四部分:沙利度胺对异体反应性淋巴细胞的调控作用目的:观察沙利度胺在体外对体反应性淋巴细胞的影响,阐明其对反应性淋巴细胞的免疫调控作用。方法:建立Fischer-Lewis单向混合淋巴细胞培养（Mixed lymphocyte culture MLC）体系,分为对照组（Control,Con）及沙利度胺组（Thalidomide,Tha）,流式细胞术检测T细胞亚群分布情况及凋亡率,ELISA法测定培养液中IL-2,IL-6,IL-17和TNF-α的浓度。结果:Tha组中Th17细胞比例显着低于同时间点的对照组,Treg细胞比例均显着高于同时间点的Con组,差异均有统计学意义（P<0.05）:Tha组培养液中IL-2浓度显着高于同时间点的Con组（P<0.05）;Tha组中T细胞凋亡率显着高于同时间点的Con组,差异均有统计学意义（P<0.05）;而IL-6,IL-17和TNF-α浓度显着低于同时间点的Con组（P<0.05）。结论:沙利度胺在体外可以促进异体反应性T细胞中Treg细胞增殖,抑制Th17细胞增殖,改变T细胞亚群分布,增加异体反应性T细胞凋亡,降低炎症因子IL-6,IL-17和TNF-α的浓度。

叶东明^[4]（2014）在《大鼠同种异体肾移植前期急性排斥反应模型的建立及其预警标记物的筛选》文中指出研究背景：肾移植已经成为终末期肾病患者的主要治疗手段之一。随着强有效的移植免疫研究及新型免疫抑制剂药物的持续开发,使移植物的短期存活时间获得了很大程度的提高,然而移植物长期存活率并没有得到根本改善。影响移植肾存活的因素很多,主要分为移植前、后两方面因素。移植前的因素主要包括脑死亡及器官缺血时间；移植后的因素中主要包括再灌注损伤、感染、排斥反应、肾毒性等。而导致上述相矛盾性结果的主要原因可能是1.等待肾移植的患者数量逐年增加导致供体肾脏总体质量下降；2.免疫抑制剂药物的肾毒性；3.急性排斥反应或者慢性排斥反应发生的亚临床症状的隐匿性增加等。其中急性排斥反应是肾移植术后最为常见的并发症。移植肾功能的丧失意味着受者需要再次接受移植治疗,这无疑会加重器官极度短缺的现状及浪费更多的卫生资源。所以如果移植前肾损伤因素相同的情况下,移植后肾损伤应该降低到最低。因此,移植术后的实时监测特别是急性排斥反应的前期、及时监测与发现对改善移植肾脏功能、延长患者的长期存活以及降低医疗费用等能提供重要意义。目前肾移植术后肾功能的监测方法主要是1.通过常规检查血清肌酐值,但是血清肌酐值的变化已经晚于移植肾功能相关蛋白的前期变化；2.细针穿刺活检仍然是移植肾脏急性排斥反应诊断的“金标准”。但是,移植肾脏前期急性排斥反应的病理变化不明显,因此病理诊断落后于移植肾脏本身前期已经发生的分子变化,这无疑会延误患者的病情诊断及对受者术后有效性的干扰治疗同时细针穿刺存在很多局限性,包括1.在短期内不能反复进行；2.可能导致移植肾脏急性损伤的发生；3.穿刺部位不准确导致的误诊及损伤邻近器官；4.同时不利于受者的动态随访观察。所以临床医生急需寻找一种无创、前期、安全、有效的方法来替代目前的检查方法从而更准确的判断急性排斥反应的发生并指导术后免疫抑制药物的治疗。针对这一需求,通过检测受者血清及尿中相关标记物己成为该领域研究的热点。无创性标记物的发现可能弥补上述不足,提供对移植术后免疫反应、组织损伤、免疫药用治疗等实现实时监测。以往报道中大部分的研究都集中在细胞毒性T细胞的效应蛋白及相关免疫分子上。然而,参与肾急性排斥反应的发生机制还有待于进一步阐明,可能还存在着其它因素的共同参与,比如炎症、肾小管急性损伤、氧化应激等等。本课题主要通过监测同种异体肾移植大鼠模型中血清的NGAL, KIM-1, CRP, MDA以及sHLA-DR的变化,并试图找出它们在肾移植大鼠中血清的表达与肾急性排斥反应早期发生的相关性,从而对大鼠早期肾急性排斥反应发生进行预警作用。而针对初学者而言如何快速、简单、有效的建立大鼠肾急性排斥反应模型对于今后整个实验的研究开展是至关重要的,也是整个实验过程中首要的。此外,选择大鼠同种异体肾移植模型有许多优点：它容易获取,研究费用低,便于管理,且可以进行同源基因移植研究等。但是选择大鼠同种异体肾移植模型也有不足,它表现为大鼠个体小,血管吻合难度大,一般需经过至少3个月的显微外科训练,限制了其研究应用,尤其是对初学者而言面临着更大挑战。我们通过文献的学习以及多次反复的训练改进,本课题还同时对大鼠同种异体肾移植模型方法进行了改进与评估,特别是供受体之间结合硬膜外导管内支架技术进行肾静脉端端吻合,并与目前推荐的肾静脉吻合方法进行比较。我们建立了一种稳定的、简单、有效的大鼠肾移植模型,尤其是初学者容易掌握学习。目的：1、寻找一种稳定的、简单、有效的大鼠同种异体肾移植模型,尤其适合初学者掌握学习,为大鼠肾移植急性排斥反应的研究开展提供首要的条件。2、探讨同种异体肾移植大鼠模型中血清的NGAL、KIM-1、CRP、MDA以及sHLA-DR的变化,从而寻找出它们与大鼠早期肾急性排斥反应发生预警作用的关系。为大鼠早期肾急性排斥反应的监测及早期防治提供依据。方法：1.正常SD雄性大鼠为供体,Wistar雄性大鼠为受体,建立稳定的同种异体肾移植大鼠模型。。肾动脉采用端、侧连续缝合,肾静脉采用端端连续与间断缝合,输尿管采用膀胱瓣连续缝合,进行供、受体左侧同种异体大鼠原位肾移植。对大鼠同种异体肾移植术后第3、4个月连续进行45次手术进行评估。2.雄性Wistar大鼠分别作为供者和受者,进行大鼠同种异体原位肾移植模型的建立。我们采用肾静脉内置入硬膜外导管作为内支架进行端端吻合的方法,并进行方法改进,同时记录同种异体肾移植大鼠移植后的生存率、热缺血时间、肾静脉吻合时间以及术中、术后的并发症进行统计分析,并与目前多数文献报道的大鼠供、受体之间肾静脉吻合方法进行比较。并由两个初学者参与实验,每个初学者分别采用两种方法连续进行30台实验。3.分别采用Brown-Norway （BN）原位肾移植到Lewis大鼠中作为实验组以及Lewis大鼠原位肾移植到Lewis大鼠中作为对照组。并分别在同种异体肾移植术后第3、5、7天处死大鼠,每个亚组共重复五只,同时留取各组大鼠的血清标本用于检测血清NGAL、KIM-1、CRP、MDA以及sHLA-DR的表达水平以及肌酐值,同时对移植物进行组织病理学切片染色。此外,我们还对移植物的NGAL蛋白进行评估分析。结果：1.按照文献报道大鼠同种异体肾移植术后存活3天以上认为肾移植造模成功。统计第3、4个月造模练习结果,两个月总共连续移植45次供受体手术。其中存活超过3天以上的受体为52只,成功率达86.7%；术后3天内死亡的受体数量为6只,分别为麻醉意外1只、低血容量1只、血栓2只、低体温2只。受体肾动脉吻合时间（15±1.5min）,肾静脉吻合时间（15±1min）,总时间（30±2min）。2.与目前推荐的大鼠肾静脉吻合术相比较,初学者采用硬膜外导管的改良技术进行大鼠同种异体原位肾移植建模可以获得较短的学习曲线。同时,两种大鼠同种异体原位肾移植静脉吻合术的术中并发症及术后并发症也进行评估分析。采用目前推荐的大鼠肾移植方法中,两名初学者出现的并发症分别为静脉狭窄6例,血栓形成9例,吻合口渗漏7例,血管痉挛4例,肾静脉损伤3例。而采用改良后的技术可以很好的减少上述并发症的发生率。两名初学者采用改良后的技术进行大鼠肾移植是发生的并发症概率分别为肾静脉狭窄0例,血栓形成3例,吻合口渗漏0,血管痉挛3例和肾静脉血管1例。初学者采用两种方法进行的大鼠肾移植中肾静脉吻合并发症的发生率有统计学差异（P<0.01）。3.在对照组中肾移植术后血清中NGAL、KIM-1水平第5、7天的值与第3天相比较,有所降低,但没有统计学差异（P>0.05）。但是在实验组中,大鼠同种异体肾移植术后血清中第3、5、7天NGAL和KIM-1水平较对照组有统计学意义（P<0.01）,并且在实验组第3、5、7天中它们的血清水平组内比较也有统计学意义（P<0.01）。大鼠同种异体肾移植术后对照组中血清CRP及MDA表达水平在肾移植术后第3、5、7天之间并没有统计学意义（P>0.05）。而在实验组中大鼠同种异体肾移植术后血清中第3、5、7天CRP及MDA表达水平较对照组有统计学意义（P<0.01）。此外,在本研究中,大鼠同种异体肾移植术后实验组与对照组中血清HLA-DR水平没有统计学意义（P>0.05）。但是它的血清表达有一定的波动性。结论：1.我们推荐初学者进行大鼠同种异体肾移植模型的建立组合是：肾动脉采用腹主动脉套囊端、侧连续缝合,肾静脉结合硬膜外导管以及端、端连续及间断缝合,输尿管采用膀胱瓣连续缝合,进行供、受体左侧原位大鼠肾移植。它是一种稳定的、简单的、有效的大鼠肾移植模型,初学者容易掌握学习。2.通过供受体之间的肾静脉管腔内插入3mm长度硬膜外导管充当肾静脉内支架管这一技术是一种简单的、可靠的、有效的大鼠同种异体肾移植模型。它可以有效的缩短初学者对大鼠同种异体原位肾移植的学习曲线。此外,肾静脉管腔内插入3mm长度硬膜外导管充当静脉支架管的技术还可能应用到其他动物器官移植模型的肾静脉吻合。3.通过检测大鼠同种异体肾移植模型血清中NGAL、KIM-1、CRP和MDA含量的表达水平可能对大鼠同种异体移植模型中前期肾急性排斥反应进行提前预警。它们在血清中的异常表达要早于大鼠同种异体肾移植急性排斥反应组织病理学上的变化及其肌酐的变化。从而可以让我们在早期就可以对大鼠同种异体急性排斥反应的发生进行提前干预,进一步减少急性排斥反应带给大鼠同种异体肾移植物的损害,从而增加大鼠同种异体移植肾的存活率及其早期预防移植术后并发症的发生。

吴凤林^[5]（2011）在《细胞间粘附分子-1（ICAM-1）靶向超声分子成像评价大鼠移植肾急性排斥反应》文中进行了进一步梳理背景和目的：移植肾急性排斥反应（Acute rejection, AR）是肾移植术后常见并发症,最易导致移植肾早期功能丧失,是移植肾存活和维持功能的主要障碍之一。研究表明,当AR发生时,首先表现为移植肾微血管内皮损伤,血管内皮细胞高表达或分泌一些与排斥反应有关的炎性分子标记物如细胞间粘附分子-1 （Intercellular adhesion molecule, ICAM-1）、血管细胞间粘附分子-1 （Vascular cell adhesion molecule, VCAM-1）等,这些炎性分子标记物能够促进T细胞、血小板或其它炎性细胞沿血管内皮滚动、粘附、聚集和外渗,后者可介导血管内皮炎症反应并释放多种炎症介质或促炎细胞因子进入到肾间质组织,如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白细胞介素-1（IL-1）,血栓素A2（TXA2）等,进而导致移植肾脏组织及微血管损伤。因此,一定程度上讲,血管内皮损伤是移植肾AR的最早阶段,检测血管内皮所表达的特殊分子标记物如ICAM-1有可能早期评估移植肾AR的存在。事实上,长期以来,学者们对移植肾排斥反应的诊断,特别是急性排斥反应的诊断进行了多种多样的研究,以求在组织学发生不可逆转改变之前达到早期、准确地诊断并开始治疗。众多研究者从免疫学监测、移植肾影像学和病理学检测等多方面进行了大量有益的探索与研究。但不同的检测手段和方法均有各自的局限性,如肾闪烁扫描术可以评价缺血性损伤,但在肾移植术后早期并不能鉴别AR、急性肾小管坏死和环孢素中毒,仅对何时恢复及移植肾短期或长期存活有一定价值。而MRI、PET等其它非靶向性放射性成像方法虽对评估肾移植后形态学和代谢变化能够提供有价值的参考信息,但PET和MRI等方法存在着一些无法克服的缺点：例如,仪器要求高,不能床边检查,放射示踪剂缺乏稳定性及具有放射污染等,使其临床应用受到一定的限制。目前,移植肾穿刺取组织进行病理学检查仍是诊断AR的最准确方法。但由于肾穿刺损伤大,易发生出血及其它严重并发症,故不能作为常规监测手段。因此,寻找一种安全、无创、敏感的检测手段对AR做出早期诊断具有重要的应用价值。近年来,随着靶向超声微泡造影剂的出现,靶向超声分子显像（Targeted ultrasound molecular imaging）逐渐成为现实,极大拓展了传统超声微泡的应用范围,其作为血管内示踪剂能特异地粘附于血管内皮表面从而在行超声检查时被探测到,这使得应用超声技术从分子水平对各种疾病进行早期诊断成为可能。目前,靶向超声分子成像技术已经成功地对肾脏、下肢、肿瘤等部位的血管内皮炎症/血管新生进行了评价,对心脏移植排斥反应的监测也进行了初步探索。但移植肾AR由于小动物肾移植模型构建复杂、繁琐等原因,关于其靶向成像的研究尚属于空白阶段。我们实验室经过多年的探索和技术改进,靶向超声微泡构建研究也取得了相当大的成果,构建的靶向超声微泡大小和浓度、稳定性、抗体携带率等均已达到国际同等或更高水平,并且依靠血管内皮炎症相关因子（ICAM-1）靶向超声微泡成功实现了对肾脏、心脏等的血管内皮炎症反应评价。在前期工作基础之上,本研究尝试利用构建的靶向肾脏微血管内皮表面细胞间粘附分子-1（ICAM-1）靶向超声微泡和对比超声相结合,并采用先进的超声成像技术（将对微泡的破坏性降到最低）对移植肾AR进行早期评价和诊断,这无疑具有重要临床意义。因此,本研究在普通脂质微泡的基础上,通过“抗生物素蛋白/生物素复合体”的化学桥接作用将抗大鼠ICAM-1单克隆抗体连接于脂质微泡外壳构建了携带抗ICAM-1的靶向超声微泡（MBI）,并在大鼠移植肾AR模型上,应用MBI和对比超声（CEU）检查相结合,目的在于探讨MBI结合CEU评价大鼠移植肾AR的可行性。材料和方法：1、超声微泡的制备与评价1.1、超声微泡的制备各种相关脂质材料按一定质量比例75℃水浴溶解于适量蒸馏水中,同时通全氟丙烷（C3F8）气体,超声振荡至形成乳白色液体制备生物素（biotin）化脂质微泡（MB）。MB经静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合脂质纯化1次后,按一定比例加入抗生蛋白链菌素（streptavidin）。继续静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合抗生蛋白链菌素纯化微泡1次后,按一定比例加入生物素化的抗大鼠细胞间粘附分子-1 （ICAM-1）和同型对照抗体（isotype control antibody）,分别得到携带抗ICAM-1单抗靶向超声微泡（MBI）和同型对照微泡（MB）,最后静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合抗体纯化微泡1次,冰箱中4℃保存备用。1.2、超声微泡体外评价：1.2.1、库尔特计数仪测量超声微泡的平均粒径及浓度。采用绿色荧光标记的二抗与抗大鼠ICAM-1单克隆抗体结合荧光显微镜下观察ICAM-1单抗与微泡外壳的连接情况。1.2.2、平行板流动腔评价超声微泡粘附性能应用包被有大鼠ICAM-1抗原的聚苯乙烯培养皿作为平行板流动腔体外检测微泡粘附稳定性的平台。以普通脂质微泡非特异性粘附效果为对照,采用大鼠ICAM-1 （1000ng/μl抗原浓度）包被检测MBI粘附特异性及效能,所有分组均按平行板流动腔实验说明书要求检测3个样本（n=3）。MBI及MB（1×108/m1）经微量注射泵以0.5dyn/cm2剪切应力分别通过“大鼠ICAM-1抗原”包被的平行板流动腔,自显微镜下观察到有微泡出现后开始连续录像6min,观察每分钟微泡的靶向结合情况。1.2.3大鼠肾脏对比超声（Contrast enhanced ultrasound, CEU）评价超声微泡显影效果SD大鼠给予腹腔注射3%乌拉坦-水合氯醛麻醉后,背部备皮,尾静脉插管,使用sequoia512超声机,固定17L5探头在肾脏长轴,固定探头频率为7MHz,深度25mm,机械指数0.18,动态范围80分贝,经尾静脉注射1mlMB或MBI后以0.2ml生理盐水冲管,CPS实时成像,所有图像存储于MO盘备用。2、大鼠移植肾AR模型的构建2.1、移植前准备：供、受体均在移植前禁食12h,自由饮水,以3%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉。2.2、供体移植：麻醉成功后备皮,常规消毒铺巾。取腹部正中切口,由剑突至耻骨联合。以自制拉钩将腹壁向左右拉开,将全部肠管、胃、脾脏翻置腹腔外,湿纱布覆盖,显露左肾、左输尿管和膀胱。游离出腹主动脉、下腔静脉,用5/0丝线结扎左精索静脉及左肾上腺静脉并剪断,去除肾脂肪囊,分离左输尿管至膀胱,该过程中注意尽量保留输尿管周围脂肪组织,以免影响输尿管血供。显微血管钳阻断下腔静脉和腹主动脉上、下端,由腹主动脉下端插入灌注管,在下腔静脉下端剪一开口,4℃有肝素林格氏液（25U/m1）经腹主动脉插管灌注,灌洗至左肾和所属血管完全苍白,下腔静脉流出液变清澈为止,灌注量5-10ml。拔出腹主动脉插管,切断肾动、静脉,分离出左肾后放入盛有0℃-4℃乳酸林格氏液的小盘里。2.3、受体移植：步骤同上,受体SD大鼠作腹部正中切口。由剑突至耻骨联合,同样将肠管推向右侧,以温盐水纱布包裹。近肾门处结扎左肾动、静脉及输尿管,并切除受体左肾。用10-0无损伤缝线将供体肾和受体肾的同名肾动、静脉做端端吻合。血流恢复后,移植肾颜色逐渐转为红润,明亮,肾静脉充盈,肾动脉搏动明显,5-10min左右可见输尿管蠕动,表明模型构建成功。2.4、移植后处理：予肌注抗生素,视情况予以补液,注意保温。3、靶向超声分子成像实验分为两组,分别为接受肾移植术72h后的SD大鼠移植肾脏（肾移植组,n=10）与未经过任何处理SD大鼠右侧肾脏（对照组,n=10）。对肾移植组及对照组SD大鼠行二维、彩色多普勒及对比超声检查。超声造影时两组分别注入靶向超声微泡（MBI）和对照超声微泡（MB）。SD大鼠俯卧位,用支架固定Sequoia512超声机（Siemens,美国）的高频超声探头（17L5）于大鼠移植肾脏上方,调整探头位置获得良好肾脏显像后保持在整个实验过程中不变,仪器的各项参数在整个实验过程中不变。CEU检查均采用相干脉冲序列成像技术（Coherent Pulse Sequence, CPS）实时观察,探头发射频率为7.0MHZ,机械指数为0.2。每只大鼠采用微量进样器经尾静脉随机（间隔30min）先后注射MB和MBI的数量约为1×109个。在注入微泡3min后行CEU检查,获取第一帧图像后继续存储图像2-3帧后给予高MI的连续超声发射2-3s以破坏微泡,继续存储本底图像2-3帧,全部声学造影视频存于CD盘,以备脱机分析。微泡破坏前存储图像的平均声强度（Video Intensity, VI）可代表靶向超声微泡在组织中的总浓度,包括粘附和循环微泡。微泡破坏后存储图像上的平均VI代表的是在血池中循环微泡的浓度。前者减去后者得到的是粘附微泡在组织中的浓度。取图结束后,应用CEU图像分析软件（Virginia大学,美国）对图像进行分析,测量大鼠移植肾组及对照组肾脏造影VI值,单位为灰阶强度（U）；并用彩色编码技术制作肾脏显影的彩色编码图像,采用红色、橙色和白色依次代表显影强度由弱到强。4、肾脏病理学检查：CEU图像采集后。取出大鼠肾脏,10%甲醛固定。常规脱水、石蜡包埋制片。切片作苏木素一伊红（HE）染色和免疫组化检查。5、统计学处理：采用SPSS13.0软件包进行数据分析,计数资料用X±S表示,各组不同时间点结合微泡个数比较用重复测量的方差分析,各时间点内两组间单独效应比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行分析；动物实验组间比较采用两样本t检验,组内比较采用二阶段交叉设计方差分析,P<0.05为差异有显着性意义。结果：1、MBI构建及制备效果的体外评价1.1、MBI制备及理化性质鉴定采用声振法制备MB及MBI在显微镜下观察均为透亮微气泡,库尔特计数仪检测MB平均直径为2.86μm,浓度为1.7×109个/ml, MBI平均直径为2.71μm,浓度为1.5×109个/ml。1.2、MBI制备效果体外评价：1.2.1、荧光标记法评价抗体连接情况采用绿色荧光标记的二抗与抗大鼠ICAM-1单抗结合,荧光显微镜下显示MBI外壳显明显绿色荧光,表明抗ICAM-1单抗与微泡外壳连接良好1.2.2、平行板流动腔体外评价MBI靶向粘附效能平行板流动腔体外评价结果显示,在模拟微血管生理血流条件的剪切应力（0.5dyn/cm2）下MBI可与包被于平行板流动腔的ICAM-1抗原有效结合,MBI结合数量随着时间延长而不断增加,显示了良好的主动性靶向黏附效能。普通对照微泡结合数量同样随着时间延长而增加但同靶向超声微泡相比其结合数量显着降低,两者差异显着（F=420.116,P=0.000）。1.2.3、经外周静脉注射超声微泡MBI或MB,在大鼠肾脏中均可获得满意的声学造影效果。2、靶向超声分子成像2.1、二维超声及CEU检查结果：二维超声提示移植肾稍增大,形态稍饱满,肾皮质彩色血流信号略减少,对照组肾脏形态、大小正常,血流信号正常；移植肾及对照组肾在注入靶向超声微泡后均可见肾脏区域明显灌注显影,在延迟3min显象后第一帧CEU图像显示移植肾-MBI组可见显着的超声显影增强。而移植肾-MB组仅见轻度的超声显影增强,其显影强度较前者明显减弱；而对照-MBI组及对照-MB组延迟3min显象后,右侧肾脏均未见明显显影增强。2.2、对比超声V1分析：移植肾-MBI组和移植肾-MB组VI值分别为（27.0±7.4）U、（10.2±2.4）U,前者同后者相比VI值增大,两者之间具有显着性差异（F=64.744,P=0.000）。对照-MBI组及对照-MB组VI值分别为（7.7±2.2）U、（6.5±1.0）U,两者之间差异无统计学意义（F＝2.868,P=0.129）。移植肾-MBI组VI值分别为对照-MBI组及对照-MB组VI值的（3.7±1.3）倍（t＝7.907,P=0.000）、（4.2±1.2）倍（t＝8.661,P=0.000）,两者之间具有显着差异。而移植肾-MB组VI值同对照-MBI组及对照-MB组相比,两者之间具有显着差异（t=2.423,P=0.026；t=4.417,P=0.001）,但仅分别为后两者（1.4±0.4）倍、（1.6±0.6）倍。3、肾脏病理检查结果：移植肾组织中可见肾小管上皮细胞肿胀、变性,内可见管型和坏死脱落细胞,伴肾间质水肿及中性粒细胞增多；对照组肾脏组织中肾小管排列整齐,形态正常,间质无充血、水肿。4、免疫组化检查：移植肾组织肾小球微血管内皮表面、肾小管上皮ICAM-1（棕黄色阳性反应物,箭头处）表达明显增加；而对照组肾组织血管内皮表面未见明显的ICAM-1表达。结论：1、平行板流动腔实验证实采用生物素-亲和素桥连方式制备出的携带ICAM-1靶向超声微泡随着时间的推移粘附数量不断地增加,提示其靶向粘附能力良好,可以用来评价病变组织的血管内皮炎症。2、采用供肾血管与受体同名血管作端端吻合,大大减少了对受体循环系统的影响,保证了良好的术后生存期,为实验的进一步进行建立坚实基础。3、应用携带抗ICAM-1单抗靶向超声微泡行对比超声检查可有效评价大鼠移植肾AR,提示将有望为临床提供一种早期、敏感、无创的检测移植肾AR的手段。

杨浩^[6]（2011）在《Fcgr3B基因拷贝数多态性与肾移植术后急性排斥反应相关性的研究及其机制的初步探讨》文中研究指明前言肾脏移植自从60年代在世界范围内开展以来,因其与透析相比,所受的限制更少,生活的质量更高,一直是终末期肾脏病（ESRD）患者肾脏替代治疗的最佳选择。自从各种免疫抑制剂在临床上的应用,使得移植肾的短期及长期存活率均得到较大的改善。但是移植术后急性排斥反应一直是移植物的长期存活的一道障碍。急性排斥反应的发生机制具有很大的复杂性,有众多因素影响了急性排斥反应的发生,如群体反应性抗体（PRA）,冷热缺血时间,HLA错配以及新近发现的MICA （MHC-I类分子相关相关抗原A）抗体等均是影响移植术后急性排斥反应的发生的重要因素。但是,即使在上述影响素相同的个体中,急性排斥反应发生及移植物的存活仍然存在很大的差别。因此,寻找其他潜在影响急性排斥反应发生的机制,从而改善移植物的存活,一直是移植界学者所追求的目标。基因多态性与肾移植急性排斥反应关系的研究一直都是学术界的热点,但以往的基因多态性研究都是以单核苷酸多态性（SNP）为切入点,例如血小板特异性抗原基因,趋化因子基因等。近年来,基因拷贝数多态性（CNV）的发现使得我们对基因多态性这一现象有了新的更深入的认识,个体之间的基因差异不再只是几个核苷酸碱基的差别,而可能是一整段具有完整功能的基因甚至更长核苷酸片段的差别。现在,大量的基因拷贝数多态性被发现,并且有相当大一部分CNV与疾病易感性有着密切联系,例如神经功能相关的EFNA5, GLUR7, CACNG2及AKAP5基因拷贝数多态性,免疫功能相关的CCL3,CCL4的基因拷贝数多态性等。在2006年Nature杂志上曾报道,Fcgr3B基因拷贝数多态性与系统性红斑狼疮（SLE）及狼疮肾炎（LN）的发病密切相关。移植术后急性排斥反应与SLE及许多自身免疫性疾病在发病机理上有众多相似之处,且Fcgr3B基因对应的蛋白产物FcγⅢB受体在人类主要表达在中性粒细胞表面,而中性粒细胞在移植肾急性排斥活检标本中是一种非常常见炎症浸润细胞。这一系列的关系,使我们联想到Fcgr3B基因拷贝数多态性可能与肾移植术后急性排斥反应的发生有关。本研究中,我们探讨了Fcgr3B基因拷贝数多态性与肾移植术后急性排斥反应的相关性并对其相关机制进行了初步的探讨。第一部分Fcgr3B基因拷贝数多态性与肾移植术后急性排斥反应相关性的研究目的每年终末期肾病（ESRD）患者以7%-8%的比例增加,而肾脏移植是治疗ESRD的最佳选择。随着新型免疫抑制剂的临床应用,急性排斥发生率明显下降,移植物短期存活率明显提高,但10年存活率在活体及尸体肾移植仍较较低。排斥反应仍是肾移植成功的最大障碍。近来许多研究表明Fcgr3B基因拷贝数多态性与自身免疫性疾病的发生存在密切关系,即低Fcgr3B拷贝数个体容易患狼疮性肾炎,小血管炎等疾病。而在临床上,许多自身免疫性疾病与肾移植后排异的发生具有相似的免疫基础背景。由此,本研究旨在探明Fcgr3B基因拷贝数变异是否与肾移植急性排斥反应存在相关性。方法提取1027例肾移植受者及450例健康人外周血DNA,以Fcgr3B为2拷贝的DNA样本为标准品,实时荧光定量PCR标准曲线法检测他们的Fcgr3B基因拷贝数,Sothern Bolt法验证拷贝数结果。比较肾移植受者及健康人群、肾移植术后移植肾功能稳定者及急性排斥者、急性排斥者不同病理类型之间的Fcgr3B基因拷贝数差异。结果在中国汉族人群中,Fcgr3B基因拷贝数频数分布与高加索人群类似,其中肾移植受者中0,1,2,3拷贝的频数分别为5.1%,50.2%,38.1%及5.6%；健康人群0,1,2,3拷贝的频数分别为2.4%,39%,47.3及6.9%。按照最多见的2拷贝为界,<2拷贝的归为低拷贝组,≥2拷贝的归为高拷贝组,健康人群低拷贝数个体频数明显低于肾移植受者（P<0.0001,卡方值22.921,95%可信区间：1.378-2.158）。而在移植肾受者中,移植肾功能稳定者0,1,2,3拷贝的频数分别为4.3%,48.9%,40.0%,5.6%；急性排斥者0,1,2,3拷贝的频数分别为7.9%,55.0%,31.4%,5.2%。急性排斥者低拷贝数个体频数明显高于移植肾功能稳定者（P=0.009,卡方值6.842,95%可信区间：0.495-0.905）。按照Banff标准将移植肾急性排斥组分为急性体液性排斥组（C4d+）,急性细胞性排斥组及临界改变组,就体液性排斥反应而言,其在低拷贝排斥着与高拷贝排斥着中的比例分别为19.4%和21.2%,没有显着差异（P=0.752）。结论中国汉族人群中Fcgr3B基因低拷贝变异（<2拷贝）个体更易发生终末期肾脏病且低拷贝个体在肾移植术后急性排斥反应的发生率升高。第二部分Fcgr3B基因拷贝数变异对肾移植受者中性粒细胞功能的影响目的Fcgr3B基因对应的蛋白产物FcγRⅢB是低亲和力IgG受体中的一员,它通过糖基磷脂酰肌醇基序（GPI）锚定于细胞膜表面,但是并不具有胞内段。FcγRⅢB受体只在人类表达,且主要存在与中性粒细胞膜表面。目前认为,FcγRⅢB受体的主要功能是清除免疫复合物。而拷贝数变化可以通过剂量效应,空间位阻效应以及影响调控元件等多种方式影响表型。本部分研究的目的就是要找出Fcgr3B基因拷贝数变异影响表型改变的机制及其对不同拷贝数个体中性粒细胞功能所产生的影响。方法按照拷贝数分布比例选取高、低拷贝移植肾功能稳定的肾移植受者各15例,其中低拷贝组0拷贝4例,1拷贝11例,高拷贝组2拷贝9例,3拷贝5例,4拷贝1例。采用中性粒细胞分离液分离各拷贝数受者的中性粒细胞。我们应用流式方法,检测了不同拷贝数肾移植受者中性粒细胞表面FcγⅢB受体表达量。接下来我们还应用无菌性的免疫微珠及可溶性免疫复合物与中性粒细胞作用后,流式细胞仪检测不同拷贝数个体中性粒细胞吞噬功能及呼吸爆发功能（检测H202产量）。另外,对于中性粒细胞的趋化功能,我们采用的是Transwell趋化小室实验,以IL-8趋化不同拷贝数中性粒细胞,观察他们趋化能力的差别。考虑到基因拷贝数变异可能对自身及其邻近的基因表达产生影响,我们还利用实时定量PCR方法对不同拷贝数肾移植受者的Fcgr3B、Fcgr2A及Fcgr2B基因mRNA表达进行了检测。结果我们的实验分离的中性粒细胞,其纯度和存活率均在95%以上。FcγⅢB受体在低拷贝肾移植受者中表达量明显低于高拷贝者（中性粒细胞膜表面CD16bFITC平均荧光强度分别为5.61+0.54及12.59+1.33（Mean±EM）,P<0.0001）。而在对免疫微珠的吞噬、呼吸爆发以及趋化能力方面,不同拷贝数肾移植受者的中性粒细胞间没有明显差别。在Fcgr3B及Fcgr2A、Fcgr2B基因mRNA表达上,我们发现,拷贝数高低同Fcgr3B mRNA表达量相关,高拷贝者mRNA表达量明显高于低拷贝者（P<0.0001）。而Fcgr2A基因mRNA表达水平正好相反,低拷贝组则明显高于高拷贝组（P=0.0004）。Fcgr2B基因mRNA表达水平两组间无明显差别（P=0.1026）结论Fcgr3B基因拷贝数变异同其mRNA表达及相应蛋白产物—FcγⅢB受体表达呈正相关,即Fcgr3B对表性的影响可能是一种剂量效应。而这一表型的改变并不影响肾移植受者中性粒细胞吞噬、呼吸爆发、及趋化这三种基本的非特异性免疫功能。第三部分Fcgr3B基因拷贝数变异与肾移植受者急性排斥反应关系机理的初步研究目的在我们前期的研究中,我们发现了低拷贝Fcgr3B的肾移植受者更容易发生急性排斥反应。而中性粒细胞作为数量最为庞大的非特异性免疫细胞,常常被发现在肾移植急性排斥者的移植肾中浸润。目前的研究越来越多的表明,中性粒细胞与移植物急性排斥反应有着密不可分的关系。中性粒细胞能够分泌多种趋化因子和细胞因子,对T、B淋巴细胞有非常强的趋化和激活的作用,从而间接加速了急性排斥反应的发生。要寻找中性粒细胞表面FcγⅢB受体的基因拷贝数多态性与急性排斥反应内在联系的内在机理,我们决定从中性粒细胞在移植排斥中与T、B淋巴细胞的关系,以及中性粒细胞在移植排斥反应中非特异性炎症因子的变化发面入手,研究FcγⅢB受体在这些变化中所扮演的角色,从而找出为什么Fcgr3B低拷贝数肾移植受者易发生急性排斥反应。方法继续针对第二部分的研究对象,我们利用IFN-γ+TNF-α与不同拷贝数肾移植受者中性粒细胞培养12小时,以刺激中性粒细胞表达IP-10, Mig, I-TAC, Blys等T、B细胞的趋化因子和激活因子,采用Real-Time实时荧光定量PCR方法观察各种因子的表达在不同拷贝数间是否存在差异。同时,我们还检测了在IFN-γ+TNF-α刺激后其他非特异性炎症因子（CXCL1、CXCL2、MAC-1、IL-8）的表达在高低拷贝数受者间的差异。此外,我们从高地拷贝组中选取了1拷贝和3拷贝肾移植受者各5例,应用PI-PLC水解中性粒细胞膜表面FcγⅢB受体,抗CD16b单克隆抗体交联FcγⅢB受体两种方法,减弱和增强FcγⅢB受体的功能后检测了IP-10, Mig, I-TAC mRNA表达在增强或者减弱前后的变化。结果不同拷贝数肾移植受者中性粒细胞在接受IFN-γ+TNF-α刺激12小时后,上述细胞因子和趋化因子的表达均有不同程度的升高。而其中IP-10, Mig, I-TAC这三种T细胞相关趋化因子在低拷贝受者中上升的幅度明显高于高拷贝受者上升的幅度（P值分别为0.0211,0.0321,0.0183）。而B细胞活化因子BLys,粘附分子CXCLl、CXCL2、MAC-1及趋化因子IL-8在高低拷贝组间没有明显差异。而在PI-PLC水解中性粒细胞膜表面FcγⅢB受体后,中性粒细胞膜表面FcγⅢB受体表达随着PI-PLC浓度的升高而逐渐降低,而上述三种T细胞相关的趋化因子随着PI-PLC浓度的升高而升高。在抗CD16b单克隆抗体与中性粒细胞膜表面FcγⅢB受体结合后,三种趋化因子的表达较结合前都有所下降,其中,在低拷贝组中,Mig的表达及I-TAC的表达在抗体结合后下降达到统计学差异(P值分别为0.0434及P=0.0457,而高拷贝组中,IP-10的表达在抗体结合后下降达到统计学差异（P=0.0376）结论Fcgr3B基因拷贝数变异影响了T细胞相关的趋化因子IP-10、Mig及I-TAC的mRNA表达,即低拷贝者表达高于高拷贝者,从而间接地影响了肾移植术后不同拷贝数个体中性粒细胞对T细胞的趋化能力,造成了Fcgr3B基因低拷贝者在肾移植术后更易发生急性排斥反应发。

都兴华^[7]（2010）在《大鼠肾移植急性排斥反应模型中移植肾CD44的表达及意义》文中认为目的：本研究通过建立大鼠肾移植急性排斥反应模型主要探讨移植肾组织CD44的表达与急性排斥反应的关系。方法：1、雄性Wistar大鼠20对,3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,采用原位低温灌注切取供肾,受者切除双肾,利用显微外科技术供受体主动脉端侧吻合、下腔静脉带硬膜外麻醉管做内支架行端侧吻合、输尿管带膀胱瓣吻合进行大鼠肾移植手术建立大鼠肾移植模型。2、雄性Wistar大鼠60只,雄性SD大鼠30只。共分为四组,正常雄性Wistar大鼠肾脏为正常对照组（control组）；Wistar大鼠为供受者建立同系基因对照组（sTX组）；SD大鼠为供者,Wistar大鼠为受者建立同种异体基因移植组（aTX组）；SD大鼠为供者,Wistar大鼠为受者,术后给予环孢素A（CsA）免疫抑制建立同种异体基因移植免疫抑制组（aTX+CsA组）。根据Banff急性排斥反应指数比较移植术后5、7天各组间AR半定量评分,免疫组织化学染色法检测移植肾组织CD44分子的表达,并测定各组术后5、7天血清肌酐（SCr）。比较移植肾组织CD44分子与移植肾急性排斥反应、Banff指数以及SCr水平之间的相关性。结果：1、肾血流再通后肾脏立即充盈转为鲜红色,肾动脉充盈搏动良好,移植肾在3～5min开始泌尿；手术时间为（130±20）min,热缺血时间<10s,冷缺血时间<50min；手术成功率为82%。2、AR半定量评分术后5和7天各组比较差异均有统计学意义（H=16.63,P=0.001）,（H=17.37,P=0.001）。术后第5、7天aTX组AR半定量评分,与control组、sTX组及aTX+CsA组比较均明显升高（均P<0.05）。术后5、7天移植肾组织CD44分子的表达在aTX组显着高于control组及aTX+CsA组（均P<0.05）；术后第5、7天aTX组SCr明显高于control组、sTX组及aTX+CsA组（均P<0.01）；移植肾组织CD44分子的表达与急性排斥反应及SCr水平呈正相关（r=0.431,P<0.01,n=36）（r=0.458,P<0.01,n=36）；发生急性排斥反应的移植肾组织CD44分子的表达与Banff急性排斥反应指数无相关性（r=0.403,P>0.05,n=14）。结论：1、Wistar大鼠为供受者肾移植后,急性排斥反应出现晚,排斥程度轻微,可以作为急性排斥模型的对照组；SD大鼠为供者,Wistar大鼠为受者建立移植模型可以作为大鼠肾移植急性排斥模型。2、CD44分子与大鼠肾移植急性排斥反应的发生及SCr水平呈正相关性,为进一步提高移植排斥反应防治水平提供理论依据。

杨伟锋^[8]（2010）在《CD44分子与同种异体肾移植急性排斥反应的研究》文中指出目的1建立大鼠肾移植急性排斥反应模型,为研究急性排斥反应早期诊断及治疗提供实验动物模型。2了解大鼠移植肾急性排斥反应病理变化规律,了解CD44在大鼠移植肾的表达情况,探讨可溶性CD44分子在肾移植急性排斥反应大鼠外周血的表达情况。3收集临床病例,探讨CD44在排斥反应患者移植肾组织的表达,CD44在患者外周血的表达规律。方法1建立大鼠肾移植急性排斥反应模型SPF（清洁级）健康大鼠,由南方医科大学实验动物中心提供,动物实验遵守国家卫生部及南方医科大学动物条例,供体为wistar大鼠,体重300-350克,雌雄不限,SD雄性大鼠为受体,体重300-350克；供体麻醉后,经腹取双肾及足够长的腹主动脉和后腔静脉,置于0℃-4℃林格液中修整,结扎右肾动、静脉,切除右肾,剪去多余的脂肪组织,修整腹主动脉、后腔静脉；受体大鼠麻醉,开腹先切除受体大鼠原肾,移植肾置入,供体的腹主动脉和后腔静脉与受体的腹主动脉和后腔静脉端侧吻合,供体膀胱修剪为膀胱瓣,在受体膀胱上剪一直径3mm的切口,无损伤缝合线间断缝合,清点器械及辅料,依次关闭切口；手术后受体大鼠保温2小时至完全清醒活动,放入清洁笼内单笼饲养,当天禁食,给予5%葡萄糖盐水饮用,手术后第一天开始给予食物,术后观察精神状态、活动情况、饮食情况、体重增减、大便性状等。2 CD44在移植肾急性排斥反应大鼠中的表达同上建立大鼠肾移植急性排斥反应模型,实验动物分为排斥组（AR）、无排斥对照组（control）、正常组（normal）每组10只,分别于手术后3天、5天、7天、9天、14天各时间点,于移植肾的下极尖刀片切取小块肾组织,移植肾创面止血纱布压迫止血,关闭切口,肌注青霉素抗感染,常规病理染色观察移植肾大鼠急性排斥反应变化；于术后3天,5天,7天,9天,14天各时间点,断尾法采外周静脉血,纳入实验的正常组大鼠从实验开始第3天、5天、7天、9天、14天各时间点断尾法采外周静脉血,酶联免疫吸附法检测外周血可溶性CD44分子的表达（ELISA法）。3 CD44在肾移植患者急性排斥反应中的表达收集临床病例,此部分病例资料分3部分,各部分间有重复。第一部分从临床疑似急性排斥反应的患者中抽出28例行穿刺病理活检证实为移植肾急性排斥反应,另取28例慢性排斥反应移植肾失功而行移植肾切除的患者和28例正常肾组织,实验共分急性排斥反应组（AR）、慢性排斥反应组（CR）和正常组（normal）行免疫组织化学检测CD44在各实验组织中的表达；第二部分患者为2007-2009年间在暨南大学附属第一医院接受肾移植手术患者,13例行穿刺病理活检证实为移植肾急性排斥反应,分为急性排斥反应组（AR）和稳定组（stable）,分别于患者移植前及移植后的第1天、3天、5天、7天、9天、14天各时间点,留取外周静脉血标本ELISA法检测CD44分子在排斥反应患者及稳定患者外周血表达浓度及配体透明质酸（HA）的表达浓度,取患者移植前外周血2ml流式细胞仪检测CD4+T、CD8+T淋巴细胞表面表达CD44情况；第三部分2007年以前行肾移植手术,2007-2009年间在暨南大学附属第一医院接受回访的患者,此部分患者有15例被穿刺活检病理确诊为急性排斥反应,分别于患者治疗前、后留取血标本ELISA法检测CD44分子外周血清表达浓度及配体透明质酸（HA）的表达浓度,流式细胞仪检测治疗前、后CD8+T淋巴细胞表面表达CD44情况；分别取13例和15例与上述两种患者同期手术的稳定患者,另外相应随机抽取13例和15例健康献血者静脉血标本检测相应指标作为正常参考值。结果1大鼠肾移植模型的建立用8个月时间进行急性排斥反应大鼠模型建立的实验研究,前3个月主要用来探索血管分离、供肾的原位灌注、血管吻合技术,共对50只大鼠进行肾移植术,这一阶段受鼠死亡率高,大多在术中或术后3-48 h内死亡,正式实验后,共对100只大鼠进行肾移植术,供受、体各50只,成功建立大鼠移植模型,30只大鼠存活超过2天,手术成功率60%（30/50）,总手术时间为（130±20）min,供肾切取（40±5）min,受体血管游离（15±5）min,肾静脉吻合时间（25±5）min,动脉吻合时间为（20±5）分钟,膀胱吻合（8±2）min；近期并发症主要休克、腹腔内脏器损伤出血、吻合口出血、下腔静脉或动脉吻合口狭窄、下腔静脉或动脉吻合口血栓形成、肾蒂扭转等,远期并发症有淋巴瘘、尿瘘、膀胱吻合口狭窄等。2大鼠移植肾急性排斥反应病理变化术后第3天病理报告显示,两实验组肾小管结构、形态基本正常,排斥组部分大鼠肾组织间质有轻度小范围的淋巴细胞浸润,个别肾小管内有炎症细胞浸润,动脉未出现内膜炎,病理评分2分左右,对照组少量大鼠肾组织间质淋巴细胞浸润,浸润范围没有排斥组大,肾小管及动脉血管未见异常,病理评分1；排斥组在随后的病理发展过程中,肾组织间质被淋巴细胞浸润大鼠的数量增加,浸润范围扩大,被淋巴细胞浸润的肾小管比例增加,移植肾淋巴细胞浸润累及微血管,形成动脉内膜炎,并最终导致透壁性纤维素样动脉内膜炎,血管管腔狭窄,病理评分升高,对照组大鼠在移植后5天左右出现间质被淋巴细胞浸润,此后随时间的推移,炎症细胞浸润减少,无动脉内膜炎和透壁性纤维素样动脉内膜炎,两组间病理评分比较差异有统计学意义。3 CD44在大鼠移植肾组织的表达移植后第3天标本,在10例急性排斥反应肾组织中,有4例CD44呈阳性表达,阳性率为40%,阳性标本的CD44分子主要表达于肾小管、集合管、间质及其周围渗出的炎性细胞,对照组肾组织中,有3例阳性表达,阳性率为30%,表达范围为局灶性分布,正常大鼠肾脏弱阳性为2例,阳性率为20%；随时间的推移,急性排斥大鼠移植肾组织CD44表达阳性率增加,第14天时阳性率增高到90%,表达强度增强,表达范围扩大,对照组肾组织中CD44表达阳性率最高位60%,第14天时下降为30%,正常肾组织中CD44表达阳性率20%。4大鼠sCD44、HA的表达水平及比较排斥组sCD44血液中的表达水平随时间的增加而快速增加,对照组也随时间的增加而缓慢增加,正常组基本没有变化；sCD44表达水平重复测量数据方差分析显示,三组大鼠sCD44血液中的表达有显着性差异,5个时间点sCD44血液中的表达差异有显着统计学意义；HA的表达水平与sCD44有类似走势。5 CD44在人移植肾组织的表达在28例急性排斥反应肾组织中,有21例CD44呈阳性表达,阳性率为75%,其中强阳性表达6例,占总病例数的21.43%,中等阳性为7例,占总病例数的25%,弱阳性为8例,占总病例数的28.57%,CD44分子主要表达位于肾小管、集合管、间质及其周围渗出的炎性细胞；28例慢性排斥反应肾组织中,CD44表达阳性率为46.43%,表达范围为局灶性分布；28例正常肾脏组织中CD44表达阳性率为32.14%。对三组数据进行x2检验,CD44在三组中的表达差异有统计学意义。6围手术期患者移植前sCD44、HA及Cr水平排斥组患者移植前受者血清中sCD44水平为597.69±24.62 ng/ml,稳定组患者移植前受者血清中sCD44水平为573.08±13.03ng/ml,正常组的sCD44水平269.31±50.86ng/ml,经单因素方差分析,排斥组与稳定组相比较差异有统计学意义,正常组与排斥组和稳定组比差异均有统计学意义。排斥组血清HA水平为428.30±23.03ng/ml,稳定组血清HA水平为420.62±13.87ng/ml,正常对照组血清HA水平为66.77±9.10ng/ml;经单因素方差分析,排斥组与稳定组相比较差异无统计学意义,正常组与排斥组和稳定组比差异均有统计学意义。排斥组血清Cr水平为854.77±89.28ng/ml,稳定组血清Cr水平为838.15±66.07ng/ml,正常对照组血清Cr水平为65.08±15.67ng/ml；经单因素方差分析,排斥组与稳定组相比较差异无统计学意义,正常组与排斥组和稳定组比差异均有统计学意义。7围手术期患者移植后sCD44、HA及血Cr水平排斥组移植后前3天sCD44下降趋势不明显,3天后开始sCD44水平快速升高,第6-7天达高峰值844.23 ng/ml,急性排斥反应扭转后sCD44水平开始下降,第14天下降到413.30±26.02ng/ml,仍然高于稳定组；稳定组sCD44水平较移植前呈大致降低趋势,从术前的575.13±27.66ng/ml下降到第14天的413.30±26.02ng/ml,第14天排斥组和稳定组sCD44浓度仍高于正常人组的241.67±41.27ng/ml；排斥组和稳定组sCD44表达水平重复测量数据方差分析显示,排斥组与稳定组比较差异有显着统计学意义,6个时间点sCD44血液中的表达差异有显着统计学意义；HA及Cr的表达水平与sCD44有类似。对排斥组sCD44与HA和Cr之间进行相关分析,排斥组术后外周血sCD44与外周血Cr经相关分析r=0.619,p=0.024,两者呈正相关关系；排斥组术后外周血sCD44与外周血HA经相关分析r=0.731,p=0.005,两者呈显着正相关关系。8回访患者治疗前后外周血sCD44、HA及Cr水平排斥组发生排斥反应时血sCD44水平为841.85±43.71ng/ml,治疗后354.12±58.33ng/ml,稳定组为224.57±17.60ng/ml,治疗后sCD44水平接近稳定组,对sCD44表达水平进行t检验分析,治疗疗前、后与稳定组三者之间相互比较sCD44表达水平差异均有有统计学意义。HA及Cr均呈现类似现象。9移植术前T淋巴细胞表达CD44水平急性排斥组CD8+CD44+T淋巴细胞百分比为8.75±1.01,稳定组CD8+CD44+T淋巴细胞百分比为9.73±0.61,排斥组较稳定组低,经独立样本t检验,两者相比较差异极显着,有统计学意义（P<0.01）；急性排斥组CD4+T/CD8+T淋巴细胞计数比值为1.32±0.25,稳定组CD4+T/CD8+T淋巴细胞计数比值为1.23±0.14,排斥组较稳定组高,经独立样本t检验,两者相比较差异无统计学意义（P>0.05）；急性排斥组CD4+T百分比40.76±4.67,较稳定组的37.74±4.76高,经独立样本t检验,两者相比较差异无统计学意义（P>0.05）；急性排斥组CD44+T百分比19.34±2.14,较稳定组的21.55±1.94低,独立样本t检验,两者相比较差异极显着,有统计学意义（P<0.01）；CD8+T、CD4+CD44+T两组见比较差异均无统计学意义。排斥组术前外周血CD8+CD44+T百分比与术前外周血sCD44经相关分析r=-0.912,p=0.000,两者呈显着负相关关系；排斥组术前外周血CD8+CD44+T百分比与术前外周血HA经相关分析r=-0.697,p=0.008,两者显着负无相关；排斥组术前外周血CD8+CD44+T百分比与术前外周血Cr经相关分析r=0.205,p=0.501,两者无相关。10回访患者治疗前后CD8+CD44+T的变化排斥组发生排斥反应时外周血CD8+T百分比为30.46±1.64,治疗后为29.06±1.62,稳定组为29.78±1.62,对CD8+T百分比进行t检验分析,治疗前、后与稳定组CD8+T百分比三者之间相互比较差异无统计学意义。排斥组发生排斥反应时外周血CD8+CD44+T百分比为8.47±0.46,治疗后为9.77±0.60,稳定组为9.78±0.61,对CD8+CD44+T百分比进行t检验分析,治疗前后CD8+CD44+T百分比差异有显着统计学意义,治疗前与稳定组CD8+CD44+T百分比差异有显着统计学意义,治疗后与稳定组CD8+CD44+T百分比差异无统计学意义。结论1本实验在已有的实验术式基础上,经过技术改进,成功地构建了大鼠肾移植急性排斥反应模型,为下一步实验研究提供了必要条件。2通过实验研究显示Wistar→SD大鼠组合建立的肾移植急性排斥反应模型,移植肾术后出现明显的排斥反应,无免疫耐受出现,无大鼠长期存活纪录,Wistar→SD大鼠组合可以用来建立急性排斥反应模型；Wistar→Wistar大鼠肾移植后,排斥程度轻微,Wistar→Wistar大鼠可以作为大鼠肾移植急性排斥模型的无排斥对照组。3本研究证实CD44分子在大鼠急性排斥移植肾组织中表达增强,与无排斥对照组及正常肾组织相比较,差异有统计学意义。4通过本实验得出结论可溶性CD44分子及其配体透明质酸在移植肾大鼠血液中表达明显增高,而对照组无表达或表达低。5CD44分子在人急性排斥肾组织中表达增高,高于慢性排斥反应肾组织和正常肾组织。6患者移植术前sCD44表达水平高于稳定组,而术前外周血CD8+CD44+T百分比、CD44+T百分比低于稳定组。7移植术后急性排斥反应发生前外周血sCD44和HA表达升高,急性排斥反应逆转后sCD44和HA表达水平下降。8急性排斥反应发生前外周血CD8+CD44+T百分比降低,急性排斥反应逆转后CD8+CD44+T百分比升高。9 CD44分子与其配体透明质酸相互作用参与了实验性急性排斥反应的病理进展,CD44分子与急性排斥反应的关系密切,但具体作用机制需进一步研究。

卢彩宝^[9]（2008）在《AT1R自身抗体介导血管性排斥反应的作用机制研究》文中进行了进一步梳理肾脏移植是临床根治慢性终末期肾病的有效方法,随着配型技术和免疫抑制剂的进步,移植后急性排斥反应发生率降低,短期存活率大幅提高。但是移植后发生一定比例的急性排斥反应（acute rejection, AR）仍然是肾移植术后的主要并发症之一,也是导致慢性排斥反应（chronic rejection, CR）和移植肾失功的重要危险因素。同种异体肾移植术后发生排斥反应主要有两种机制,一是抗体介导的体液免疫,二是T细胞介导的细胞免疫,两种理论的根本区别在于移植物的损害是由抗体的活动所造成,还是直接的细胞毒作用,即由T细胞、NK细胞等细胞毒或迟发性超敏反应所造成的。如果受者体内存在或出现针对供者特异性的抗体,通常称为急性体液性排斥反应（acute humoral rejection,AHR）或血管性排斥反应,体液性排斥反应导致移植物失功仍是临床治疗中的难题。2001年,第六届Banff肾移植病理会议正式将同种异型抗体介导的肾移植排斥反应的病理诊断补充入Banff国际分型标准,急性抗体介导的移植肾排斥反应诊断标准包括3个基本特点:急性组织损伤的形态学证据;抗体作用的免疫病理学证据（如肾小管周围毛细血管C4d沉积）;循环供体特异性HLA抗体或其他供体内皮细胞抗原特异性抗体的血清学证据。Colvin将抗体引起的移植物损伤进一步分为四种类型:超急性排斥反应、急性排斥反应、慢性排斥反应和无临床症状的适应状态。介导体液性排斥反应的抗体多为HLA抗体,我们临床检测多可以避免这种排斥反应,但那些未知抗体目前还没有引起足够的重视,虽然发生几率不高,但一旦发生,尚无特异治疗手段。因此,鉴别这些非抗HLA抗体并阐明其作用机制,对体液排斥反应的有效治疗显得非常重要。非HLA抗体包括抗MICA抗体、抗MICB抗体、抗内皮细胞抗体和新近发现的抗血管紧张素Ⅱ1型受体自身抗体（Autoantibodies against the angiotensinⅡtype 1 receptor, AT1-AA）等。AT1-AA于1999年在先兆子痫患者中发现的,直到2005年Dragun等才发现在发生顽固性血管性排斥反应的患者中存在AT1-AA,并认为AT1-AA在介导血管性排斥反应中起重要作用。为证明AT1-AA可引起血管性排斥反应,Dragun等将含有人AT1-AA的血清注射到肾移植大鼠。实验使用Fischer344-Lewis肾移植模型,移植后一周,移植肾显示动脉内膜炎和血管内浸润。但该实验采用人血清,并且不是纯化的抗体,不能完全排除存在异种抗原抗体反应的可能性,因此,我们认为需要采用大鼠源性AT1-AA针对大鼠进行实验,才能更直接阐明AT1-AA对移植肾脏的损伤作用。Dragun等报道的16例AT1-AA引起的血管性排斥反应患者中只有5例C4d阳性,说明其排斥进程与HLA抗体介导的血管性排斥反应有所区别。我们推测AT1-AA介导的血管性排斥反应机制并非如HLA抗体那样结合细胞表面抗原后激活补体导致细胞的损伤,其可能的机制是与靶细胞表面的AT1R结合后启动细胞内信号转导机制,促进细胞的增殖或凋亡。为验证以上假设,我们将观察内皮细胞（endothelial cell, EC）受到AT1-AA刺激后的功能改变,细胞间粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1）作为急性排斥反应和内皮激活的重要指标将作为检测对象。体液性排斥反应学说认为EC是抗体作用的最初靶点。血管内皮细胞在血液和组织液间有广泛的联系和物质交换,不仅具有选择性通透性、抗血栓性、血管紧张调节、毛细血管形成、产生细胞因子、粘附因子及抗肿瘤活性等功能。细胞间粘附分子-1是免疫球蛋白超家族中的一员,文献报道急性排斥反应时,肾小管上皮细胞和肾血管内皮细胞上ICAM-1表达明显增加,且肾小管上皮细胞上ICAM-1的表达与排斥的严重性呈正相关。ICAM-1不仅是急性排斥反应的始动因素,而且在免疫应答和移植物的排斥反应中发挥重要作用。AT1-AA是否会刺激内皮细胞增殖,导致ICAM-1的合成与分泌增加从而加重或启动血管性排斥反应尚无相关研究报道。本实验将用AT1-AA刺激培养的大鼠动脉内皮细胞,检测ICAM-1的合成和释放是否增加。有研究显示,AngII与AT1R结合后是通过MAPK、JAK/STAT等信号转导通路实现生物学功能,特别是在内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增殖和动脉粥样硬化的形成方面发挥作用。我们推测AT1-AA可能是通过与这些细胞表面的配体（AT1R）结合,转导细胞内信号。本实验将研究MAPKs信号转导通路在AT1-AA介导内皮细胞功能变化中的作用。对AT1-AA进行研究必须获得一定数量的AT1-AA,并对其进行检测和鉴定。我们拟用大鼠AT1R多肽免疫大鼠,观察是否可诱导产生AT1-AA;将AT1-AA注射到肾移植大鼠,观察是否引发排斥反应,探讨AT1-AA对肾血管内皮细胞的信号转导途径,然后选用可能的阻断方法。通过上述研究,阐明同种AT1-AA确可介导早期体液性排斥反应、缺血再灌注损伤的移植肾内皮细胞为抗体作用的主要靶点、AT1-AA与受体结合后的主要信号转导通路。本课题对于揭示AT1-AA介导体液性排斥反应的发生、作用机理具有重要意义,为临床监测和治疗这一特殊类型排斥反应提供理论依据。主要研究内容:1.本研究拟用大鼠源性AT1R多肽片段偶联血蓝蛋白制备抗原并免疫大鼠,监测免疫的大鼠体内是否产生AT1-AA,如有AT1-AA生成则对其进行分离、纯化和鉴定,并观察其对自身组织有无病理性损伤。2.采用制备的大鼠源性AT1-AA注射到肾移植受体大鼠,观察受体大鼠是否发生急性血管性排斥反应,并重点观察血管内皮细胞有无损伤;给予口服氯沙坦有无保护作用。3.在体外实验中观察AT1-AA对培养的内皮细胞的作用,监测内皮细胞受到AT1-AA刺激后ICAM-1的表达变化。研究AT1-AA诱导内皮细胞ICAM-1表达的信号通路,探讨AT1-AA介导内皮细胞ICAM-1变化的分子机制。使用氯沙坦阻断对信号转导通路及ICAM-1合成有无影响,探讨氯沙坦是否可作为临床预防和治疗AT1-AA所致排斥反应的措施。主要实验方法和结果:1.大鼠源性AT1R多肽偶联血蓝蛋白制备免疫原对大鼠进行免疫,第二次加强免疫后大鼠血清AT1-AA可疑阳性,第三次加强免疫后AT1-AA血清阳性率90 %,第四次加强免疫后,免疫组AT1-AA阳性率100 %,其中AT1-AA滴度在第13周达到高峰。使用protein G-sephrose 4B亲合层析纯化AT1-AA,所得到的抗体进行生物学鉴定,可以使培养的心肌细胞搏动速度加快。光镜及电镜未观察到明显的心脏、肾脏和肝脏病理改变。2.成功建立了大鼠肾移植模型,SD大鼠的MHC个体差异很小,组织相容性很好,移植肾病理改变轻微,术后第7天活检按Banff’97在ⅠA以下,肾小管、肾小球、微血管的损害很轻,可作为急性排斥反应的对照。3.肾移植大鼠注射AT1-AA,发生急性血管性排斥反应,光镜下表现为单核细胞、淋巴细胞浸润累及微血管,形成动脉内膜炎,肾小球毛细血管炎症细胞浸润,但未见透壁性纤维素样动脉内膜炎;电镜下显示内皮细胞肿胀,破裂形成碎片向管腔内突出、脱落,内皮细胞间间隙增宽,连接不完整;血管周围水肿,管腔内炎症细胞较多并向管腔外游出。肾移植大鼠注射AT1-AA的同时给予氯沙坦口服具有明显的保护作用,移植肾功能得到保护,移植肾损伤明显减轻。4.采用组织块移植法进行大鼠主动脉内皮细胞原代培养,并对培养的内皮细胞进行纯化和传代培养,经免疫荧光测定,其标志物vWF表达阳性,纯度高,可满足实验需求。5.用不同浓度的AT1-AA（1:200,1:100,1:50）刺激内皮细胞,在刺激后不同时间分别检测ICAM-1蛋白表达。结果显示,内皮细胞经AT1-AA作用后,ICAM-1水平在0-24h内随作用时间的延长逐渐升高,至24h时,ICAM-1水平达到最高,36h开始下降。不同浓度的AT1-AA所导致的ICAM-1水平升高程度有所不同,浓度越高,对内皮细胞内合成ICAM-1的影响越大,其中以稀释度为1:50的AT1-AA对其影响最大。6.使用制备的AT1-AA刺激培养的内皮细胞,在不同的时间点检测ERK1/2、p38MAPK和JNK/SAPK的水平。结果发现,AT1-AA能够激活ERK1/2和p38MAPK,在20分钟左右活化作用最强,随着时间的延长,ERK1/2、p38MAPK水平逐渐下降;AT1-AA对JNK/SAPK无明显活化作用。7.使用不同浓度的PD98059（30μM、60μM）和氯沙坦（10-6mol/L、10-5mol/L）可明显抑制ERK1/2活性,其中60μM PD98059和10-5mol/L氯沙坦对ERK的抑制最为显着。在p38MAPK通路的实验中显示不同浓度的SB203580（20μM、40μM）和氯沙坦（10-6mol/L、10-5mol/L）也在不同程度上抑制p38MAPK的激活,其中40μM SB203580和10-5mol/L氯沙坦效果较为明显。8.分别使用SB203580、PD98059和氯沙坦对内皮细胞进行预处理,在加入AT1-AA后24h收集内皮细胞检测ICAM-1的合成情况,结果发现氯沙坦和SB203580联合对内皮细胞预处理对ICAM-1的升高抑制最为显着,可以抑制约97%,单独加入PD98059或单独加入氯沙坦对AT1-AA引起的ICAM-1升高的抑制相对较低,分别为40%和55%。结论:1.大鼠源性AT1R多肽能够诱导大鼠产生AT1R自身抗体,此抗体对自身组织的损伤作用不明显。本实验证实了大鼠源性AT1-AA的存在,并成功的对抗体进行分离、纯化,为进一步研究其在器官移植中的作用提供了实验基础。2.采用制备的大鼠源性AT1-AA注射到肾移植受体大鼠,观察发现受体大鼠发生急性血管性排斥反应,光镜和电镜显示移植肾血管内皮细胞有明显损伤。3. AT1-AA可引起部分难治性血管性排斥反应,推测其可能机制是与内皮细胞表面AT1R结合后启动细胞内信号转导通路,造成内皮功能紊乱,表现之一是合成并分泌ICAM-1,进而导致白细胞浸润并进一步破坏内皮细胞结构和功能,形成恶性循环,最终导致移植物失功。使用AT1R阻断剂（如氯沙坦）可以减轻这种排斥反应,对移植肾有益,提示临床移植前后需要检测受体AT1-AA水平,特别是既往妊高症或恶性高血压患者,治疗AT1-AA引起的排斥反应可以早期使用ARBs。4.用AT1-AA刺激培养的大鼠动脉内皮细胞,可以诱导ICAM-1的合成和释放增加,AT1-AA可以活化ERK1/2、p38MAPK,使用ERK1/2通路阻断剂PD98059、p38MAPK通路阻断剂SB203580和氯沙坦能抑制ICAM-1的合成。提示我们预防和治疗AT1-AA介导排斥反应的手段可以考虑使用ARBs、ERK/p38MAPK通路阻断剂以及ICAM-1与LFA-1结合位点阻断,其作用点各不相同,我们把它们分别称为受体结合阶段、信号转导阶段和效应分子阶段,为将来AT1-AA的治疗提供重要理论参考。

张丽^[10]（2008）在《活体肾移植急性排斥反应影响因素分析》文中认为目的探讨活体肾移植术后发生急性排斥反应的影响因素,寻找评估活体肾移植风险的指标。方法通过1980-2007年香港玛嘉烈医院赛马会泌尿肾病中心142例活体肾移植手术的患者进行分析,采集可能影响肾移植术后发生急性排斥反应的各项资料,根据移植后的临床表现、实验室检查、对出现肾移植急性排斥反应临床表现的患者进行移植肾穿刺活检病理诊断,分为移植肾急性排斥组和非急性排斥组。分析142例活体肾移植的受体年龄、性别、受/供体性别组合、HLA错配、亲缘关系、受体原发病,输血次数、术前透析类型及时间、免疫抑制剂用药方案与术后急性排斥反应的关系。结果单因素分析分析各种影响肾移植术后发生急性排斥反应的因素和急性排斥反应的关系,结果显示输血次数（W=687 ,P=0.00）、免疫抑制剂方案（χ2=11.2 ,P=0.04）、亲缘关系（χ2=11.2 P=0.02）引发术后急性排斥反应的差异有显着性。受体年龄（χ2=0.89 ,P=0.87）、性别（χ2=1.28 ,P=0.26）、受/供体性别组合（χ2=4.06,P=0.26）、HLA-A错配（W =2501.50,P=0.90）HLA-B错配（W =4700.00 ,P=0.10）HLA-DR错配（W =4957.5 ,P=0.88）HLA总体错配（W =4834.50 ,P=0.88）、受体原发病（χ2=7.04 ,P=0.28）、术前透析类型（χ2=0.29 ,P=0.33）、术前透析时间（χ2=11.2 ,P=0.04）对引发急性排斥反应的差异无显着性。结论输血次数增多是发生急性排斥反应的影响因素;亲缘关系影响移植肾急性排斥反应的发生率,亲子之间供肾使肾移植术后急性排斥反应发生率增加,而同胞之间活体肾移植术后急性排斥反应发生率较低;免疫抑制剂方案是移植肾急性排斥反应发生的影响因素,活体肾移植术后用环孢素A的各治疗组急性排斥反应的发生率小于无环孢素A的治疗组,使用环孢素A的治疗组中,泼尼松、环孢素A、麦考酚酸酯联合用药急性排斥反应发生率较低。

二、粘附分子与肾移植急性排斥反应（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、粘附分子与肾移植急性排斥反应（论文提纲范文）

（1）关于抗T淋巴细胞球蛋白-Fresenius作为诱导剂在公民逝世器官捐献肾移植中功效的队列研究（论文提纲范文）

（2）心脏移植急性排斥反应淋巴细胞-微泡复合物超声分子成像实验研究（论文提纲范文）

（3）沙利度胺对大鼠肾移植模型慢性排斥反应的保护作用及机制研究（论文提纲范文）

（4）大鼠同种异体肾移植前期急性排斥反应模型的建立及其预警标记物的筛选（论文提纲范文）

（5）细胞间粘附分子-1（ICAM-1）靶向超声分子成像评价大鼠移植肾急性排斥反应（论文提纲范文）

（6）Fcgr3B基因拷贝数多态性与肾移植术后急性排斥反应相关性的研究及其机制的初步探讨（论文提纲范文）

（7）大鼠肾移植急性排斥反应模型中移植肾CD44的表达及意义（论文提纲范文）

（8）CD44分子与同种异体肾移植急性排斥反应的研究（论文提纲范文）

（9）AT1R自身抗体介导血管性排斥反应的作用机制研究（论文提纲范文）

（10）活体肾移植急性排斥反应影响因素分析（论文提纲范文）

四、粘附分子与肾移植急性排斥反应（论文参考文献）

• [1]关于抗T淋巴细胞球蛋白-Fresenius作为诱导剂在公民逝世器官捐献肾移植中功效的队列研究[D]. 柴云霞. 青岛大学, 2020(01)
• [2]心脏移植急性排斥反应淋巴细胞-微泡复合物超声分子成像实验研究[D]. 谢宇. 华中科技大学, 2019(01)
• [3]沙利度胺对大鼠肾移植模型慢性排斥反应的保护作用及机制研究[D]. 张岩. 山东大学, 2019(02)
• [4]大鼠同种异体肾移植前期急性排斥反应模型的建立及其预警标记物的筛选[D]. 叶东明. 南方医科大学, 2014(01)
• [5]细胞间粘附分子-1（ICAM-1）靶向超声分子成像评价大鼠移植肾急性排斥反应[D]. 吴凤林. 南方医科大学, 2011(04)
• [6]Fcgr3B基因拷贝数多态性与肾移植术后急性排斥反应相关性的研究及其机制的初步探讨[D]. 杨浩. 浙江大学, 2011(12)
• [7]大鼠肾移植急性排斥反应模型中移植肾CD44的表达及意义[D]. 都兴华. 暨南大学, 2010(10)
• [8]CD44分子与同种异体肾移植急性排斥反应的研究[D]. 杨伟锋. 南方医科大学, 2010(12)
• [9]AT1R自身抗体介导血管性排斥反应的作用机制研究[D]. 卢彩宝. 第三军医大学, 2008(06)
• [10]活体肾移植急性排斥反应影响因素分析[D]. 张丽. 新疆医科大学, 2008(02)

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